复合菌剂对土霉素菌渣好氧堆肥腐熟及微生物群落结构影响

陈赛男, 钟为章, 牛建瑞, 秦学, 宁志芳, 李月. 复合菌剂对土霉素菌渣好氧堆肥腐熟及微生物群落结构影响[J]. 环境工程学报, 2022, 16(8): 2672-2681. doi: 10.12030/j.cjee.202203122
引用本文: 陈赛男, 钟为章, 牛建瑞, 秦学, 宁志芳, 李月. 复合菌剂对土霉素菌渣好氧堆肥腐熟及微生物群落结构影响[J]. 环境工程学报, 2022, 16(8): 2672-2681. doi: 10.12030/j.cjee.202203122
CHEN Sainan, ZHONG Weizhang, NIU Jianrui, QIN Xue, NING Zhifang, LI Yue. Effect of compound bacterial agent on maturity and microbial community structure of oxytetracycline residue aerobic composting[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(8): 2672-2681. doi: 10.12030/j.cjee.202203122
Citation: CHEN Sainan, ZHONG Weizhang, NIU Jianrui, QIN Xue, NING Zhifang, LI Yue. Effect of compound bacterial agent on maturity and microbial community structure of oxytetracycline residue aerobic composting[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(8): 2672-2681. doi: 10.12030/j.cjee.202203122

复合菌剂对土霉素菌渣好氧堆肥腐熟及微生物群落结构影响

    作者简介: 陈赛男(1998—),女,硕士研究生,664002871@qq.com
    通讯作者: 钟为章(1983—),男,博士,副教授,zhongweizhang@aliyun.com
  • 基金项目:
    国家自然科学基金青年科学基金资助项目(51708170);河北省自然科学基金资助项目(B2021208067)
  • 中图分类号: X787

Effect of compound bacterial agent on maturity and microbial community structure of oxytetracycline residue aerobic composting

    Corresponding author: ZHONG Weizhang, zhongweizhang@aliyun.com
  • 摘要: 针对抗生素菌渣中抗生素残留难处理的问题,采用好氧堆肥法将其制成有机肥料,以实现其无害化处理及资源化利用。通过将复合菌剂添加到好氧堆肥体系中,研究其对堆体理化性质、肥效、毒性和微生物群落的影响。结果表明,添加复合菌剂最高温度可达70.55 ℃,比对照组高温期延长了5 d,减少了氮源流失,有机质降解率提高了5.56%,土霉素降解率高达98.86%,使堆肥产品达到安全水平。此外,复合菌剂提高了堆肥中放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度,与堆体升温正相关的嗜热菌属(Thermophilic bacteria genera)丰度显著增加(P<0.01),而致病细菌相对丰度下降。细菌群落相关性分析结果表明,接种菌剂既增加了微生物活性,降低了细菌群落的复杂度,又为优化建立新的和更加健康的堆肥细菌群落奠定了基础。本研究可为抗生素降解菌渣在堆肥中的应用提供参考。
  • 我国是抗生素生产和使用大国,抗生素产量约占全球总产量的20%~30%[1]。与此同时,会产生大量的抗生素菌渣,据统计,我国每年菌渣总产量高达2×106 t[2]。此外,新鲜的菌渣含水率高达90%以上,极易腐败发臭,其中残留的抗生素会造成水土环境的污染,加剧细菌耐药性,危害人群健康[3-4]

    目前,抗生素菌渣的处理处置技术主要包括焚烧、填埋和堆肥等[5]。2021年新版《国家危险废物名录》[6]禁止将菌渣作为肥料和饲料的添加剂。因此,寻找适合的菌渣处理处置方法是亟待解决的问题。厌氧消化是一种可将高有机质废弃物资源化利用的处理方式。经过厌氧消化后的沼渣不再具有生物毒性,可进一步被处理加工成高品质的肥料。因此,菌渣的厌氧消化处理更能实现其减量化、资源化和无害化[7-8]。含固率(TS)对系统内pH、挥发性脂肪酸(VFAs)、氨氮、微生物群落结构及抗生素抗性基因都有一定的影响[9-10],是厌氧消化的重要影响因素。PELLERA等[11]研究表明,不同底物的TS对厌氧发酵进程有较大影响。近年来,针对TS对污泥、粪便、秸秆以及厨余垃圾厌氧消化影响的研究已相对广泛[12-13],但针对TS对抗生素菌渣厌氧消化影响的研究相对较少。

    邹书娟等[14]的研究表明,菌渣中挥发分含量较高,主要以C、O、N和H为主,含有蛋白质和糖类等化合物。土霉素具有广谱性,在医疗和动物养殖方面均有较为广泛的应用[15],故本研究以土霉素菌渣为研究对象。研究TS对土霉素菌渣厌氧消化系统稳定性以及残留抗生素去除的影响,并对最佳TS下系统优势菌群进行分析。以期为抗生素菌渣的减量化、资源化和无害化处理提供参考。

    厌氧接种污泥取自河北省石家庄某制药废水处理厂的厌氧反应器,对其进行为期20 d的活化培养,然后加入实验所用的土霉素菌渣进行10 d左右的驯化。土霉素菌渣取自河北省石家庄市某制药厂。将高压板框压滤之后的土霉素菌渣经过破碎机粉碎过100目的筛子后备用。厌氧污泥及土霉素菌渣初始理化性质见表1

