曝气条件下进水C/N对水平潜流型人工湿地脱氮效果和氮转化功能微生物丰度的影响

潘福霞; 来晓双; 王树志; 王惠

doi:10.12030/j.cjee.202010136

曝气条件下进水C/N对水平潜流型人工湿地脱氮效果和氮转化功能微生物丰度的影响

1.
山东师范大学环境与生态研究院，济南 250358
2.
济南大学水利与环境学院，济南 250022

作者简介: 潘福霞(1985—)，女，博士，讲师。研究方向：污水处理技术。E-mail：fxpan2020@163.com

通讯作者: 潘福霞, E-mail: fxpan2020@163.com ;

基金项目:
国家自然科学基金资助项目(41801089，41877424)
中图分类号: X703

Influence of C/N ratio on the nitrogen removal and functional microbial abundance under aeration condition in horizontal subsurface flow constructed wetlands

1.
Institute of Environment and Ecology, Shandong Normal University, Jinan 250358, China
2.
School of Water Conservancy and Environment, University of Jinan, Jinan 250022, China

Corresponding author: PAN Fuxia, fxpan2020@163.com ;

摘要: 为提高潜流型人工湿地在低C/N条件下的污水处理效果，考察了在植物生长旺盛期曝气条件下不同C/N(0.9∶1、2∶1、4∶1)对污水的脱氮效率、微生物群落结构和功能微生物丰度的影响。结果表明： ${\rm{NO}}_3^ -$ 去除率为57.48%~83.19%且随C/N的增加而增加；当C/N为2和4时，可提高COD和TN的去除率，COD和TN去除率均达到80%以上。当C/N为2和4处理组的nirK、nosZ、厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因丰度均显著高于当C/N为0.9时的处理组(P<0.05)；nxrA基因丰度随C/N增加而降低。物种数、Shannon-Wiener指数、Simpson指数、Chao1指数均随C/N的增加而增加。在不同处理组中相对丰度较高的细菌均为变形菌门和酸杆菌门，其占总细菌序列的62.89%~69.66%。对细菌群落结构进行PCoA分析，发现不同处理组间微生物群落组成结构差异较大。由此可见，在植物生长旺盛期，调节C/N为2和4均可显著提高污水处理效果，曝气和添加碳源强化措施可通过改变基质中氮转化功能微生物丰度和微生物群落结构来提高低C/N污水处理效率。
- 脱氮效率 /
- 曝气 /
- 低C/N污水 /
- 功能基因丰度 /
- 微生物群落结构
Abstract: To improve the removal efficiency of the low C/N ratio sewage by subsurface flow constructed wetland, the influences of C/N ratios(0.9∶1, 2∶1, 4∶1) on the nitrogen removal rate, microbial community structure and functional microbial abundance under aeration condition in horizontal subsurface flow constructed wetlandsat the vigorous stage of plant growth were studied. The results were as follows: the removal rate of ${\rm{NO}}_3^ -$ was 57.48%~83.19%, and increased with the increase of C/N ratio. The removal rates of COD and TN increased as the C/N ratio increased to 2 and 4, and both of them were above 80%. The gene abundance of nirK, nosZ and anammox bacterial 16S rRNA of the treatments with C/N ratios of 2 and 4 were significantly higher than that of the treatment with low C/N ratio (C/N=0.9) (P<0.05); the gene abundance of nxrA decreased as the C/N ratio increased. The bacterial species number, Shannon-Wiener index, Simpson index and Chao1 index increased with the increase of C/N ratio. The Proteobacteria and Acidobacteria were the dominant bacteria in all treatments, which accounted for 62.89%~69.66% of the total bacteria sequences. Principle coordinate analysis of bacterial communities showed that there were huge differences of microbial community among the three treatments. Thus, adjusting the C/N ratio to 2 and 4 could improve the removal efficiency of the sewage in the horizontal subsurface flow constructed wetland during the vigorously stage of plant growth. Adding carbon source and changing aeration condition could change the functional gene abundance and microbial community structure in the substrate to improve the removal efficiency of contaminants.
- nitrogen removal efficiency /
- aeration /
- low C/N sewage /
- functional gene abundance /
- microbial community structure

化学镀镍是一种前沿的表面处理技术，具有镀层均匀、耐腐蚀、操作方便等优点，在汽车、电子、石油等领域得到了广泛的应用^[1]。在化学镀镍的过程中，镍离子通过次磷酸盐、氨基硼烷、硼氢化合物的还原作用沉积在金属的表面^[2]。随着反应的进行，溶液中的镍离子和次磷酸盐不断减少，通常需要补充硫酸镍和次磷酸钠，但是积存的亚磷酸盐、硫酸盐、钠等物质降低了金属薄膜的质量，因此，须更换镀液，更换镀液的过程中产生了大量的废槽液，再加上镀件表面的清洗流程，化学镀镍活动会消耗大量的清洗水。

