颗粒物对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测贾第鞭毛虫和隐孢子虫的影响

张艳芬; 李红岩; 刘明洋; 郑蓓

doi:10.12030/j.cjee.202009138

颗粒物对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测贾第鞭毛虫和隐孢子虫的影响

1.
中国科学院生态环境研究中心，中国科学院饮用水科学与技术重点实验室，北京 100085
2.
天津城建大学环境与市政工程学院，天津 300384

作者简介: 张艳芬(1991—)，女，博士，工程师。研究方向：水中微生物检测。E-mail：yanfenzhang@rcees.ac.cn

通讯作者: 李红岩(1976—)，女，博士，正高级工程师。研究方向：水质分析。E-mail：hyli@rcees.ac.cn;

基金项目:
国家水体污染控制与治理科技重大专项(2018ZX07502-001-012)
中图分类号: X832

Influence of particles on the detection of Giardia and Cryptosporidium by membrane concentration/density gradient separation and immunofluorescence method

1.
Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
2.
School of Environmental and Municipal Engineering, Tianjin Chengjian University, Tianjin 300384, China

Corresponding author: LI Hongyan, hyli@rcees.ac.cn ;

摘要: 滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法因具有成本低廉和性能稳定的特点，目前已列入《城镇供水水质标准检验方法》(CJ/T 141-2018)用于水源水和城镇供水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫(简称两虫)的检测。针对实际生产中，水中颗粒物会影响该方法回收率和稳定性的情况，在前期研究的基础上，结合颗粒物大小，进一步探索了浑浊度对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测水中两虫的影响。结果表明，颗粒物大小仅对隐孢子虫回收率有影响，对贾第鞭毛虫无显著影响。其中，隐孢子虫在5 μm为主要颗粒物的水中获得最高回收率。浑浊度是影响两虫回收率的主要因素，20 NTU以下浑浊度水样适合采用滤膜浓缩法富集浓缩其中的两虫，尤其是3~5 NTU；20 NTU及其以上浑浊度的水样可采用沉淀浓缩法，在30~50 NTU时有最佳回收率。
- 贾第鞭毛虫 /
- 隐孢子虫 /
- 浑浊度 /
- 颗粒物直径 /
- 密度梯度分离荧光抗体法
Abstract: Due to its low cost and stable performance, the membrane concentration/density gradient separation and immunofluorescence method has been listed in the Standard of Water Quality Examination Methods for Urban Water Supply (CJ/T 141-2018) for the detection of Giardia and Cryptosporidium in urban supplied water and source water. In view of the fact that particles in water will affect the recovery and stability of this method, based on the previous research and in combination of particle size, the influence of turbidity and particle size on the detection of Giardia and Cryptosporidium in water was further explored. Results showed that particle size contributing to the turbidity of water only affected the recovery of Cryptosporidium, while had no significant effect on the test of Giardia, of which the highest recovery of Cryptosporidium occurred in water mainly containing particles with 5 μm size. Turbidity is the main factor affecting the recovery of this method. The membrane concentration method was preferred to monitor Giardia and Cryptosporidium in water samples with turbidity below 20 NTU, with the best recovery at 3~5 NTU. The sedimentation concentration method was suitable for water samples with turbidity higher than 20 NTU, with the best recovery for Giardia and Cryptosporidium at 30~50 NTU.
- Giardia /
- Cryptosporidium /
- turbidity /
- particle size /
- density gradient separation and immunofluorescence method
水污染和水资源短缺严重阻碍着社会和经济的可持续发展^[1-2]。膜法水处理技术因具有处理效率高、出水水质好、占地面积小等优点^[3]，在水处理领域获得广泛关注。作为低压膜分离技术的典型代表，超/微滤技术已被广泛应用于给水处理、污水回用以及海水淡化预处理等领域^[4-5]。然而，膜污染问题始终制约着膜分离技术的进一步发展^[6]。

现阶段针对膜污染的控制方法主要包括膜前水质调控、膜清洗以及膜材料改性等^[7]。其中，水质调控的效果较大程度上依赖于进水水质和前处理工艺参数的选择，在实际工程中控制难度较大。膜清洗是目前实际工程中控制膜污染的常规手段，无论是水/气冲刷，水力反冲洗，还是化学清洗，均可在一定程度上减缓膜污染的发展。但是，膜清洗额外增加的药剂和操控成本，以及其对出水水质和膜寿命等的影响，并不利于膜技术的可持续发展^[3]。膜污染本质上是一种界面现象，是待过滤料液中的溶解性有机物、胶体和颗粒物质等与膜表面之间相互作用的结果^[3]。因此，膜的界面性质，如带电属性、粗糙度以及亲疏水性等，主导着膜污染的产生和发展。大量研究^[5-7]表明，膜的亲疏水性是影响膜污染发展的最核心因素之一，而制备超亲水膜是从根本上控制膜污染的有效途径。