    表 1  厌氧污泥及土霉素菌渣初始理化性质
    Table 1.  Initial physical and chemical property of anaerobic sludge and oxytetracycline residue
    供试样品pHTSVSSCOD/(mg·L−1)氨氮/(mg·L−1)土霉素残留/(mg·kg−1)
    厌氧污泥6.4~7.22.65%1.12%2.33
    土霉素菌渣2.3-2.846.5%36.75%787.6721.032 106.47
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    实验设置5组不同的含固率(4%、8%、12%、16%和20%),每组设置3个平行。实验装置为自动甲烷潜力测试系统(Automatic Methane Potential Test System),该系统包括3个部分,厌氧消化发生单元、CO2吸收单元以及气体测量设备。厌氧消化发生单元包括15个厌氧反应器,每个反应器容积为500 mL,设置有效容积为400 mL。在每个反应器内加入240 mL经过培养驯化的污泥,根据设置好的TS加入相应体积的土霉素菌渣和蒸馏水,以加入相同体积接种物的反应作为空白处理(CK)。用0.1 mol·L−1的NaOH和HCl将初始消化液的pH调节至6.8~7.2。实验开始前充入2~3 min的氮气以排出反应装置中的空气,所有反应器的温度均控制在(35±1) ℃。每2 d取其上清液,用作理化性质的检测,直到反应结束,另取结束后的样品,对其中残留土霉素的质量浓度进行检测。

    菌渣的TS和VS采用重量法测定;pH采用自动电位滴定仪测定(PHS-2F,上海仪电科学仪器股份有限公司);产气量由产甲烷潜力测试系统记录(AMPTSⅠ,北京碧普华瑞环境技术有限公司)(实际产气量扣除空白组的产气量)。将所有样品高速离心(8 000 r·min−1、10 min),取上清液过0.25 μm滤膜,对所得滤液进行氨氮、化学需氧量(COD)和VFAs的测定。氨氮采用纳氏试剂法,紫外分光光度计测定(UV-5100,上海元析仪器有限公司);SCOD和TCOD采用重铬酸钾法,快速消解分光光度计测定(5B-3B(V8),北京连华永兴科技发展有限公司);VFAs采用气相色谱法测定(GC7900/氢火焰检测器,上海天美科学仪器有限公司);土霉素残留采用液相色谱法测定(LCMS8050,日本岛津公司)。

    产气情况反映系统内微生物对有机物的利用情况以及厌氧消化的进程,是衡量厌氧消化系统性能的关键因素之一[16]。不同TS下累积产气量和日产气量变化规律见图1

    图 1  不同TS厌氧消化系统内累积产气量和日产气量变化
    Figure 1.  Variation curves of cumulative gas production and daily gas production in anaerobic digestion systems with different TS

    图1(a)可看出,当TS为8%时,累计产气量最大。但单位VS产气量(以每gVS计)分别为101.87、78.56、40.22、29.81和26.36 mL·g−1,产气效率随TS的增加而降低,这与杨祎楠等[17]的研究结果相似。尽管当TS为8%时累积产气量最大,但其有机物的利用率较TS为4%时降低了22.3%。

    图1(b)可以看出,反应开始时,日产气量迅速增加,在4 d之内达到第1个产气高峰,经过一段时间的产气迟滞后,逐渐上升达到第2个产气峰值。这可能是因为,在反应前期有机物的含量较高,反应开始前系统的pH设定为厌氧微生物适宜生存的范围,微生物代谢速率快。刘中军等[18]的研究表明,微生物在活性较高的情况下会加快水解酸化的进程。在产甲烷的同时,CO2和H2等非甲烷气体的产量也随之增加,故导致反应前期日产气量达到峰值。随着反应的进行,可能由于VFAs的积累、氨氮抑制以及残留抗生素的毒害作用等原因,使产甲烷菌的活性受到了不同程度的抑制,故导致TS分别为8%、12%、16%和20%的反应组均出现了较长的产气迟滞,且TS越大迟滞期越长。5个TS下的第2个产气高峰出现的时间分别为第10、28、36、42和46 d,峰值随TS的增加而增大。王乐乐等[19]的研究表明,高TS的反应由于发酵液黏度高,气­固­液传质过程受阻碍,在发酵后期仍保持较高的甲烷产量,这与本研究结果相似。

    尽管高TS的反应体系在发酵后期仍具有较高的产气潜力,但其存在产气迟滞的现象,且随TS的增加迟滞期越长。因此,综合考虑产气效率、有机物利用效率以及发酵周期等因素,在有限的时间内,TS大于8%时产气优势无太大差别。

    厌氧消化处理是依靠系统内的产酸菌和产甲烷菌共同作用的结果,微生物的生长与环境条件的关系非常密切。在消化过程中,水解酸化菌分解有机物生成大量的VFAs。同时,含氮大分子逐渐分解,产生大量的氨氮[20]。体系内稳定的环境是依靠消化过程中产生的弱酸、弱碱共同作用的结果。因此,pH、氨氮以及VFAs的变化是考察系统稳定性的重要因素[21],其在不同TS下的变化见图2图3

    图 2  不同TS厌氧消化系统内pH和氨氮的变化
    Figure 2.  Changes of pH value and ammonia nitrogen in anaerobic digestion system of different TS
    图 3  不同TS厌氧消化系统内VFAs的变化
    Figure 3.  Changes of VFAs in different TS anaerobic digestion systems

    图2(a)为pH的变化,5组反应体系初始pH均设置在6.8~7.2之间。随着反应的进行,pH开始下降,在6.0~6.5范围内维持一段时间后开始回升,最后稳定在6.7~7.7之间。但值得注意的是,TS为4%和8%的2组反应分别在第2 d和第4 d出现最低值后迅速上升,而其他3组反应随着TS的增加,在低pH范围内维持的时间变长。产生这一现象的原因可能是,在反应前期,水解酸化菌分解有机物,生成大量的有机酸,故导致pH下降。而大多数产甲烷菌适宜的pH为6.8~7.2,在较低pH下其活性不高,代谢速率缓慢,使得VFAs大量积累[22]。但由于菌渣中含氮大分子逐渐分解,产生大量的氨氮,为体系内提供部分碱度,与产生的酸共同作用,使pH逐渐回升,厌氧消化系统也逐渐趋于稳定[23]