化学镀镍废水含有较高浓度的次亚磷酸钠、重金属镍，为提高镀层的质量、镀液的稳定性及金属镍的沉积速度，在化学镀镍液中均须添加各种有机酸络合剂^[3]，故在化学镍废水中也含有较高的COD。目前，化学镀镍废水的处理方法主要有化学沉淀法、离子交换法、膜分离及吸附法^[4]。施银燕等^[5]发现H₂O₂、NaOH和聚丙烯酰胺能够沉淀、回收化学镀镍废水中大部分的镍离子。白滢等^[6]以电镀废水为处理对象,研究了高分子重金属絮凝剂PEX对废水中重金属离子、浊度及有机污染物的处理效果。虽然化学沉淀法能够有效去除废水中的重金属离子，但因其产生的污泥量大，故处理污泥危废的成本较高，并且化学沉淀法难以协同去除废水中的次亚磷酸盐。LI等^[7]对化学镀镍废液在电渗析回收过程中的2种阳离子交换膜的不同性能进行了测试，发现其能有效去除废液中的有害金属离子(亚磷酸、硫酸盐和钠)。但是离子交换法、膜分离及吸附法存在操作难度高、膜易受污染、离子交换剂饱和及再生等问题^[8]。

电化学方法是一种有效的环境友好的净水技术，其在水中发生电化学反应，经过絮凝、沉淀、氧化和还原等组合作用，可在短时间内完成对多种污染物的去除^[9]。电絮凝技术已经广泛应用于电镀废水处理中，可有效去除废水中的多种重金属污染物；电芬顿法处理电镀废水也已有报道^[10-13]。研究针对化学镀镍废水中的镍离子、有机污染物和次亚磷酸盐，开展了电化学处理研究，详细考察了电絮凝、双氧水强化电絮凝等对化学镀镍废水中的总磷、镍离子与COD的去除效果，并分析了影响去除效果的主要因素与影响机制，可为电镀废水中的次亚磷酸盐、有机物和镍离子的有效去除提供技术参考。

1. 材料与方法

1.1 实验用水水质

实验用水取自某电镀园区化学镀镍废水，呈浅绿色，废水中主要成分有硫酸镍、次磷酸氢钠、柠檬酸钠、氨水。该废水的pH=5.6，镍离子浓度为95 mg·L⁻¹，COD为2 250 mg·L⁻¹，总磷浓度为1 200 mg·L⁻¹，次亚磷酸盐的浓度为1 194 mg·L⁻¹。

1.2 实验试剂与仪器

实验试剂为30% H₂O₂、NaOH、H₂SO₄，均为分析纯，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验装置如图1所示，由DH1765-1型直流稳压电源、反应容器、磁力搅拌器、极板与阴阳极接线组成。阳极为铁板2块，尺寸均为100 mm×60 mm×2 mm；阴极为不锈钢板2块，尺寸均为100 mm×60 mm×2 mm；调节极板间距为10 mm，浸入水中高度60 mm；在反应过程中，阳极和阴极分别通过电极线与DH1765-1型程控直流稳压稳流电源的相关输出端连接，使电化学体系在恒定电流下发生反应。采用Ms-(H)-Pro数显型磁力搅拌器，以确保反应容器内溶液混合均匀，转速为600 r·min⁻¹。电化学系统有效工作容积为500 mL。

图 1 实验装置示意图

Figure 1. Schematic diagram of electrochemical device

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1.3 实验方法

用硫酸和氢氧化钠将水样初始pH调节为3，投加6 mL·L⁻¹的30% H₂O₂，调节不同电流密度分别为2、5、10、15 mA·cm⁻²，总反应时间为40 min，取样时间分别为0、5、10、20、30、40 min，并记录下每次取样时的pH，考察电流密度对实验结果的影响。

用硫酸和氢氧化钠将水样初始pH分别调节为2、3、4、5，投加6 mL·L⁻¹的30% H₂O₂，固定电流密度为10 mA·cm⁻²，反应时间以及取样时间不变，并记录下取样时的pH，考察初始pH对实验结果的影响。

用硫酸和氢氧化钠将水样的初始pH调节为3，固定电流密度为10 mA·cm⁻²，H₂O₂投加量分别设为0、2、4、6、8 mL·L⁻¹，反应时间和取样时间不变，并记录下每次取样时的pH，考察H₂O₂投加量对实验结果的影响。

1.4 分析方法

水样均用0.45 μm滤膜过滤，分析测定水中镍离子浓度、总磷、正磷和COD。水样的pH用奥立龙720APLUS Benchtop型pH计(Thermo Orion Co. USA)进行测定；COD采用加热消解比色法(HACH DRB200消解仪及DR2800型COD比色仪)^[14]测定；镍离子浓度采用电感耦合等离子体ICP-OES(710)光谱仪(AgilentTechnologies.USA)^[14]测定；总磷以及正磷采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-1989)^[14]测定。