纳米材料和纳米技术的发展为新型超亲水膜的研制提供了诸多途径。氧化石墨烯(GO)作为一种表面富含羧基(—COOH)、羟基(—OH)等活性位点的二维纳米材料，已被广泛应用于水处理领域^[8-10]。纳米SiO₂具有易化学修饰的特点，可基于硅烷化反应灵活制备出性能丰富的有机/无机复合材料，已被广泛用于对传统有机膜材料的亲水改性^[11-12]。本研究以不锈钢网^[13]为基底，以GO和氨基修饰的纳米SiO₂为膜材料，利用GO表面的—COOH与纳米SiO₂表面的氨基(—NH₂)之间的自组装共价键反应，开展了多种新型GO/SiO₂无机复合膜的制备研究。对4种制膜方法，即真空抽滤、多巴胺辅助抽滤、热辅助法和高温煅烧辅助抽滤法进行了对比，结合对所得膜的表面官能团组成、表面形貌、表面粗糙度和亲水性的系统表征，以复合膜的亲水性和稳定性为评价指标，对超亲水GO/SiO₂复合膜的制备方法进行了优选，可为超亲水无机复合膜的制备提供技术支撑。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

复合膜基底选用不锈钢网(SSM，316L型，中国安平金属有限公司)，丝径为10 μm，厚度为70 μm，经5 mol·L⁻¹硫酸溶液浸泡30 min后，用超纯水充分冲洗，于60 ℃烘干备用。制膜原材料选用2 mg·L⁻¹ GO悬浮液(片径<500 nm，南京先丰纳米材料科技有限公司)和粒径为20 nm的SiO₂纳米颗粒(Ludox HS-30，Sigma–Aldrich，美国)，其中SiO₂纳米颗粒经硅烷化反应修饰后制得表面含有氨基基团的SiO₂(M-SiO₂)^[11]。M-SiO₂的制备流程如下：即将含有102 g·L⁻¹纳米SiO₂和35.6 g·L⁻¹ 3-氨基丙基(三甲氧基硅烷)(APTMS，97%，Sigma-Aldrich，美国)pH为5的混合溶液在氮气氛围保护下于70 ℃加热反应24 h，随后透析纯化48 h后制得M-SiO₂悬浮液，保存于4 ℃备用。其他辅助制膜的药品为：盐酸多巴胺(Dopamine，98%)、三(羟甲基)-氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，99%)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS，≥97%)以及2-(N-吗啉基)乙磺酸4-吗啉乙磺酸(MES，≥99%)。

1.2   基于真空抽滤的GO/SiO₂(v-GO/SiO₂)复合膜制备

将经酸洗处理后的SSM安置在抽滤器中，依次采用10 mL 0.4 mg·L⁻¹的M-SiO₂悬浮液和10 mL 2 mg·L⁻¹的GO悬浮液作为进水进行真空抽滤，重复4次后SSM表面即形成一层GO/SiO₂复合层，即得到v-GO/SiO₂复合膜。

1.3   基于多巴胺辅助抽滤的GO/SiO₂(d-GO/SiO₂)复合膜制备

首先将酸洗处理后的SSM浸泡于含有2 g·L⁻¹多巴胺的Tris-HCl溶液中4、16、24 h，(记为d-4、d-16和d-24)后，将负载有聚多巴胺的SSM安置在抽滤器中，按照1.2小节中所述方法进行抽滤制膜，即得到d-GO/SiO₂复合膜。

1.4   基于热辅助的GO/SiO₂(h-GO/SiO₂)复合膜制备

将酸洗处理后的SSM至于底部安置有一层聚二甲基硅氧烷软模板的玻璃容器中，倒入50 mL 1 mg·L⁻¹ GO悬浮液，于30 ℃烘箱中静置烘干；倒入100 mL含有2 mmol·L⁻¹ EDC、5 mmol·L⁻¹ NHS和10 mmol·L⁻¹ MES的催化剂溶液，静置15 min后倒出催化剂溶液；立即加入50 mL 0.4 mg·L⁻¹ M-SiO₂悬浮液，于30 ℃下静置反应至表面干燥；重复上述操作1次，即可制得h-GO/SiO₂复合膜。

1.5   基于高温煅烧辅助抽滤的GO/SiO₂(c-GO/SiO₂)复合膜制备

将经酸洗处理后的SSM安置在抽滤器中，采用50 mL原生SiO₂纳米颗粒(HS-30)悬浮液为进水进行抽滤，将所得预负载有纳米SiO₂的SSM在氮气氛围中于500 ℃煅烧4 h；随后按照1.2小节中所述方法进行抽滤制膜，即得到c-GO/SiO₂复合膜。