    研究表明,当系统内产生氨氮浓度过高时,反而会对厌氧消化系统产生抑制作用。由图2(b)可以看出,5组反应的氨氮浓度在短时间内都迅速上升。各组反应的最大氨氮浓度随着TS的增加而增加,分别为734.07、2202.69、2915.22、4178.25和4559.77 mL·g−1。JIANG等[24]的研究表明,当氨氮浓度大于3 000 mg·L−1时,会使50%的产甲烷菌失去活性;徐颂等[23]的研究表明,当氨氮浓度大于1 000 mg·L−1时,产甲烷过程就受到了抑制。根据图1(b)中产气特征可发现,TS为12%的反应氨氮浓度整体水平在2 000~3 000 mg·L−1。此时系统由于产生了抑制作用,故导致产气迟滞期相对较长。这与JIANG等[24]和徐颂等[23]的研究中氨氮抑制的限值不同。产生这一现象的原因可能是,氨氮抑制限值受底物的影响较大,菌渣和粪便等物质氮含量较高,在进行厌氧消化时更易受到氨氮的抑制作用。

    厌氧消化过程中有机物水解产生的VFAs是产甲烷菌的主要碳源。由图3可知,VFAs浓度随着TS的增加而增加。TS为4%和8%的2组反应在初期VFAs的浓度达到最大值,而其他3组反应VFAs在反应前期大量积累,当反应进行到20 d左右时才达到峰值。这与图1(b)中出现的产气迟滞现象以及图2(a)中低pH维持的时间相对应。VFAs的这一变化可能是由于,在反应前期,水解酸化菌分解有机物生成大量有机酸,但由于该阶段氨氮的积累、pH的下降,造成产甲烷菌的数量不多且活性不高,产气出现迟滞现象,故导致VFAs的消耗速率小于其水解生成速率,使其大量积累[25]。随着反应的进行,系统逐渐恢复相对的稳定,产甲烷菌的活性也逐渐恢复,VFAs的消耗速率大于其水解速率,浓度逐渐降低。由产气特征和pH变化可发现,当TS大于8%、VFAs的浓度大于4 000 mg·L−1时,会对厌氧消化系统产生抑制作用。

    综上所述,土霉素菌渣厌氧消化系统中氨氮浓度和VFAs的限制分别为2 000和4 000 mg·L−1,这与孟晓山等[26]的研究结果相似。这说明,在土霉素厌氧消化体系内,当TS大于8%时,系统稳定性较差,开始产生抑制作用。而且,VFAs和氨氮的浓度随TS的增加不断增加,抑制作用不断增强。

    不同TS下系统内SCOD和反应前后TCOD的变化以及TCOD的去除率见图4。从图4(a)中可以看出,随着反应的进行,体系内SCOD逐渐升高。TS为4%、8%和12%的3组反应进行到22 d左右时,体系内SCOD达到最大,然后呈下降趋势后趋于稳定。而TS为16%和20%的2组反应体系内SCOD出现2个峰值,在第2个峰值出现后,SCOD一直呈下降趋势。这说明,在发酵后期,TS大的反应仍具有良好的产气性能,但由于系统内出现了明显的抑制现象,造成了产气迟滞,所以有机物利用效率并不高。

    图 4  不同TS厌氧消化系统内SCOD和TCOD的变化
    Figure 4.  Changes of SCOD and TCOD in different TS anaerobic digestion systems

    初始反应体系内的有机物包括2种形式,一种是溶解性的有机物,可以被产酸菌直接利用;另一种是不溶性的有机物,这部分有机物首先要经过水解菌的作用逐渐水解为可溶性的有机物才能进一步被酸化菌利用进而产生VFAs[21]。周富春[27]的研究表明,水解酸化阶段产生的VFAs使消化体系pH较低,导致产甲烷菌的活性不高,有机物水解的速率大于消耗速率,造成可溶性有机物的积累,SCOD逐渐升高。随着系统的逐渐稳定,产甲烷菌活性恢复,有机物的消耗速率大于水解速率,SCOD开始逐渐下降最终达到平稳,与上述pH的变化及产气迟滞现象相对应。

    此外,TCOD的去除率可以体现底物在厌氧消化系统内降解的情况。由图4(b)可知,5组反应中TCOD的去除率分别为90.03%、79.72%、63.15%、56.69%和51.13%,随TS的增加而降低。张涛[28]、高妍[29]的研究表明,COD的去除率随着负荷的升高而降低,而TS的增加意味着反应体系负荷也随之增加,导致TCOD的去除率逐渐降低。

    抗生素菌渣危害性主要包括2方面:一是其有机物含量高;另一方面主要是含有大量残留的抗生素,其进入到环境中会导致微生物产生耐药性,进而威胁到人群健康[4]。土霉素是一种典型的生物抑制药物,当其质量浓度过高时会对厌氧消化系统产生中度甚至重度的抑制作用[30-31]。经检测,土霉素菌渣中残留的土霉素为2 106.47 mg·kg−1。5组反应前后系统内土霉素的质量浓度及其去除效率见表2