2. 结果与讨论

2.1 电流密度对镍离子、总磷和COD去除率的影响

电流密度的大小决定了亚铁离子的溶出量和氢氧根的生成量，是较为重要的影响因素。由图2(a)可知，随着电流密度的增大，镍离子的去除率有所升高。当电流密度为15 mA·cm⁻²，在反应40 min时，镍离子的浓度从初始的95 mg·L⁻¹降至0.4 mg·L⁻¹，去除率达到了99.6%。镍离子的去除原因可能归为2个方面：一方面，随着电流密度的增大，阳极铁板溶出大量的亚铁离子，Fe²⁺经双氧水催化生成Fe³⁺，阴极析氢产生大量的OH⁻，Fe²⁺和Fe³⁺分别与OH⁻反应，产生大量絮凝剂Fe(OH)₂和Fe(OH)₃，镍离子与这些絮凝剂相互作用从而共沉淀^[15]；另一方面，外加的H₂O₂与阳极溶出的Fe²⁺发生芬顿反应，产生的羟基自由基氧化电位高达2.8 eV^[16]，可以破坏镍离子与废水中有机酸的络合形态，使镍离子游离出来，进一步与OH⁻相互作用，生成沉淀。由图2(b)可见，随着电流密度的增大，总磷的去除率有所提高，这是由于亚铁离子溶出量增大，促进了电芬顿反应的效率，电芬顿反应生成的羟基自由基可以将化学镀镍废水中次亚磷酸盐氧化为正磷酸盐，正磷酸盐再与Fe³⁺相互作用生成磷酸铁沉淀，具体反应如式(1)~式(5)所示。

图 2 电流密度对镍离子、总磷、COD去除率的影响和反应过程中pH的变化

Figure 2. Effect of current density on the removal rates of nickel ions, total phosphorus and COD and changes of pH during the reaction

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${{{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{PO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{ + \cdot OH}} \to {\rm{HPO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{\cdot + }}{{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{O}}}$

$(1)$

${{\rm{HPO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}{\rm{\cdot }} \to {{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{PO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}}$

$(2)$

${{{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{PO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}{\rm{ + \cdot OH}} \to {{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{PO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}{\rm{\cdot + }}{{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{O}}}$

$(3)$

${{{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{PO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}{\rm{\cdot }} \to {{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{PO}}_{\rm{4}}^{\rm{ - }}}$

$(4)$

${\rm{F}}{{\rm{e}}^{{\rm{3 + }}}}{\rm{ + PO}}_{\rm{4}}^{{\rm{3 - }}} \to {\rm{FePO}}_{\rm{4}}^{} \downarrow$

$(5)$

当电流密度为10 mA·cm⁻²，反应40 min后，总磷去除率达到91.5%；然而在电流密度为15 mA·cm⁻²，反应20 min时去除率为83.2%，在40 min时总磷去除率仅有77.9%，总磷去除率出现了先升后降的趋势。由图2(c)可见，随着电流密度的增大，COD的去除率也有所升高。这可能是由于随着电流密度的增大，产生的羟基自由基数量增多，能够有效破坏有机物的络合形态，从而快速氧化污染物。由图2(d)可知，随着反应的进行，pH持续升高，并且随着电流密度的增大，pH的升高幅度越大，这是因为阴极极板上产生大量OH⁻，使溶液pH随着反应时间的延长不断升高。

由图2可知，增大电流密度能够在短时间内提高镍离子和COD的去除率，在反应30 min后，继续升高的电流密度对去除率的影响并不明显。并且过高的电流密度会引起pH的持续升高，这不利于正磷的沉淀。从经济的角度考虑，电流密度过大，也会增加用电成本和铁泥量。故确认10 mA·cm⁻²是一个比较合理的电流密度，在此条件下，反应40 min后，镍离子、总磷和COD的去除率分别达到96.6%、91.5%和84.7%。

图3为电流密度分别为10 mA·cm⁻²和15 mA·cm⁻²时，水样中次亚磷酸盐与正磷酸盐的浓度随处理时间的变化特征。由图3(a)可知，随着反应的进行，芬顿反应产生的羟基自由基将次亚磷酸盐氧化成正磷酸盐，同时正磷酸根与Fe³⁺离子反应，生成FePO₄沉淀，总磷含量不断减少。同时，由图3(b)可知，在反应30 min后，次亚磷酸盐已经完全被氧化成正磷酸盐，并且在随后的反应过程中，正磷酸盐含量有所升高。正磷酸根能否与Fe³⁺离子反应生成FePO₄沉淀与反应溶液的pH有关^[17]，结合图2(d)可知，在电流密度为15 mA·cm⁻²、反应时间为30 min、溶液pH=9.53时，产生的大量OH⁻会与水解产生Fe³⁺最先生成较难溶的Fe(OH)₃沉淀，会抑制正磷酸盐与Fe³⁺离子形成沉淀^[18]，导致正磷酸盐溶出，总磷浓度升高。这就解释了随着电流密度的增大，总磷去除率先增大后减小的原因。

图 3 电流密度为10 mA·cm⁻²和15 mA·cm⁻²时水样中次亚磷酸盐与正磷酸盐的浓度

Figure 3. Concentrations of hypophosphite and orthophosphate in water samples at current densities of 10 mA ·cm⁻² and 15 mA ·cm⁻²