1.6   膜性能表征

膜表面微观形貌采用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM，JSM-7001F，日本日立)进行观察；膜表面立体形貌和粗糙度采用原子力显微镜(AFM，Multimode 8，布鲁克，德国)进行观测；膜表面纯水接触角采用视频光学接触角测定仪(OCA 20，德菲，德国)测定。测定接触角时，先将样品平整地贴在玻璃薄片上，然后将2 μL超纯水滴在干燥的膜表面，并记录液滴在膜表面的形态变化视频，从液滴震颤停止后(一般液滴低落后约0.5 s之后)开始计算膜–水接触角。膜表面官能团采用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR，VERTEX 70，布鲁克，德国)进行分析。膜的纯水通量采用一套半死端过滤系统进行测定，系统由超滤杯(Amicon 8010，有效过滤面积为4.1 cm²，密理博，美国)、电子天平(ML4002，梅特勒，瑞士)、数据记录单元以及压力输出和控制装置组成。纯水通量测试步骤为：在20 kPa恒压条件对膜进行预压过滤20 min(期间膜通量逐渐趋于稳定)，随后在10 kPa条件下过滤10 min，根据式(1)计算膜的纯水通量。

$J = \frac{{{\rm{d}}V}}{{A\Delta P{\mathop{\rm d}\nolimits} t}}$ $(1)$

式中：J为纯水通量，m·(s·kPa)⁻¹；V为过滤液体积，m³；∆P为跨膜压差，kPa；t为过滤时间，s。

2.   结果与讨论

2.1   v-GO/SiO₂复合膜的理化特性表征

膜表面的亲疏水性由膜自身化学组成和表面微纳结构共同决定，通常使用表面纯水接触角表征膜的亲疏水性质，一般认为，膜表面纯水接触角θ<90°为亲水界面；θ<5°(或液滴能快速在膜表面铺展)为超亲水界面^[15]。图1所示为SSM(酸洗处理前后)和v-GO/SiO₂复合膜的水接触角动态变化。原生SSM的初始接触角为114.8°，在120 s内下降至103.8°，呈较高的疏水性，其接触角下降可能主要归因于水滴的逐渐蒸发^[11]。当SSM经过酸洗预处理后，表面吸附的低表面能油类等物质被去除，其初始接触角有所降低(106.4°)，但仍呈现较高的疏水性。这主要是由于SSM表面的“内凹型”微纳结构容易滞留空气，致使水滴与SSM以Cassie–Baxter模式相接触，从而呈现出较高的疏水性^[15]。相比之下，v-GO/SiO₂复合膜的初始接触角显著降低至55.0°，约为原生SSM的一半，这主要归因于2点原因：GO与纳米SiO₂表面富含—COOH、—OH和—NH₂等亲水官能团，具有较高的表面能；部分GO和纳米SiO₂填充在SSM的低洼位置，减少了空气的滞留空间，从而使水滴与SSM的接触模式转换为Wenzel模式，从而呈现出亲水性^[10-14]。但是，v-GO/SiO₂复合膜的亲水性较低，在120 s后依然维持在35.9°；且GO/SiO₂层与SSM之间的附着较差，强度较低。

图 1 原生SSM、酸洗的SSM和v-GO/SiO₂复合膜的接触角变化

Figure 1. Variation of contact angle over time for the SSM (before and after acid treatment) and v-GO/SiO₂ composite membrane

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2.2   d-GO/SiO₂复合膜的理化特性表征

多巴胺是1种同时具有氨基和领苯二酚基官能团的生物神经物质，能在湿态条件下发生氧化自聚且可在固体表面附着^[16]，常被用于有机膜的亲水改性研究^[17]。本研究预在SSM表面预负载多巴胺以促进GO/SiO₂层的粘附。图2(a)~(c)分别为酸洗后的SSM浸泡在0.2 g·L⁻¹多巴胺溶液中4、16和24 h的表面SEM照片。由图2可知，经4 h浸泡的SSM表面含有一定量的多巴胺自聚产物(即聚多巴胺)，而随着时间的增长，SSM表面聚多巴胺的增加并不明显。

图 2 SSM浸泡在多巴胺溶液中不同时间后的表面SEM图

Figure 2. Surface SEM images of the SSM soaked in the dopamine solution at different times

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聚多巴胺的附着使SSM的亲水性明显提升。图3(a)所示为不同浸泡时间(4、16和24 h)后SSM的表面接触角对比。SSM表面接触角均显著减小，尤其是在4 h多巴胺溶液浸泡下，SSM的初始接触角为29.5°，并在7 s后完全铺展于SSM表面(即接触角为0°)，表现出较强的亲水性，这可能是因为SSM表面紧密附着聚多巴胺所致，经4 h多巴胺溶液浸泡的SSM表面形貌(图2(a))已直观地证明了这一点。分别经16 h和24 h浸泡后，SSM表面的初始接触角虽然略有差别，但是60 s后，均趋近于20°左右。图3(b)为不同时间浸泡后，SSM表面的红外图谱，1 558 cm⁻¹处的吸收峰为—NH₂变角震动(1 590~1 650 cm⁻¹)吸收峰，由于芳环C=C伸缩(1 370~1 610 cm⁻¹)和—NH₂变角震动重合存在，该处的吸收峰相对较弱，但也在一定程度上证实了SSM表面聚多巴胺的存在。该图谱中并没有呈现出明显的有机官能团吸收峰，这可能是因为多巴胺层太薄或者附着量过少的缘故。