    表 2  不同含固率下厌氧消化系统土霉素残留及其去除率变化
    Table 2.  Residual oxytetracycline content and its removal rate in anaerobic digestion system with different solid content
    含固率初始土霉素的质量浓度/(mg·L−1)结束后土霉素的质量浓度/(mg·L−1)去除率
    4%110.5611.2289.85%
    8%219.7737.1087.29%
    12%472.50123.4573.87%
    16%654.39131.4579.91%
    20%835.38269.2167.78%
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    表2可以看出,随着TS的增大,系统内土霉素的质量浓度也相应增加。经过厌氧消化反应后,TS为4%和8%的反应残留土霉素分别降低了89.85%和87.29%,而另外3组反应残留土霉素的去除率均小于80%。对比5组实验的产气特征、产气效率以及有机物去除效率可知,残留的土霉素对厌氧菌有毒害作用,会抑制厌氧菌的活性,从而导致系统产气效率和有机物的去除效率降低,会出现产气迟滞现象。而且,随着土霉素质量浓度的增加,这些现象愈发明显,这一结果与朱晓磊[32]和SHI等[33]的研究结果一致。综合考虑5组反应过程中系统内各指标的变化发现,当系统含固率为4%和8%时,土霉素对系统的毒害作用较小,系统也比较稳定。而且,残留土霉素的去除率可达85%以上,可基本实现土霉素菌渣的资源化利用和无害化处理。

    综合比较VS产气效率、有机物降解率以及残留土霉素去除率可知,TS为4%的反应在各方面均优于其他组,故对其体系内微生物群落结构进行了分析,结果如图5所示。

    图 5  TS为4%时体系内微生物群落结构
    Figure 5.  The microbial community structure in TS 4% system

    系统内微生物主要包括水解酸化细菌和产甲烷古菌,细菌在微生物中所占的比例要远高于古菌[34]。由图5(a)可知,在反应初始阶段,细菌和古菌在微生物中所占比例分别为90.32%和5.53%。细菌中的优势微生物在门水平上主要包括放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi),其相对丰度分别为59.74%、13.34%、4.64%和4.14%。古菌中的优势微生物在门、纲、目、科水平上分别为广古菌门(Euryarchaeota)、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)下的甲烷鬓菌科(Methanosaetaceae)和甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae)。其相对丰度分别为5.46%、5.35%、5.03%、3.89%和1.11%。在反应结束阶段,古菌所占比例有所提高,如图5(b)所示,其丰度达到17.98%。而且,与反应初始阶段相比,水解酸化细菌的群落结构分布相对均匀,主要包括Chloroflexi、Proteobacteria、厚壁菌门(Firmicutes)、Actinobacteria和Bacteroidetes,其相对丰度分别为24.25%、15.94%、11.80%、6.42%和4.60%。在古菌中门、纲、目水平上的优势菌群与反应初始阶段相同,但在科水平上Methanosarcinaceae的相对丰度要大于Methanosaetaceae,达到15.47%。

    研究表明,Actinobacteria、Proteobacteria和Chloroflexi都可水解有机物,并且均以乙酸为主要产物。Actinobacteria的部分菌属还可以产生丙酸;Proteobacteria可利用的物质包括葡萄糖、丙酸盐、丁酸盐等小分子化合物等[35-36];Chloroflexi对单糖和多糖都具有降解能力,还可以分解由Bacteroidetes、Proteobacteria和Firmicutes水解产生的葡萄糖和可溶性小分子有机物,产生乙酸和氢气[37]。在产甲烷古菌中Methanosarcinales可利用的底物较广泛,能将乙酸、甲醇、三甲胺和CO2等物质转化成CH4[38],但Methanosaetaceae中的甲烷鬃菌属(Methanosaeta)是目前已知的唯一以乙酸为底物的产甲烷菌属[39]。因此,可推测土霉素菌渣的厌氧发酵以乙酸型发酵为主。

    1)当TS大于8%时,氨氮浓度大于2 000 mg·L−1、VFAs大于4 000 mg·L−1,对厌氧消化系统产生了抑制作用。此外加上土霉素对微生物的毒害作用,导致系统出现产气迟滞现象。VS产气效率、有机物去除效率和残留土霉素的去除效率均随TS的增加而降低。因此,在有限的时间内TS大于10%并不利于菌渣的厌氧消化。

    2) TS为4%和8%的反应在系统的稳定性、有机物降解率和残留土霉素的去除效率方面有良好的效果,但TS为8%的反应有机物利用效率比4%的反应降低了22.3%。因此,TS为4%的反应在各方面均优于其他组,更能实现菌渣的减量化、资源化和无害化处理。

    3)最佳反应体系内水解酸化的优势菌群包括Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Firmicutes,产甲烷菌的优势菌群主要包括Methanosarcinaceae和Methanosaetaceae,土霉素菌渣的厌氧发酵以乙酸型发酵为主。

  • 图 1  堆肥过程中理化性质

    Figure 1.  Changes of physical and chemical properties during composting

    图 2  堆肥期间的种子发芽率指数(GI)

    Figure 2.  Seed germination rate index during composting

    图 3  堆肥过程中温度变化和土霉素降解及ln(C/C0)与时间之间的关系

    Figure 3.  The relationship between temperature change and oxytetracycline degradation, ln(C/C0) and time in composting

    图 4  细菌群落组成在门水平和属水平的相对丰度

    Figure 4.  Relative abundance of bacterial community composition at phylum and genus levels

    图 5  环境因子和细菌群落之间关系的冗余分析

    Figure 5.  Redundancy analysis of the relationship between environmental factors and bacterial community

    表 1  堆肥原料基本理化性质

    Table 1.  Basic physical and chemical property of compost raw materials

    供试样品含水率/%pH电导率EC/(mS·cm−1)C/N
    玉米秸秆9.895.322.6750.89
    土霉素菌渣78.044.475.73
    供试样品含水率/%pH电导率EC/(mS·cm−1)C/N
    玉米秸秆9.895.322.6750.89
    土霉素菌渣78.044.475.73
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    表 2  堆肥成品指标

