微生物燃料电池中地杆菌对Ag<sup>+</sup>的耐受机理及其对产电性能的影响

苑心; 李鹏松; 顾予一; 陈浩强; 孙德智; 党岩

doi:10.12030/j.cjee.202008254

微生物燃料电池中地杆菌对Ag⁺的耐受机理及其对产电性能的影响

北京林业大学环境科学与工程学院，水体污染源控制技术北京市重点实验室，污染水体源控制与生态修复技术北京市高等学校工程研究中心，北京 100083

作者简介: 苑心(1998—)，女，大学本科。研究方向：水污染的生物修复和检测技术。E-mail：yuanxingr98@163.com

通讯作者: 党岩(1983—)，男，博士，教授。研究方向：环境微生物学。E-mail：yandang@bjfu.edu.cn

基金项目:
中央高校基本科研业务费专项资金(2019ZY19)；国家自然科学基金资助项目(51708031)
中图分类号: X703

Tolerance mechanism of Geobacter sulfurreducens to silver ion and its effects on electricity generation in microbial fuel cell

Engineering Research Center for Water Pollution Source Control and Eco-Remediation, Beijing Key Laboratory for Source Control Technology of Water Pollution, College of Environmental Science and Engineering, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

Corresponding author: DANG Yan, yandang@bjfu.edu.cn

摘要: 微生物燃料电池(MFC)是污水处理领域的一个研究热点，地杆菌(Geobacter)因其出色的产电能力被广泛关注。自然水环境中，重金属等具有生物毒性的组分会影响Geobacter的生长生存和产电能力，进而影响MFC的产电性能。Geobacter对Ag⁺等多种重金属具有较强的耐受能力，然而其耐受较高浓度重金属的机理尚不明晰。选用Geobacter的模式菌种硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)作为研究对象，研究了copZ基因对G. sulfurreducens耐受Ag⁺的调控作用。结果表明：在0.05 mmol·L⁻¹Ag⁺的培养条件下，野生型G. sulfurreducens的copZ基因转录量提升了24.8倍；当把copZ基因从G. sulfurreducens基因组中敲除后，G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受能力显著下降，在 Ag⁺浓度为0.01 mmol·L⁻¹的培养条件下，copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株的生长速率仅为Ag⁺浓度为1 mmol·L⁻¹ 的培养条件下野生型G. sulfurreducens的33.3%；在接种copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株的MFC体系内加入0.05 mmol·L⁻¹ Ag⁺后，MFC的电流减小6.99%。本研究结果证明了copZ基因对G. sulfurreducens耐受Ag⁺具有明显的调控作用，揭示了较高浓度Ag⁺对MFC体系中G. sulfurreducens产能性能的影响机制。
- 微生物燃料电池 /
- 硫还原地杆菌 /
- copZ基因 /
- 重金属抵抗 /
- 银离子
Abstract: Microbial fuel cell (MFC) is a hot spot research area in sewage treatment. Geobacter is widely recognized in the field of MFC due to its excellent electricity generation ability. The biologically toxic components such as heavy metals in the natural water environment will affect the growth and survival of Geobacter and the ability to generate electricity, which in turn affects the electricity generation performance of MFC. Geobacter is generally tolerant to various kinds of heavy metals such as Ag⁺. However, the mechanism of its tolerance to higher concentrations of heavy metals is still unclear. In this study, Geobacter sulfurreducens, a model species of Geobacter, was selected to study the regulation of the copZ gene on G. sulfurreducens’s tolerance to Ag⁺. Results showed that the transcription of the copZ gene of wild-type G. sulfurreducens increased by 24.8 times under 0.05 mmol·L⁻¹Ag⁺. When copZ was knocked out from the G. sulfurreducens genome, the tolerance of G. sulfurreducens to Ag⁺ decreased significantly. The growth rate of the copZ-deficient G. sulfurreducens strain in the presence of 0.01 mmol·L⁻¹ Ag⁺ was only 33.3% of that of the wild-type G. sulfurreducens in the presence of 1 mmol·L⁻¹Ag⁺. When 0.05 mmol·L⁻¹ Ag⁺ was added to the microbial fuel cell (MFC) system which inoculated with the copZ -deficient G. sulfurreducens strain, the output current of the MFC decreased by 6.99%. This study proved that the copZ has a significant regulatory effect on G. sulfurreducens tolerance to Ag⁺, and revealed the internal mechanism of high Ag⁺ concentration influence on the electricity productivity performance in the G. sulfurreducens MFC system.
- microbial fuel cell /
- Geobacter sulfurreducens /
- copZ gene /
- heavy metal resistance /
- silver ion