图 3 SSM浸泡在多巴胺溶液中不同时间后的接触角动态变化和红外图谱

Figure 3. Variations of contact angle and FT-IR spectra of the SSMs soaked in the dopamine solution at different times

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基于优选的4 h浸泡的SSM制备出d-GO/SiO₂复合膜。图4为d-GO/SiO₂复合膜与4 h多巴胺浸泡的SSM接触角动态变化的对比。所得d-GO/SiO₂复合膜的初始接触角为50.7°，显著高于SSM。这主要归因于GO相对较低的表面能以及较为平整的表面结构。SSM的表现网状纹理有利于水滴的快速铺展与吸收。虽然，与v-GO/SiO₂复合膜(图1)相比，d-GO/SiO₂复合膜的初始接触角更低且下降速率更高，表明亲水性有所提高，但是，v-GO/SiO₂复合膜的亲水性仍然较低。

图 4 d-GO/SiO₂复合膜和4 h多巴胺浸泡的SSM接触角动态变化对比

Figure 4. Comparison of contact angle variation between the d-GO/SiO₂ composite membrane and 4-h-soaked SSM in the dopamine solution

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2.3   h-GO/SiO₂复合膜的理化特性表征

综合上述结果发现，SSM的网状结构和钢丝的光滑表面不利于物质的附着。为了促进GO与纳米SiO₂在SSM表面的附着，提升成膜负载量，研究采用热辅助法和GO/纳米SiO₂层层接枝堆叠法制备出h-GO、h-GO/SiO₂、h-GO/SiO₂/GO、h-GO/SiO₂/GO/SiO₂ 4种堆叠成分和层数不同的复合膜。图5(a)为4种膜的接触角变化。4种膜的接触角对比趋势呈现出明显的规律性，即随着GO层和SiO₂层的依次叠加，接触角依次逐渐降低。其中，H-GO膜的接触角最高(初始接触角为65.2°)，呈相对疏水性。这是因为GO表面或边缘虽然含有一定量的—OH和—COOH等亲水官能团^[9-10]，但碳材料本身的表面能较低，导致亲水性有限^[8]。当h-GO膜表面继续自组装接枝一层M-SiO₂纳米颗粒后，所得h-GO/SiO₂膜的亲水性显著提升(初始接触角降至32.5°)，这主要归因于纳米M-SiO₂的超亲水特性^[14]。随着接枝层数的增加，膜表面亲水性获得进一步提升，但仍未达到超亲水级别^[19-20]。

图 5 不同接枝结构和层数的h-GO/SiO₂的接触角变化和红外谱图

Figure 5. Variation of contact angle and FTIR spectra of different H-GO/SiO₂ membranes

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图5(b)为4种复合膜的红外谱图，1 100 cm⁻¹处的吸收峰为Si—O—Si键的非对称震动吸收峰^[21]，1 600 cm⁻¹处的吸收峰为—COOH官能团中—C=O的伸缩震动(1 660~1 760 cm⁻¹)吸收峰。此外，可能是由于GO表面—COOH与氨基化SiO₂表面—NH₂发生了共价键合，导致了—C=O的吸收峰向低波长方向发生了偏移。综合上述，h-GO/SiO₂复合膜表面亲水性有所提升，但仍未达到超亲水级别，且经烘干后膜的机械强度较弱，不利于实际应用。

2.4   c-GO/SiO₂复合膜的理化特性表征

上述多巴胺和热辅助制膜法均难以制得稳定的超亲水GO/SiO₂复合膜，这两种改性策略面临一个共性问题，即复合膜难以稳定地附着在SSM上。针对这一问题，研究提出预先在SSM表面抽滤附着一次原生纳米SiO₂颗粒(HS-30)，随后经高温煅烧以加强对后续成膜的附着强度，制得c-GO/SiO₂复合膜。