    Table 2.  Composting product index

    对照指标本实验检测值NY/T 525-2021指标值[22]
    有机质的质量分数(以烘干基计)57.3%~58.1%≥30%
    总养分(N+P2O5+K2O)的质量分数(以烘干基计)5.7%~6.7%≥4.0%
    水分(鲜样)的质量分数41.08%~43.04%≤30%
    种子发芽率指数(GI)99.8%~107.3%≥70%
    机械杂质的质量分数<0.3%≤0.5%
    对照指标本实验检测值NY/T 525-2021指标值[22]
    有机质的质量分数(以烘干基计)57.3%~58.1%≥30%
    总养分(N+P2O5+K2O)的质量分数(以烘干基计)5.7%~6.7%≥4.0%
    水分(鲜样)的质量分数41.08%~43.04%≤30%
    种子发芽率指数(GI)99.8%~107.3%≥70%
    机械杂质的质量分数<0.3%≤0.5%
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    表 3  土霉素降解的线性拟合方程、半衰期和R2

    Table 3.  Linear fitting equation for oxytetracycline degradation, half-life, and R2

    组别方程斜率R2半衰期数据来源
    CKln(C/C0)=−0.051x−0.632−0.0510.98613.59本研究
    Cln(C/C0)=−0.158x−0.544−0.1580.9414.38本研究
    红霉素ln(C/C0)=−0.500x−0.604−0.5000.8011.40[26]
    多环西素ln(C/C0)=−0.183x−0.638−0.1830.7653.80[26]
    诺氟沙星ln(C/C0)=−0.328x−0.689−0.3280.8942.10[26]
    青霉素ln(C/C0)=−0.798x−0.697−0.7980.9621.72[30]
    庆大霉素ln(C/C0)=−0.116x−0.087−0.1160.9856.70[31]
    组别方程斜率R2半衰期数据来源
    CKln(C/C0)=−0.051x−0.632−0.0510.98613.59本研究
    Cln(C/C0)=−0.158x−0.544−0.1580.9414.38本研究
    红霉素ln(C/C0)=−0.500x−0.604−0.5000.8011.40[26]
    多环西素ln(C/C0)=−0.183x−0.638−0.1830.7653.80[26]
    诺氟沙星ln(C/C0)=−0.328x−0.689−0.3280.8942.10[26]
    青霉素ln(C/C0)=−0.798x−0.697−0.7980.9621.72[30]
    庆大霉素ln(C/C0)=−0.116x−0.087−0.1160.9856.70[31]
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-03-18
  • 录用日期:  2022-05-23
  • 刊出日期:  2022-08-31
陈赛男, 钟为章, 牛建瑞, 秦学, 宁志芳, 李月. 复合菌剂对土霉素菌渣好氧堆肥腐熟及微生物群落结构影响[J]. 环境工程学报, 2022, 16(8): 2672-2681. doi: 10.12030/j.cjee.202203122
引用本文: 陈赛男, 钟为章, 牛建瑞, 秦学, 宁志芳, 李月. 复合菌剂对土霉素菌渣好氧堆肥腐熟及微生物群落结构影响[J]. 环境工程学报, 2022, 16(8): 2672-2681. doi: 10.12030/j.cjee.202203122
CHEN Sainan, ZHONG Weizhang, NIU Jianrui, QIN Xue, NING Zhifang, LI Yue. Effect of compound bacterial agent on maturity and microbial community structure of oxytetracycline residue aerobic composting[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(8): 2672-2681. doi: 10.12030/j.cjee.202203122
Citation: CHEN Sainan, ZHONG Weizhang, NIU Jianrui, QIN Xue, NING Zhifang, LI Yue. Effect of compound bacterial agent on maturity and microbial community structure of oxytetracycline residue aerobic composting[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(8): 2672-2681. doi: 10.12030/j.cjee.202203122

复合菌剂对土霉素菌渣好氧堆肥腐熟及微生物群落结构影响

    通讯作者: 钟为章(1983—),男,博士,副教授,zhongweizhang@aliyun.com
    作者简介: 陈赛男(1998—),女,硕士研究生,664002871@qq.com
  • 1. 河北科技大学环境科学与工程学院,石家庄 050018
  • 2. 河北省污染防治生物技术实验室,石家庄 050018
基金项目:
国家自然科学基金青年科学基金资助项目(51708170);河北省自然科学基金资助项目(B2021208067)

摘要: 针对抗生素菌渣中抗生素残留难处理的问题,采用好氧堆肥法将其制成有机肥料,以实现其无害化处理及资源化利用。通过将复合菌剂添加到好氧堆肥体系中,研究其对堆体理化性质、肥效、毒性和微生物群落的影响。结果表明,添加复合菌剂最高温度可达70.55 ℃,比对照组高温期延长了5 d,减少了氮源流失,有机质降解率提高了5.56%,土霉素降解率高达98.86%,使堆肥产品达到安全水平。此外,复合菌剂提高了堆肥中放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度,与堆体升温正相关的嗜热菌属(Thermophilic bacteria genera)丰度显著增加(P<0.01),而致病细菌相对丰度下降。细菌群落相关性分析结果表明,接种菌剂既增加了微生物活性,降低了细菌群落的复杂度,又为优化建立新的和更加健康的堆肥细菌群落奠定了基础。本研究可为抗生素降解菌渣在堆肥中的应用提供参考。