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2.2 初始pH对镍离子、总磷和COD去除率的影响

芬顿反应一般要求溶液的pH较低(pH≈3)，这是因为高pH会导致Fe²⁺和Fe³⁺的沉淀，从而影响芬顿反应的效率^[19]。在电芬顿反应过程中，随着反应的进行，溶液pH会不断地上升，所以反应溶液的初始pH对电化学处理化学镀镍废水的效率会有影响。图4反映了初始pH对镍离子、总磷和COD的去除率的影响以及反应过程中pH的变化。由图4(a)可知，在前10 min内，初始pH越小，对镍离子的去除效果越差，这可能是由于在酸性条件下，H⁺会与OH⁻发生中和反应，抑制OH^－与镍离子生成沉淀。随着反应的进行，OH⁻不断生成，导致pH上升，当初始pH分别为3、4和5时，镍离子去除率在40 min时趋于相同。由图4(b)可以看出，总磷去除率在初始pH=3时最好。当初始pH为4或5时，芬顿反应的效率较低，在反应30 min时，pH上升至9以上，过高的pH不利于正磷的沉淀，总磷浓度反而上升，去除率下降。由图4(c)可知，当初始pH为2或3时，COD的去除效果最好，在反应40 min时，COD的去除率分别为86.1%和84.7%。由此可见，在偏酸性条件下，芬顿反应对污染物的氧化效率更高。

图 4 初始pH对镍离子、总磷、COD去除率的影响和反应过程中pH的变化

Figure 4. Effect of initial pH on the removal rates of nickel ions, total phosphorus and COD and changes of pH during the reaction

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2.3 H₂O₂投加量对镍离子、总磷和COD去除率的影响

图5反映了H₂O₂投加量对镍离子、总磷、COD的去除率的影响以及pH的变化。由图5(a)可知，当不投加H₂O₂时，为单独的电絮凝反应，在反应40 min时，镍离子去除率为84.5%。当双氧水投加量为6 mL·L⁻¹时，去除效果最好，反应40 min时,去除率为96.6%。由此可见，镍离子主要是通过电絮凝反应去除。由图5(b)可知，当不投加H₂O₂时，总磷含量几乎不发生变化，化学镀镍废水中大量的次亚磷酸盐难以通过电絮凝方式去除，只有通过芬顿反应产生的羟基自由基将次亚磷酸盐氧化成正磷酸盐，正磷酸根与铁离子反应生成FePO₄沉淀方式去除。随着H₂O₂投加量的增加，总磷去除率先增大后减小。当H₂O₂投加量为6 mL·L⁻¹时，总磷的去除效果最好，反应40 min后，总磷浓度为102 mg·L⁻¹,去除率达到91.5%。由图5(c)也可知，COD的去除率也随着双氧水投加量的增加表现为先增大后减小，当H₂O₂投加量为6 mL·L⁻¹时，COD去除效果最好，反应40 min后，COD含量为344 mg·L⁻¹，去除率达到84.7%。由图5(d)可知，在单独的电絮凝过程中，pH上升比较缓慢，当增加H₂O₂的投加量后，pH上升较快，当H₂O₂投加量为8 mL·L⁻¹时，反应40 min后，pH上升至10.02。

图 5 H₂O₂投加量对镍离子、总磷、COD的去除率的影响和反应过程中pH的变化

Figure 5. Effect of H₂O₂ dosage on the removal rates of nickel ions, total phosphorus and COD and changes of pH during the reaction

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3. 结论

1)电流密度的大小决定了亚铁离子的溶出量和氢氧根的生成量，镍离子和COD的去除率随着电流密度的增大而增大。随着电流密度的持续增大，反应溶液pH不断上升，会导致原本沉淀的正磷酸盐溶出，致使总磷的去除率降低。

2)较高的pH会降低芬顿反应的效率。当调节初始pH为2~3时，能够快速高效地去除镍离子、总磷和COD。

3)在不投加H₂O₂的条件下，反应40 min时，镍离子去除率为84.5%，所以镍离子主要通过电絮凝作用去除。投加H₂O₂后，H₂O₂与阳极溶出的Fe²⁺发生芬顿反应, 产生的羟基自由基能够迅速氧化废水中的次亚磷酸盐和COD,再通过一系列的吸附絮凝作用沉淀。

4)采用电化学方法处理化学镀镍废水，芬顿氧化+电絮凝的处理过程能够高效同步去除水中镍离子、总磷和COD。最佳工艺参数为：电流密度为10 mA·cm⁻²、初始pH为3、30% H₂O₂投加量为6 mL·L⁻¹、反应时间40 min，镍离子、总磷和COD的去除率分别达到96.6%、91.5%和84.7%。

图 1 不同C/N处理的COD、TN、 ${\rm{NH}}_4^ +$ 、 ${\rm{NO}}_3^ -$ 去除率

Figure 1. Removal rates of COD, TN, ${\rm{NH}}_4^ +$ and ${\rm{NO}}_3^ -$ of different C/N ratio treatments