图6(a)为预负载纳米SiO₂颗粒并煅烧后所得SiO₂膜和c-GO/SiO₂的接触角动态变化的对比。结果显示，SiO₂膜的初始接触角为27.3°，并在45 s内降至12.5°，表现出较高的亲水性。由图7(a)和图7(b)可见，SiO₂膜呈现出具有多层级微纳结构的复合形貌，即在SSM波浪形纹理(微米级结构)的表面覆盖着一层致密的SiO₂纳米颗粒(微米级结构)。由图6(b)可知，SiO₂膜中的Si—O—Si键的吸收峰(1 100 cm⁻¹)也证实了表面覆盖的纳米颗粒为纳米SiO₂。在SiO₂膜基础上制备的c-GO/SiO₂复合膜则表现出超亲水特性，其表面水滴初始接触角仅为6.1°，且2 s内实现完全铺展，这主要归因于膜表面的多层级微纳结构(图7(c))和超亲水M-SiO₂纳米颗粒(图7(d))超亲水特性的协同作用。一方面，复合膜表面含有的大量超亲水M-SiO₂纳米颗粒，显著改变了膜表面的化学构成，使表面能显著提升；另一方面，多层级微纳结构也有利于水滴的吸收和铺展，从而以Wenzel接触模式强化膜表面亲水性^[15]。

图 6 SiO₂膜和c-GO/SiO₂复合膜的接触角变化和红外谱图

Figure 6. Variation of contact angle and FT-IR spectra of SiO₂ membrane amd c-GO/SiO₂ composite membrane

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图 7 SiO₂膜和c-Si-GO/SiO₂复合膜表面SEM图

Figure 7. SEM images of the SiO₂ membrane and c-Si-GO/SiO₂ composite membrane

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此外，c-GO/SiO₂复合膜的红外谱图(图6(b))具有明显的碳材料谱图特征，表明GO的存在。由图7(d)可知，片状GO与颗粒状M-SiO₂也在纳米级尺度内复合形成了一定的粗糙结构，这也为膜表面亲水性的提升起到了关键的作用。

图8(a)和图8(b)分别为SSM和c-GO/SiO₂复合膜的表面AFM三维形貌图。SSM和c-GO/SiO₂复合膜的表面均呈现出周期性的织网状结构。由于GO和M-SiO₂颗粒在表面的附着，c-GO/SiO₂复合膜的平均粗糙度R_a由1 540 nm降低至364 nm，可以有效避免空气的滞留，从而有利于膜表面亲水性和过滤性能的改善。此外，由于预负载的纳米SiO₂颗粒具有较高的表面能，使得制得的c-GO/SiO₂复合膜与SSM基底紧密附着，具有良好的整体性和机械强度。

图 8 SSM和c-GO/SiO₂复合膜的表面AFM三维形貌图

Figure 8. Surface AFM morphology of the SSM and c-GO/SiO₂ composite membrane

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2.5   超亲水c-GO/SiO₂复合膜的水通量

c-GO/SiO₂复合膜作为一种新型无机复合膜，具有良好的应用前景。本研究以获得普遍应用的聚偏氟乙烯(PVDF)有机膜材料制备了2种有机膜(PVDF超滤膜和超亲水改性的SiO₂/PVDF复合超滤膜^[14])，并额外选用一种孔径为0.22 μm的有机商业膜进行对比研究，纯水通量对比结果如图9所示。相比之下，超亲水c-GO/SiO₂复合膜的纯水通量最高，为6.88 ± 0.79 m·(s·kPa)⁻¹，是0.22 μm有机商业膜的1.22倍，是普通PVDF超滤膜的3.21倍，是超亲水SiO₂/PVDF复合膜的11.10倍。导致c-GO/SiO₂复合膜较高纯水通量的原因可归纳于以下2点：一方面，复合膜表面具有较高的孔隙率；另一方面，复合膜的超亲水性使膜得以快速润湿，有利于膜过滤阻力的降低。

图 9 不同膜的纯水通量对比

Figure 9. Comparison of water permeability among different membranes

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3.   结论

1)研究对比了4种GO/SiO₂复合膜的制备方法，其中真空抽滤法、多巴胺辅助抽滤法和热辅助法均难以制备出超亲水GO/SiO₂复合膜，且成膜机械强度较弱，不利于实际应用。

2)高温煅烧辅助抽滤法可以有效地制备出具有超亲水特性的GO/SiO₂复合膜，所得成膜的初始接触角仅为6.1°，且在2 s内实现完全铺展，这主要归因于表面纳米材料的高表面能和多层级微纳结构的协同效应。

3)超亲水c-Si-GO/SiO₂复合膜具有较高的纯水通量，分别为普通PVDF有机超滤膜、超亲水SiO₂/PVDF复合膜和0.22 μm商业膜水通量的3.21、11.10和1.22倍。

图 1 颗粒物大小对隐孢子虫回收率的影响

Figure 1. Effect of particle size on Cryptosporidium recovery

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图 2 浑浊度对滤膜浓缩法检测贾第鞭毛虫的影响

Figure 2. Effect of turbidity on the detection of Giardia by membrane filtration concentration