English Abstract

  • 我国是抗生素生产大国,每年产生的抗生素菌渣量达到1.3×106 t以上[1]。菌渣在自然环境下易腐败变质,任意堆放极易造成环境污染。此外,菌渣不合理处置会导致其中的残留抗生素在环境介质中扩散和传播,从而对人群健康和生态环境造成巨大威胁。而另一方面,菌渣中含有大量的微生物菌丝体及未代谢利用完的有机物,营养物质含量丰富,可对其进行资源化利用。因此,如何将抗生素菌渣无害化处理及资源化利用已成为当今急需解决的难题。

    好氧堆肥被广泛应用于固体有机废物处理,研究表明畜禽粪便或抗生素菌渣中的残留抗生素可以通过好氧堆肥降解[2-3]。菌渣经好氧堆肥后可被制成有机肥料,其不仅可提高土壤肥力,还保证了农产品品质安全[4]。堆肥中的微生物除了参与有机物料的分解外,其也对抗生素降解有重要作用。赵军超[5]发现,红霉素菌渣经好氧堆肥处理后降解率可达99%以上。这表明,好氧堆肥可实现抗生素菌渣无害化处理。

    由于传统好氧堆肥温度不够高,限制了其对抗生素的降解[6]。因此,目前关于应用好氧堆肥法处理抗生素菌渣的研究都是在外源添加物的条件下进行的。一般外源添加物主要分为生物炭、氯化铁、天然沸石和生物菌剂等,而在好氧堆肥处理中添加生物菌剂效果显著[7]。研究发现,在堆肥中添加微生物菌剂,可提高堆肥温度,增加堆肥中微生物的种类和活性,延长高温分解周期,加快堆肥腐殖化进程,提高其中抗生素去除率,降低其环境风险,使堆肥成品达到无害化要求[8-12]

    本研究选取土霉素菌渣为研究对象,探究添加复合菌剂后土霉素菌渣和玉米秸秆混合堆肥的基本理化参数、堆肥中土霉素降解和微生物群落结构变化情况,并优化好氧堆肥对土霉素菌渣中残留土霉素的处理,为抗生素菌渣的无害化处理和资源化利用提供参考。

    • 土霉素菌渣取自石家庄市某制药厂。玉米秸秆取自石家庄周边农户农田中,将其在105 ℃条件下烘干处理后破碎,长度约为1~2 cm。堆肥原料初始基本理化性质如表1所示。

    • 堆肥试验在河北科技大学堆肥实验场进行。堆肥容器容积70 L,底部连接曝气泵以调节气量,并装有气体流量计。装置中连有3个温度探头,对其上、中、下温度进行实时监控。本实验设计分为2组,一组添加自制菌剂A(制备方法见专利:申请号CN 202111337864.9,编号C);另一组不添加菌剂(编号CK)作为对照组。C组为15 kg菌渣+15 kg玉米秸秆+菌剂A(0.3%);CK组为15 kg菌渣+15 kg玉米秸秆。

      通过调节气体流量计,控制曝气速度为7 L·min−1。采样天数设定为第0、4、8、15、22、28、34、38 d,每次取样前进行翻堆,每次取样在罐体的上、中、下3个平面取样,遵循5点取样原则。每次取200 g样品,分为2份保存,一份用真空冷冻干燥机(FD-1A 50,博医康(北京)仪器有限公司)冷冻干燥,然后在20 ℃下保存,用于土霉素质量浓度的测定,另一份在4 ℃下保存用于理化性质分析。

    • 堆肥温度采用自制堆肥装置内PT100温度探头对温度进行实时监测,每天选取0、4、8、12、16、20 h进行数据记录;含水率的测定运用失重法,参照GB/T 1931-2009中检测方法[13];堆肥样品中pH采用雷磁ZD-2自动电位滴定仪测定(PHS-2F,上海仪电科学仪器股份有限公司);EC采用多参数在线测定仪(哈纳HI993302,上海耀壮检测仪器设备有限公司);全碳、全氮、全磷和全钾含量采用流动分析仪测定(AA3,英国希尔公司)。

      种子发芽指数(GI)测定:首先取10 g样品与蒸馏水按比例1∶10放入250 mL锥形瓶中,然后置于150 r·min−1摇床振荡30 min;再取其上清液过滤后吸取5 mL滤液于铺有滤纸的培养皿中,在其中放置20颗白菜种子,置于25 ℃下避光培养48 h后;最后,测定种子的根长,同时用去离子水做空白对照。

      细菌群落结构通过宏全基因组法进行测定。残留土霉素采用高效液相色谱法测定(岛津LCM S8050,色谱柱为C18,1.9 μm×2.1 mm×50 mm;初始流动相为20%乙腈:80%甲酸水),土霉素降解率(D)如式(1)。

      式中:D为土霉素降解率;C0为第0 d堆肥中土霉素质量分数,mg·g−1Cn为第n 天堆肥中土霉素质量分数,mg·g−1

    • 图1为堆肥过程中理化性质变化。含水率是堆肥过程中重要影响因素之一,其变化如图1(a)。C组和CK组的初始含水率分别为66.42%和64.05%。在堆肥初期,2组反应的含水率均小幅上升,然后开始下降。这可能是因为,微生物大量繁殖生长,产生了水分,后由于微生物分解有机质并散发较多热量,使堆体保持较长时间的高温,水分随热量挥发,故经翻堆后堆体含水率明显下降。堆肥结束后C组和CK组的含水率分别下降至41.08%和43.04%,由此表明,添加菌剂有利于堆体水分挥发。