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图 2 不同处理的氮转化功能基因丰度

Figure 2. Copy number of functional genes related to nitrogen metabolism in different treatments

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图 3 不同湿地基质中门水平细菌群落结构组成分布

Figure 3. Taxonomy of the relative abundances of bacterial communities at phylum-level in the substrate of different constructed wetlands

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图 4 不同C/N条件下微生物群落主坐标(PCoA)分析

Figure 4. Principal Coordinate Analysis of microbial communities at different C/N ratios

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表 1 目的基因定量PCR引物

Table 1. Primers of target genes used in quantitative PCR

基因	引物	引物序列 (5′~3′)	扩增长度/bp
anammox 16S rRNA	AMX809F	GCCGTAAACGATGGGCACT	257
anammox 16S rRNA	AMX1066R	AACGTCTCACGACACGAGCTG	257
amoA	amo598f	GAATATGTTCGCCTGATTG	120
amoA	amo718r	CAAAGTACCACCATACGCAG	120
nxrA	F1norA	CAGACCGACGTGTGCGAAAG	322
nxrA	R1norA	TCYACAAGGAACGGAAGGTC	322
nirK	nirK583F	TCA TGGTGCTGCCGCGKGACGG	326
nirK	nirK909R	GAA CTTGCCGGTKGCCCAGAC	326
nirS	nirScd3aF	GT(C/G)AACGT(C/G)AAGGA(A/G)AC(C/G)GG	425
nirS	nirSR3cd	GA(C/G)TTCGG(A/G)TG(C/G)GTCTTGA	425
nosZ	nosZ1527F	CGCTGTTCHTCGACAGYCA	250
nosZ	nosZ1773R	ATRTCGATCARCTGBTCGTT	250

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表 2 不同处理的微生物群落丰富度和多样性指数

Table 2. Richness and diversity indices of the microbial communities in different treatments

处理	物种数	Shannon-Wiener	Simpson	Chao1
CW0	2 186	9.738	0.994	3 616.17
CWH	2 353	9.742	0.995	4 103.56
CWC	2 478	9.819	0.996	4 326.24

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1. 材料与方法
1.1 实验用水水质
1.2 实验试剂与仪器
1.3 实验方法
1.4 分析方法
2. 结果与讨论
2.1 电流密度对镍离子、总磷和COD去除率的影响
2.2 初始pH对镍离子、总磷和COD去除率的影响
2.3 H2O2投加量对镍离子、总磷和COD去除率的影响
3. 结论

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氮素是导致水体富营养化的重要营养物质之一，污水处理厂总氮排放标准为15~20 mg L⁻¹，远高于地表水环境质量标准(GB 3838-2002)。过量的氮排入地表水会造成水体富营养化。因此，对污处理水厂的二级处理出水进行再处理尤为迫切，而潜流型人工湿地因其处理效率高和具有多重生态服务功能而在污水再处理中得到广泛应用^[1]。潜流型人工湿地是通过植物、微生物、基质间的协同作用实现氮去除。有研究^[2-5]表明，植物吸收和基质吸附对氮去除的贡献较小，微生物对氮的转化利用才是主要的脱氮途径。潜流型人工湿地微生物脱氮主要依靠硝化和反硝化过程^[6]，介导硝化反应的细菌主要是好氧的自养微生物，而介导反硝化过程的微生物主要是厌氧的异养微生物^[7]，且该过程需要碳源提供电子受体。传统的人工湿地中总氮去除率为40%~55%^[8]，很多人工湿地总氮处理效率均低于50%^[9]。氮去除主要受氧气和有机碳不足的限制^[10]，因此，亟需采取强化措施提高人工湿地脱氮效率。LAI等^[11]对曝气条件下的垂直流人工湿地的脱氮效果进行了研究并发现，在C/N由3增加到12的过程中，TN、 ${\rm{NO}}_3^ -$ 、COD去除率随C/N增加而增加，但C/N过高会抑制 ${\rm{NH}}_4^ +$ 的去除。CHEN 等^[12]的研究表明，在无曝气、碳源缺乏条件下(C/N=1.6)，因 ${\rm{NO}}_3^ -$ 与 ${\rm{NO}}_2^ -$ 竞争电子受体，导致 ${\rm{NO}}_2^ -$ 积累；而在C/N增加到2.8时，在种植植物下TN去除率可达99%，且无 ${\rm{NO}}_2^ -$ 积累。曝气和C/N对低C/N污水中氮转化途径具有重要影响，然而，曝气条件下低C/N污水处理效果和微生物对不同C/N的响应仍不清楚。