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图 3 浑浊度对滤膜浓缩法检测隐孢子虫的影响

Figure 3. Effect of turbidity on the detection of Cryptosporidium by membrane filtration concentration

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图 4 浑浊度对沉淀浓缩法检测贾第鞭毛虫回收率的影响

Figure 4. Influence of turbidity on the recovery of Giardia by precipitation concentration

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图 5 浑浊度对沉淀浓缩法检测隐孢子虫回收率的影响

Figure 5. Influence of turbidity on the recovery of Cryptosporidium by precipitation concentration

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表 1 不同颗粒物大小以及不同浑浊度下两虫的回收率

Table 1. Recoveries of Giardia and Cryptosporidium under different particle sizes and turbidity

原虫类型	浑浊度/NTU	2.5 μm颗粒物		5 μm颗粒物		11 μm颗粒物
原虫类型	浑浊度/NTU	回收率均值/%	RSD/%	回收率均值/%	RSD/%	回收率均值/%	RSD/%
贾第鞭毛虫	5	59.33	4.24	61.33	4.10	33.33	4.58
	10	32.67	6.37	32.33	9.45	63.33	3.97
	20	29.67	8.48	18.33	13.73	20.33	10.24
	40	16.67	3.46	15.00	6.67	22.00	4.55
	60	13.00	15.38	17.00	15.56	9.00	22.22
隐孢子虫	5	15.33	19.92	27.67	4.17	4.67	53.93
	10	20.67	10.07	31.00	3.23	30.67	6.79
	20	19.00	5.26	16.33	9.35	15.67	9.75
	40	14.00	7.14	12.67	12.06	5.00	40.00
	60	12.33	9.36	11.67	9.90	2.67	94.37

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表 2 颗粒物大小和浑浊度对贾第鞭毛虫回收率的主体间效应检验

Table 2. Intersubjective effects of particle size and turbidity on the recovery of Giardia

方差来源	Ⅲ型平方和	自由度	均方	F	P
校正模型	13 708.444^a	14	979.175	211.841	0.000
截距	39 308.889	1	39 308.889	8 504.327	0.000
粒径	16.178	2	8.089	1.750	0.191
浑浊度	9 947.111	4	2 486.778	538.005	0.000
粒径 * 浑浊度	3 745.156	8	468.144	101.281	0.000
误差	138.667	30	4.622
总计	53 156.000	45
校正的总计	13 847.111	44
注：a表示 R² =0.990(调整 R² =0.985)。

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表 3 颗粒物大小和浑浊度对隐孢子虫回收率的主体间效应检验

Table 3. Intersubjective effects of particle size and turbidity on the recovery of Cryptosporidium

方差来源	Ⅲ型平方和	自由度	均方	F	P
校正模型	3 246.578^a	14	231.898	71.476	0.000
截距	11 456.089	1	11 456.089	3 530.986	0.000
粒径	498.311	2	249.156	76.795	0.000
浑浊度	1 909.689	4	477.422	147.151	0.000
粒径 * 浑浊度	838.578	8	104.822	32.308	0.000
误差	97.333	30	3.244
总计	14 800.000	45
校正的总计	3 343.911	44
注：a表示 R²=0.971(调整R² =0.957)。

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[1]	Water Health Organization. Guidelines for Drinking Water Quality[M]. Forth Edition. London: IWA Publishing, 2011.
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图( 5) 表( 3)

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1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 基于真空抽滤的GO/SiO2(v-GO/SiO2)复合膜制备
1.3 基于多巴胺辅助抽滤的GO/SiO2(d-GO/SiO2)复合膜制备
1.4 基于热辅助的GO/SiO2(h-GO/SiO2)复合膜制备
1.5 基于高温煅烧辅助抽滤的GO/SiO2(c-GO/SiO2)复合膜制备
1.6 膜性能表征
2. 结果与讨论
2.1 v-GO/SiO2复合膜的理化特性表征
2.2 d-GO/SiO2复合膜的理化特性表征
2.3 h-GO/SiO2复合膜的理化特性表征
2.4 c-GO/SiO2复合膜的理化特性表征
2.5 超亲水c-GO/SiO2复合膜的水通量
3. 结论

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鉴于饮用水在隐孢子虫和贾第鞭毛虫(简称两虫)传播以及其在大规模爆发流行病中的明确作用，两虫不仅被公共卫生部门关注，更是日益受到各国水行业专家的广泛关注和高度重视，并被世界卫生组织(WHO)作为原生动物病原体明确纳入《饮用水水质准则》^[1]。我国于2006年将两虫纳入了《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)，并规定每10 L水中检出不得超过1个。目前，被广泛认可和使用的水中两虫检测方法是美国环境保护署(EPA)的方法1623，即免疫磁分离荧光抗体法，我国《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750. 12-2006)亦采用此法。但由于该方法耗材和设备成本较高，难以在一般水质监测单位或实验室推广并广泛应用。本团队在借鉴日本2007年颁布的《水道水指示菌及隐孢子虫等检测方法》(健水发第0330006号)的基础上，使用醋酸纤维膜代替滤囊/滤芯过滤样品、膜溶解法代替淘洗浓缩样品、密度梯度离心代替免疫磁分离纯化样品，建立了基于膜溶解-密度梯度分离的两虫检测方法^[2-3]。该方法在保障美国EPA 1623号方法和国标方法回收率的基础上，可降低耗材成本85%，同时还可降低设备投入成本75%。目前，该方法已列入住房与城乡建设部行业标准《城镇供水水质标准检验方法》(CJ/T 141-2018)。