      图1(b)可看出,2组堆体pH变化趋势相似。投加菌剂对堆体pH的影响不大,均出现先上升,再降低,翻堆后又升高的趋势。pH上升可能是由于堆肥前期大量排放的氨气的累积。随后氨气的产生速率小于其随曝气带出堆肥体系中的速率,pH开始下降[14]。堆肥第21 d后进入降温期,堆肥过程中的营养消耗减少,大量N元素以NH3的形式释放,并且在该阶段硝化细菌增多,其进行硝化反应产生大量H+,从而导致堆体的pH有轻微下降[15]

      堆体中铵态氮(NH4+-N)的转化过程如图1(c)所示。C组和CK组在堆肥第2 d后NH4+-N均呈上升状态,第21 d分别达到284.14和347.68 mg·kg−1。这可能是因为,堆体的C/N较低,物料中有机氮源被微生物矿化分解,使硝化反应在高温环境下受阻,导致NH4+-N大量积累[16-17]。此趋势与红霉素和青霉素菌渣堆肥研究中NH4+-N的转化过程相似[5,18]。NH4+-N的浓度达到峰值后开始下降,且C组下降速率大于CK组,最终C组NH4+-N质量浓度略低于CK组。这表明,添加菌剂有利于保留堆体中的氮源。

      EC是反映堆肥中的可溶性盐含量的指标。一般情况下,堆体的EC>4 mS·cm−1,对植物种子发芽有强烈的抑制作用。因此,对堆肥过程中EC的变化过程进行了研究,结果如图1(d)所示。堆体的EC变化趋势为先上升后下降,可能是前期随着物料的消耗,释放出矿物盐和铵根离子而上升。高温期后,有机质降解速率下降,由于CO2和NH3的挥发,导致EC下降,这与以往的研究结果相似[19]。2组堆肥中的EC峰值达到3.0和2.85 mS·cm−1,均未超过其应用限值,故不会对植物种子发芽产生较强的抑制。C组初始EC值高于CK组,但最终EC值分别为2.57和2.21 ms·cm−1,低于CK组,处于安全水平。这表明,添加菌剂有利于降低堆肥中的可溶性盐的含量。

    • 堆肥过程中种子发芽率指数(GI)可在一定程度上代表堆肥产品对植物毒性的强弱。其变化如图2所示,2组堆肥初期GI均低于20%。这表明,土霉素菌渣有较强的植物毒性,在农田应用中可能会存在较大的环境风险[20]。由于堆肥初期物料中的有机酸和铵根离子浓度较高,故导致了堆体初期的GI偏低。随着堆肥的进行,在微生物的作用下,物料GI逐渐升高,逐步实现脱毒。当GI>80%时,认定堆肥产品对植物基本无毒,2组堆肥产品均达到安全水平。添加菌剂使C组比CK组处理时间提前了7 d。这表明,复合菌剂在一定程度上加强了堆肥对植物毒性的削减。最终产品的GI分别为94.8%和107.3%。添加菌剂后,在提高微生物的种类和活性的作用下,缩减了堆肥周期,加快了堆肥物料的脱毒。马骏[21]研究表明,牛粪堆肥产品的GI高达124%,远高于本研究结果。由此可推测,土霉素残留不仅对GI有抑制作用,且质量浓度越高其抑制效应越强。

    • 随着堆肥的进行,微生物的生长发育消耗了一定的碳源,导致有机质质量分数下降。堆肥结束后C组中有机物质的降解率为14.80%,而CK组仅为9.24%。因此,投加复合菌剂可增加堆体中微生物的数量和活性,加快了对碳源的消耗,提高了堆肥过程的最高温度,可间接增强对有机质的降解。

      对堆肥成品进行检测,检测指标参照《有机肥料标准》(NY/T525-2021)[22]中对肥料的要求,将检测结果同标准中要求值进行对比,其结果见表2。堆肥成品指标除水分的质量分数偏高外,其余指标均满足《有机肥料标准》(NY/T 525-2021)[22]中标准,在后续晾干过程中可降低其水分的质量分数。本研究结果可为抗生素菌渣及其衍生物的工程化好氧堆肥资源化利用提供数据支持和技术参考。

    • 1)菌剂对堆肥中土霉素降解影响。堆体温度是堆肥过程中最重要的参数之一,与有机物降解程度和堆肥产物的腐熟程度密切相关。堆肥温度变化和土霉素降解变化间的关系如图3所示。堆肥期间,温度变化经历了升温期、高温期和降温腐熟期3个阶段。在堆肥第2天,2组温度分别达到54.56和52.66 ℃。其中,C组比CK组提前1 d达到最高温度,最高温度分别为70.55和66.57 ℃,且高温期延长了5 d。这可能是因为,堆肥初期CK组含有的土著微生物较少,微生物活性较差,难以迅速降解堆体中的有机物。堆肥38 d时,堆体温度与环境温度接近,堆肥发酵结束,有机质降解完全,实现了土霉素菌渣的无害化和资源化。马骏[21]研究发现,菌剂能提高堆肥温度,使最高温度达到80 ℃以上,高于本次堆肥温度。这可能是因为,制药菌渣中高浓度的重金属对高温期优势微生物菌群的抑制作用。ZHANG等[23]在泰乐菌素菌渣与污泥堆肥的研究中也表明,高浓度Cu能致使高温期温度不高,与本研究结果一致。