在植物生长旺盛期，植物根系分泌物中的可溶性糖和小分子有机酸(乙酸、草酸、琥珀酸等)可以为反硝化微生物提供部分碳源^[13]。已有文献中，多采用5∶1、10∶1、15∶1等较高的C/N研究不同C/N对人工湿地污水处理效果^[14-15]。然而在高C/N条件下，虽然氮去除效率较高，但也会消耗更多的可溶性氧，会限制好氧硝化过程；同时，过量的碳源也会增加二次污染的风险^[16-17]。因此，只有平衡碳源和可溶性氧的需求才能实现最佳的氮去除效果，节能减耗。本研究在芦苇旺盛期开展，评价了在曝气条件下不同低C/N(0.9∶1，2∶1，4∶1)对污水的处理效果，阐明了在低C/N污水处理中氮去除的微生物机制，以期为水平潜流型人工湿地的节能运行提供参考。

1. 材料与方法

1.1. 实验地点

供试湿地为水平潜流型人工湿地，位于济南市西区污水厂，该区域属暖温带大陆性季风气候。共设有3个湿地单元，湿地单元面积为24.05 m² (长6.50 m，宽3.70 m)，每个湿地单元设有独立的进水系统和曝气装置。水平潜流型人工湿地基质由下而上依次是粗砂、粗砾石、细砾石、细砂、粗砂、土壤种植层，各层厚度分别为0.10、0.30、0.30、0.15、0.10、0.20 m。湿地进水为污水处理厂的尾水，尾水排放执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)中的一级A标准，COD、 ${\rm{NH}}_4^ +$ 、TN、TP年均浓度为20.00、7.20、22.00、2.01 mg·L⁻¹。湿地进水为连续进水，人工湿地水力负荷为0.33 m³·(m²·d)⁻¹。

1.2. 实验处理与样品采集

潜流型人工湿地种植植物为芦苇，种植密度为16株·m⁻²。曝气装置安装在进水端，曝气条件为(1.0±0.2) L·min⁻¹。选用甲醇作为外加碳源，共设置3个处理，即不加甲醇对照C/N为0.9∶1(CW0)、添加甲醇调节C/N为2∶1(CWH)、添加甲醇调节C/N为4∶1(CWC)。在每个供试潜流型人工湿地单元的进水端采用点滴输液器将甲醇均匀地添加至湿地进水中。实验周期为90 d，于2019年7月1日添加碳源，预培养30 d后开始采集水样。实验结束后采集基质样品，首先移除采样点表面的种植土、粗砂，继续深挖砾石填料直至出现水面或显著的水浸痕迹，按照S形取样法，采集5个点的样品混匀，取上层粗砂、细砂、细砾石填料各100 g，装入无菌封口袋，按照相同的取样方法采集不同的点位混匀后作为重复。采集的基质样品用液氮急冻，置于放有冰袋的保温箱中，运至实验室，存放至−20 ℃。

1.3. 水质监测

预运行30 d后采集水质样品，分别于运行39、48、57、66、75、84、93 d采集进水和出水，水样采集时间为上午10:00，在每个湿地单元的进水口和出水口每隔5 min采集1次，共采集3次作为重复。水质测定指标为COD、 ${\rm{NH}}_4^ +$ 、 ${\rm{NO}}_3^ -$ 、TN。COD采用重铬酸钾法(HJ/T 399-2007)测定，TN浓度使用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ 636-2012)测定， ${\rm{NH}}_4^ +$ 浓度采用纳氏试剂比色法(GB/T 5750-2006)测定， ${\rm{NO}}_3^ -$ 浓度采用紫外分光光度计法^[18]测定。

1.4. DNA提取

将采集的填料样品放入塑料杯中，加超纯水100 mL，用超纯水涡旋振荡10 min洗脱生物膜，取上清液于10 000 r·min⁻¹离心15 min，收集微生物富集物。称取约0.10 g土壤样品和0.10 g洗脱下来的生物富集物，采用E. Z.N.A.Soil DNA Kit (D5625, Omega, Inc., USA)提取。DNA提取步骤按照试剂盒说明书的操作程序进行。最后DNA溶解于60 μL solution 6溶液中。利用NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific，Wilmington，DE)测定DNA浓度、检测DNA质量。

1.5. 定量PCR

利用实时定量PCR检测仪(Bio-Rad, USA)测定功能基因丰度，anammox 16S rRNA、amoA、nxrA、nirK、nirS、nosZ引物序列^[19-23]如表1所示。引物序列由金斯瑞生物科技有限公司合成。定量PCR反应液体系为 20 μL，其中包含10 μL SYBR 2 Premix Ex Taq (Takara Shuzo, Shiga, Japan)，正向引物和反向引物各0.8 μmol·L⁻¹，0.2 μL牛血清蛋白(BSA, 20 mg·mL⁻¹)，2 μL 10倍稀释的DNA(浓度在10~20 ng·μL⁻¹)作为模板，6.2 μL 灭菌水。每个样品设置3个重复。将含有正确目的基因的质粒10倍梯度稀释后作为标准曲线。每次定量均需测定用灭菌水为模板的阴性对照。溶解曲线只出现1个特殊峰。扩增效率在90%~110%才可以应用。