在行业应用和实际生产过程中，饮用水及其水源水中通常含有一定量的颗粒物质^[4]。作为反映水中颗粒物的综合参数，浑浊度是水质检测中的常规指标^[5]。我国水厂出水的浑浊度中值为0.26 NTU，95%置信区间为0.07~0.87 NTU^[6]。水源水根据区域具有不同的浑浊度特征，北方地区如松花江为水源水的冬季浑浊度低于20 NTU，夏季浑浊度高达120 NTU^[7]；中西部地区以渭河为代表的水源水浑浊度高达150 NTU^[8]；而南方水源水具有低浊的特点，以长江、东江、闽江等12处水源地的调查研究结果显示^[9-10]，其78.6%的水源水浑浊度平均值在50 NTU以下。因此，我国水厂进水的浑浊度变化范围较宽，中值为11.00 NTU，95%置信区间则为0.81~208.80 NTU ^[6]。水体中颗粒物可通过吸附沉降或者团聚包裹等影响两虫检测方法的准确性和稳定性^[11-12]。有研究发现，高浑浊度水样的两虫回收率均小于低浑浊度水样^[13]，且隐孢子虫卵囊的回收率与浑浊度呈负相关^[14-15]，这说明高浓度颗粒物不利于两虫的检测。但FENG等^[12]研究发现颗粒物的添加可以提高隐孢子虫的回收率。同时，也有部分研究认为，浑浊度对两虫的回收率无显著影响^[16-17]。因此，水中颗粒物对两虫检测回收率的具体影响有待进一步细致深入的研究。

根据我国水质浑浊度状况，本研究结合颗粒物大小进行了双因素实验，分析了颗粒物大小和浑浊度对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测两虫影响，并在此基础上分析了适用于滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测两虫的浑浊度条件，以期为实际水样的两虫检测提供参考。

1. 实验方法

1.1. 颗粒物大小与浑浊度的双因素实验

天然水体中造成浊度的胶体颗粒主要是黏土^[18]。高岭土作为一种黏土矿物，具有良好的吸附能力，是模拟水样浑浊度最常用的物质，目前已广泛用于实验室内模拟生活饮用水以及水源水等水样的颗粒物研究^[19-23]。本研究根据两虫大小(贾第鞭毛虫孢囊椭圆形，长为8~14 μm，宽为7~10 μm；隐孢子虫卵囊圆形，直径2~6 μm)，选用粒径2.5、5、11 μm的高岭土(麦克林，上海)和纯水配置成10 L浑浊度分别为5、10、20、40、60 NTU的悬液。2100Q便携式浑浊度仪(哈希，美国)用于水中浑浊度的测定。100个贾第鞭毛虫孢囊和100个隐孢子虫卵囊(Waterborne，美国)加入上述不同浑浊度的水样，每个浑浊度水平的样品制备3个平行。两虫检测使用滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法进行检测，步骤参考CJ/T 141-2018 10.1。

1.2. 浑浊度对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法的影响实验

使用5 μm粒径的高岭土(麦克林，上海)和纯水配置10 L浑浊度分别为0.26、1、3、5、10、20、40、60 NTU的悬液。浑浊度使用2100Q便携式浑浊度仪(哈希，美国)测定。100个贾第鞭毛虫孢囊和100个隐孢子虫卵囊(Waterborne，美国)加入上述不同浑浊度的水样，每个浑浊度水平的样品制备6个平行。滤膜浓缩步骤以及密度梯度分离荧光抗体染色步骤参考CJ/T 141-2018 10.1。

1.3. 浑浊度对沉淀浓缩/密度梯度分离荧光抗体法的影响实验

使用粒径5 μm的高岭土(麦克林，上海)和纯水配置10 L浑浊度分别为15、20、30、50、75、100 NTU的悬液。浑浊度使用2100Q便携式浑浊度仪(哈希，美国)测定。100个贾第鞭毛虫孢囊和100个隐孢子虫卵囊(Waterborne，美国)加入上述不同浑浊度的水样，每个浑浊度水平的样品制备6个平行。沉淀浓缩步骤以及密度梯度分离荧光抗体染色步骤参考CJ/T 141-2018 10.1。