      图3(b)可知,土霉素降解趋势为先迅速下降,最后趋于稳定。CK组在堆肥21 d降解率为81.23%。这表明,堆肥处理可以降低土霉素残留。堆肥结束时,CK组土霉素质量分数为119.67 mg·kg−1,降解率达86.47%;C组土霉素质量分数为10 mg·kg−1,降解率高达98.87%(图3(c))。C组优于CK组,这与REN等[24]、ZHU等[25]、EZZARIAI等[26]、SARDAR等[27]和SARDAR等[28]的研究结果结果相似。土霉素降解主要发生在升温期及高温期。这一方面可能是,升温中键能较弱的四环素类分子中的C—N易断裂,导致羧基及哌嗪环断裂并脱去;另一方面可能是,温度升高增强了嗜温菌和嗜热菌的生物活性,进而提高了土霉素的降解。因此,高温是抗生素降解的重要影响因素,有利于将抗生素菌渣无害化和资源化[29]

      图3(d)是对2组降解曲线的一级动力学模拟图,CK组和C组R2分别为0.986和0.941。表3列出了堆肥过程中几种抗生素的半衰期,C组和CK组的半衰期分别为13.59和4.38。对比发现,CK组的半衰期最大。这表明,土霉素为难降解抗生素[30-31]。但是,C组的半衰期小于CK组。这说明,复合菌剂的添加有利于土霉素的降解。

      2)菌剂对堆肥中微生物群落结构影响。2组堆肥处理中细菌群落组成在门水平和属水平的相对丰度见图4。C组堆肥样品细菌、真菌和病毒所占的比例分别为94.86%、0.21%和0.97%。细菌主要由放线菌门Actinobacteria、变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidetes组成。细菌群落在高温期变化较大,而土霉素降解也主要发生在高温期。这表明,土霉素降解可能与其微生物群落变化有密切关系。在堆肥初期,C组中Firmicutes增加到40.03%,Proteobacteria从68.45%降低到9.55%。此时优势菌群为Firmicutes和Actinobacteria,其耐受力强,释放热量促使堆体升温。在升温期,C组中Firmicutes和Bacteroidetes相对丰度分别增加了10.1%和2.5%,Actinobacteria减少了15%。在高温期后,Firmicutes和Bacteroidetes相对丰度分别增加了12.27%和5.7%。堆肥结束时,细菌中Actinobacteria数量下降到4.49%,真菌数量下降到0.16%,病毒降低到0.72%。这说明,土霉素菌渣对细菌、放线菌和真菌生长均有不同程度的抑制。此外,在堆肥过程中,子囊菌门Ascomycota只出现在高温期,随堆肥的进行其相对丰度降低,Ascomycota可能为致病菌,故堆肥有利于致病菌的去除。此结果与PENG等[32]的研究结果相似。

      从属水平上分析细菌相对丰度堆肥升温期,以Acetobacter为代表的1类好氧或兼性厌氧的杆状菌群能够分解堆料,提高堆体温度。在堆肥第22 d,堆体中优势菌群以SaccharomonosporaBacillus为代表,Saccharomonospora具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性,有较强的有机质分解能力;Bacillus为木质纤维素降解菌。因此,C组堆肥产物中纤维素和半纤维素含量的下降可能与Bacillus菌群数量的增加有关。堆肥高温期,C组的优势菌属无论在功能还是数量上都比CK组能更好的加速堆肥进程。而且,CK组中反硝化细菌存在较多,降低了堆体中氮的含量,导致氮元素缺少,不利于菌渣堆肥产品向有机肥方向发展。在堆肥第38 d,由于复合菌剂中存在Geobacillusthermodenitrificans,因此堆体中优势菌群以Geobacillus为代表,其可分解菌渣中的蛋白质,进而提高抗生素降解率。

      3)环境因子和细菌群落之间的相关性分析。环境因素(pH、残留土霉素、温度、C/N)与细菌群落(基于门的丰度)的RDA分析结果如图5所示。RDA1和RDA2分别解释了细菌群落和环境因子总变异的72.85%和42.09%。这表明,残留土霉素的变化主要受细菌群落变化的影响。随着堆肥的进行,Firmicutes减少,而其他菌群在升温期和高温期增加,促进了土霉素的降解。这表明,Firmicutes和Actinobacteria是降解土霉素的优势菌群。在堆肥初期,残留土霉素和C/N是影响堆肥进程的主要因素。然而,在高温和降温阶段,pH和温度成为影响堆肥效果的主要因素。且RAMASWAMY等[33]和BAO等[34]的研究也表明,pH、温度以及微生物的活性在降解抗生素过程中起重要作用。因此,在堆肥过程中,土霉素残留的变化和温度、微生物群落的变化有着密不可分的关系。堆肥结束时,C组土霉素质量浓度小于CK组。这表明,添加菌剂可提高微生物种类和活性以及堆体温度,促进了土霉素的降解。

      综上所述,细菌群落的演替和环境因素的变化都会影响土霉素的降解。因温度变化而引起的不同细菌丰度在不同堆肥阶段的差异,可能是残留抗生素随堆肥过程变化的内在机制。接种菌剂既改变了堆肥土著细菌群落的互作模式,降低了细菌群落的复杂度,又为优化建立新的和更健康的堆肥细菌群落奠定了基础。

    • 1) C组的NH4+-N浓度比CK组提前7 d降至腐熟堆肥的安全浓度范围内。堆肥后的成品基本可以满足《有机肥料标准》(NY/T525-2021),复合菌剂在促进堆肥腐熟和氮磷保留中具有良好的效果。

      2)复合菌剂增加了堆体中微生物活性,延长了高温期5 d;C组的土霉素降解率高达98.41%,比CK组高12.39 %。这表明,菌剂堆肥化处理在提高堆体温度的同时提高了土霉素降解率。

      3)在堆肥中,优势门为Firmicutes和Actinobacteria,土霉素残留的变化与其密切相关。因温度变化而造成的不同细菌丰度在不同堆肥阶段的差异可能是引起残留抗生素随堆肥过程变化的原因。

    参考文献 (34)

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