1.6. 高通量测序

采用高通量Illumina MiSeq300 平台测定细菌序列，16S rDNA V3-V4区扩增引物为338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)，806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)^[21]。用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，检测合格后用DNA凝胶回收试剂盒回收目标片段。扩增产物送至联川生物技术股份有限公司(杭州，中国)进行细菌组分分析。检测合格的序列按照97%的序列相似度聚类成OTU，采用QIIME1.8.0分析细菌群落结构和α多样性，利用RDP(Ribosomal Database Project)对物种进行分类。

1.7. 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 19.0软件对水质数据和功能基因拷贝数进行分析，方差分析和差异显著性比较用单因素(one-way ANOVA)和邓肯(Duncan)法分析，文中所有图采利用Sigmaplot 12.5软件作图。

3. 讨论

3.1. 强化措施对低C/N污水中氮去除率的影响

碳源和可溶性氧是水平潜流型人工湿地中有机质和氮去除的重要影响因子。对曝气条件下低C/N污水的处理结果表明，CW0、CWH、CWC处理的出水中COD无显著差异，这说明在本研究中不同C/N处理均未造成二次污染。 ${\rm{NO}}_3^ -$ 去除率随C/N的增加而增加，CW0处理的C/N显著低于CWH和CWC。这说明在低C/N条件下，由于碳源缺乏导致电子供体不足抑制了反硝化过程，随着碳源增加，异养反硝化微生物快速生长繁殖，改善了反硝化速率^[10]。CWH和CWC处理的TN去除率显著高于CW0，CWH和CWC处理间无显著差异，说明TN去除率并非随C/N增加而增加，这与CHEN等^[24]的研究结果一致。潜流型人工湿地脱氮效率受基质、植物、微生物等多种因素的影响，在人工湿地实际运行过程中，发挥作用的碳源并非只是污水中的碳源。湿地植物根际有机碳释放速率、根系分泌物类型或数量均会影响根系周围微生物丰度和活性^[25]。ZHAI等^[26]根据湿地植物DOC释放速率推测，每年根系分泌物能够促进人工湿地反硝化脱氮94~267 kg·hm⁻²。在低碳高硝态氮污水处理中，根系分泌物是潜在的重要碳源。本研究中，供试人工湿地已运行3 a，所种植物芦苇为多年生植物，根系较发达，且该实验在植物生长旺盛期开展，故根系分泌物释放量较高。另外，植物根系残茬腐解亦释放部分碳源，也可以为低C/N污水处理提供碳源^[27]。本实验中，在芦苇生长旺盛期，当C/N分别为2和4时，很多指标并未呈现出显著差异。这可能是由于植物根际效应对低C/N污水处理中氮转化功能微生物的影响较大，削弱了外源碳添加导致的处理间的差异。一方面，根系能够为附着的微生物提供较大的表面积，为根际微生物提供适宜的生存条件，因而促进了微生物的生长繁殖^[28]；另一方面，植物根系分泌物会改变微生物群落结构，提高氨氧化细菌和反硝化细菌丰度^[13,29]。本研究仅对低碳氮比条件下人工湿地运行开展了初步的探索，至于植物根际效应与氮转化功能微生物相关性、根系分泌物释放量和植物细根腐解释放碳源等因素与污水处理效果的相关性还有待深入的研究。

3.2. 强化措施对氮转化功能微生物丰度和群落结构的影响

为了解强化措施对低C/N污水氮转化过程的影响，对硝化、反硝化和厌氧氨氧化过程的主要功能基因进行了分析。本研究中，厌氧氨氧化16S rRNA基因丰度表现为添加碳源处理(C/N为2.0和4.0)显著高于对照处理。厌氧氨氧化过程的发生与底物浓度和厌氧条件有关，添加碳源促进了反硝化过程的发生，底物 ${\rm{NO}}_2^ -$ 浓度增加，为厌氧氨氧化过程提供了充足的底物；此外，有机物氧化消耗可溶性氧造成的厌氧条件也促进了厌氧氨氧化过程的发生^[10]。本研究中，不同处理的amoA丰度无显著差异，而不加碳源处理的nxrA基因丰度显著高于加碳源处理。这与以前研究结果不一致。大多研究认为，有机物氧化会与氨氧化过程竞争氧气，amoA和nxrA丰度随C/N增加而降低，硝化过程受抑制^[11-12]。造成本研究结果与前人研究结果不一致的原因是：前人研究^[10-11]中C/N较高(C/N≥6)，而本研究中C/N较低(C/N≤4)，且进水中可溶性氧含量可以为硝化过程提供部分氧气，并未限制氨氧化过程。nxrA介导的是硝化反应的第二步，加入碳源增加了氧气消耗，而进水中的可溶性氧不足以供应 ${\rm{NO}}_2^ -$ 氧化为 ${\rm{NO}}_3^ -$ 过程的发生，因有机物降解与亚硝酸盐氧化过程竞争可溶性氧， ${\rm{NO}}_2^ -$ 氧化为 ${\rm{NO}}_3^ -$ 的过程受抑制^[30]。反硝化微生物主要是异养微生物，添加甲醇作为碳源可以促进反硝化脱氮^[10]。本研究中，不同处理的nirS基因丰度无显著差异，而CWH、CWC处理的nirK基因丰度显著高于CW0处理，添加碳源对nirS和nirK基因丰度产生不同影响的原因是nirK基因对环境变化较敏感，其丰度受环境因素的影响显著^[31]。CWC和CWH处理的nosZ基因丰度均高于CW0处理，nosZ基因通常作为完全反硝化的标志基因，说明添加碳源促进了完全反硝化过程的发生^[31]。