1.4. 统计分析

统计学分析使用PASW Statistics 18软件进行。对颗粒物粒径与浑浊度双因素实验的结果进行双因素方差分析，比较各因素对两虫回收率影响的大小及其显著性。图形绘制使用OriginPro 2017软件进行。

3. 结论

1)与两虫大小相近的颗粒物大小对贾第鞭毛虫的检测回收率无显著影响，对隐孢子虫回收率的影响较为显著，其中5 μm大小颗粒物有利于提高隐孢子虫检测回收率。

2)浑浊度是影响两虫回收率的主要因素。滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法适用于浑浊度小于20 NTU的低浑浊度水样的检测，尤其对于3~5 NTU 时有最佳回收率；20 NTU及其以上浑浊度的水样适合采用沉淀浓缩/密度梯度分离荧光抗体法，并在30~50 NTU时可获得最佳回收率。

3)根据我国水质浑浊度状况，建议采用滤膜浓缩密度梯度分离荧光抗体法检测生活饮用水，并可在浓缩水样前通过约5 μm颗粒物调节浑浊度至3~5 NTU来提高方法回收率；检测水源水中两虫含量时，可根据实际浑浊度值选择相应的方法进行检测。

参考文献 (29)

颗粒物对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测贾第鞭毛虫和隐孢子虫的影响

作者简介: 张艳芬(1991—)，女，博士，工程师。研究方向：水中微生物检测。E-mail：yanfenzhang@rcees.ac.cn

通讯作者: 李红岩(1976—)，女，博士，正高级工程师。研究方向：水质分析。E-mail：hyli@rcees.ac.cn;

Influence of particles on the detection of Giardia and Cryptosporidium by membrane concentration/density gradient separation and immunofluorescence method

Corresponding author: LI Hongyan, hyli@rcees.ac.cn ;

1. 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 基于真空抽滤的GO/SiO2(v-GO/SiO2)复合膜制备

1.3 基于多巴胺辅助抽滤的GO/SiO2(d-GO/SiO2)复合膜制备

1.4 基于热辅助的GO/SiO2(h-GO/SiO2)复合膜制备

1.5 基于高温煅烧辅助抽滤的GO/SiO2(c-GO/SiO2)复合膜制备

1.6 膜性能表征

2. 结果与讨论

2.1 v-GO/SiO2复合膜的理化特性表征

2.2 d-GO/SiO2复合膜的理化特性表征

2.3 h-GO/SiO2复合膜的理化特性表征

2.4 c-GO/SiO2复合膜的理化特性表征

2.5 超亲水c-GO/SiO2复合膜的水通量

3. 结论

计量

出版历程

颗粒物对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测贾第鞭毛虫和隐孢子虫的影响

通讯作者: 李红岩(1976—)，女，博士，正高级工程师。研究方向：水质分析。E-mail：hyli@rcees.ac.cn;

English Abstract

Influence of particles on the detection of Giardia and Cryptosporidium by membrane concentration/density gradient separation and immunofluorescence method

Corresponding author: LI Hongyan, hyli@rcees.ac.cn ;

全文HTML

1.1. 颗粒物大小与浑浊度的双因素实验

1.2. 浑浊度对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法的影响实验

1.3. 浑浊度对沉淀浓缩/密度梯度分离荧光抗体法的影响实验

1.4. 统计分析

2.1. 颗粒物粒径和浑浊度对水中两虫检测的双因素影响

2.2. 浑浊度对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测两虫的影响

2.3. 浑浊度对沉淀浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测两虫的影响

目录

全文HTML

1.1. 颗粒物大小与浑浊度的双因素实验

1.2. 浑浊度对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法的影响实验

1.3. 浑浊度对沉淀浓缩/密度梯度分离荧光抗体法的影响实验

1.4. 统计分析

2.1. 颗粒物粒径和浑浊度对水中两虫检测的双因素影响

2.2. 浑浊度对滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测两虫的影响

2.3. 浑浊度对沉淀浓缩/密度梯度分离荧光抗体法检测两虫的影响

1.2 基于真空抽滤的GO/SiO₂(v-GO/SiO₂)复合膜制备

1.3 基于多巴胺辅助抽滤的GO/SiO₂(d-GO/SiO₂)复合膜制备

1.4 基于热辅助的GO/SiO₂(h-GO/SiO₂)复合膜制备

1.5 基于高温煅烧辅助抽滤的GO/SiO₂(c-GO/SiO₂)复合膜制备

2.1 v-GO/SiO₂复合膜的理化特性表征

2.2 d-GO/SiO₂复合膜的理化特性表征

2.3 h-GO/SiO₂复合膜的理化特性表征

2.4 c-GO/SiO₂复合膜的理化特性表征

2.5 超亲水c-GO/SiO₂复合膜的水通量