对潜流型人工湿地基质微生物群落结构的分析表明，添加碳源增加了物种多样性和丰富度。这与LI等^[32]的研究结果一致。他们发现，在C/N为2∶1时物种数量最高，在低C/N的条件下，植物根系发达促进了微生物的附着和生长。本研究中，所有处理均表现为变形菌门丰度最高，这与前人的研究^[33]结果一致。变形菌门细菌种类繁多，广泛参与碳、氮循环过程。CWH处理的厚壁菌门丰度最高，厚壁菌门能够执行异养反硝化的过程^[34]，这也是添加碳源能够提高反硝化效率的原因之一。硝化螺旋菌门相对丰度随C/N增加呈逐渐降低趋势，说明添加碳源增加了对氧气的消耗，从而抑制了硝化微生物生长繁殖^[12]，不同碳氮比对硝化菌组分的影响还有待进一步研究。

4. 结论

1)人工湿地在植物生长旺盛期，在曝气条件下调节C/N为2和4均可显著提高TN和 ${\rm{NO}}_3^ -$ 的去除率。

2)添加碳源改变了氮转化功能基因丰度，在C/N为2和4处理中的nirK、nosZ、厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因丰度均显著高于对照。

3)添加碳源可增加物种的丰富度，从而改变细菌群落的结构。

参考文献 (34)

曝气条件下进水C/N对水平潜流型人工湿地脱氮效果和氮转化功能微生物丰度的影响

作者简介: 潘福霞(1985—)，女，博士，讲师。研究方向：污水处理技术。E-mail：fxpan2020@163.com

通讯作者: 潘福霞, E-mail: fxpan2020@163.com ;

Influence of C/N ratio on the nitrogen removal and functional microbial abundance under aeration condition in horizontal subsurface flow constructed wetlands

Corresponding author: PAN Fuxia, fxpan2020@163.com ;

1. 材料与方法

1.1 实验用水水质

1.2 实验试剂与仪器

1.3 实验方法

1.4 分析方法

2. 结果与讨论

2.1 电流密度对镍离子、总磷和COD去除率的影响

2.2 初始pH对镍离子、总磷和COD去除率的影响

2.3 H2O2投加量对镍离子、总磷和COD去除率的影响

3. 结论

计量

出版历程

曝气条件下进水C/N对水平潜流型人工湿地脱氮效果和氮转化功能微生物丰度的影响

通讯作者: 潘福霞, E-mail: fxpan2020@163.com ;

作者简介: 潘福霞(1985—)，女，博士，讲师。研究方向：污水处理技术。E-mail：fxpan2020@163.com 1. 山东师范大学环境与生态研究院，济南 250358 2. 济南大学水利与环境学院，济南 250022

English Abstract

Influence of C/N ratio on the nitrogen removal and functional microbial abundance under aeration condition in horizontal subsurface flow constructed wetlands

Corresponding author: PAN Fuxia, fxpan2020@163.com ;

全文HTML

1.1. 实验地点

1.2. 实验处理与样品采集

1.3. 水质监测

1.4. DNA提取

1.5. 定量PCR

1.6. 高通量测序

1.7. 数据处理

2.1. 不同处理的湿地中污染物的去除率

2.2. 不同处理下氮转化功能基因丰度

2.3. 不同处理下微生物群落结构分析

2.4. 微生物群落结构差异性分析

3.1. 强化措施对低C/N污水中氮去除率的影响

3.2. 强化措施对氮转化功能微生物丰度和群落结构的影响

目录

全文HTML

1.1. 实验地点

1.2. 实验处理与样品采集

1.3. 水质监测

1.4. DNA提取

1.5. 定量PCR

1.6. 高通量测序

1.7. 数据处理

2.1. 不同处理的湿地中污染物的去除率

2.2. 不同处理下氮转化功能基因丰度

2.3. 不同处理下微生物群落结构分析

2.4. 微生物群落结构差异性分析

3.1. 强化措施对低C/N污水中氮去除率的影响

3.2. 强化措施对氮转化功能微生物丰度和群落结构的影响

2.3 H₂O₂投加量对镍离子、总磷和COD去除率的影响

作者简介: 潘福霞(1985—)，女，博士，讲师。研究方向：污水处理技术。E-mail：fxpan2020@163.com
1. 山东师范大学环境与生态研究院，济南 250358

2. 济南大学水利与环境学院，济南 250022