随着化石燃料中CO₂、CH₄、N₂O等温室气体排放量逐年增加^[1]，温室效应带来的影响也日益严重，极端天气和自然灾害的出现也越来越频繁^[2]。其中，CO₂在大气中质量分数的增加对于温室效应的影响最大，造成了2/3的温室效应^[3]，CO₂减排势在必行。CO₂减排主要包括，改善能源效率，开发可再生能源，以及CO₂碳捕获利用与封存技术 (carbon dioxide capture utilization and storage, CCUS) ^[4]。政府间气候变化专门委员会(IPCC)的一项评估指出，为了在2050年前将全球平均气温上升控制在2 ℃以内CO₂排放量最低应减少50%^[5]。国际能源署研究发现，为了实现这一目标，到2050年，CO₂碳捕获利用与封存 (CCUS) 至少贡献需要达到全球减碳量的1/6^[6]。

目前规模化CCUS技术主要是矿地质封存、海洋封存、矿化封存等。其中，地质封存可能改变原始地貌并且存在CO₂泄漏的风险，海洋封存可能会破坏海洋环境^[7]，而利用工业固体废物进行矿化封存具有生成物稳定^[8]、安全性高^[9-10]、原料成本低和距离排放源近等优势^[11]，是一种有发展潜力的规模化CO₂捕集封存利用技术。武鸽等^[12]开展了典型工业固废矿化封存CO₂的基础研究，揭示了电石渣和钢渣矿化封存CO₂能力强的机理。张亚朋等^[13]进一步开展了CO₂矿化封存工艺 (包括干法和湿法) 路线实验研究，对比结果表明，电石渣和钢渣湿法矿化固碳性能一般优于干法，具有较强的应用潜力。然而，湿法矿化仍然存在能耗和成本较高等问题^[14]；与此同时，石化和煤化工生产排放大量污水及高盐水需要处理^[15]。

多项研究使用化工含盐污水协同飞灰、钢渣、水泥窑粉尘等工业固体废物进行矿化反应^[16]。LI等^[17]用高质量浓度盐水与碱性炉渣进行矿化实验，研究溶液pH、Ca²⁺质量浓度和液固比等因素对矿化效率的影响，并且发现溶液中高质量浓度的Ca²⁺会阻碍炉渣中Ca²⁺的浸出。BANG等^[18]用海水淡化厂中的浓缩海水作为反应介质替代去离子水矿化CO₂，发现更高的pH有利于矿化反应的进行，Ca与Mg共存时不利于MgCO₃的析出。MIGNARDI等^[19]研究发现CO₂在富Mg溶液中停留时间更长。由此可见，海水、化工盐水等同碱性灰渣协同矿化固碳具有可行性，需要进一步研究不同固废、高浓盐水同CO₂的最佳工艺条件。本研究用实际含盐污水与电石渣进行矿化实验，探究温度、压力、液固比对矿化反应中CO₂封存率的影响，寻找电石渣矿化反应的最优工艺条件，以期为研发含盐污水与电石渣协同处理的二次资源循环利用技术提供参考。

1. 材料与方法

1.1 实验原料

本研究所用电石渣采样于宁夏某工业园区。实验前将样品在研钵中研磨至均匀粉末状，随后在105 ℃下干燥至恒重状态，分别过120目和200目筛得到粒径为75~120 μm的样品干燥密封保存。实验所用CO₂为99.9%高纯气体。化工含盐污水取自山西某化工园区。

1.2 实验装置

反应装置主要由高压釜 (KTFD06-20型，烟台科立化工设备有限公司，可用体积为0.6 L，最高温度300 ℃，最高压力20 MPa) 、高纯CO₂ 钢瓶和在线记录控制箱3部分组成。

1.3 实验方法

将溶液和处理后电石渣加入高压釜中，关闭出口阀门，在密闭条件下升温至设定温度。随后将高纯度CO₂ 气体从钢瓶注入反应器中，使高压釜内的压力稳定在设定压力。开启机械搅拌装置，转速200 r·min⁻¹，同时开始计时。反应2 h后停止加热，打开出气阀门释放压力，等高压釜内温度降低到室温。然后对反应釜内的悬浮液用0.7 μm 滤纸进行过滤，将过滤后的反应物放入烘箱，在105 ℃下烘干12 h，并研磨均匀，后对反应产物进行分析表征。

1.4 实验设计

矿化反应受温度、压力、液固比的影响较大，分别考察反应温度 (25、45、65、85 ℃) 、压力 (0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5 MPa) 、液固比 (1、5、10、15 mL·g⁻¹) 对电石渣协同含盐污水湿法矿化封存CO₂能力的影响。基于单因素的实验结果设计实验，采用响应面曲线法 (Response surface methodology, RSM) 进行工艺条件优化^[20-21]，研究温度、压力、液固比之间的交互作用，确定矿化反应最佳工艺条件^[22]。

1.5 数据处理

CO₂封存率计算：取适量样品，在N₂流量为30 mL·min⁻¹的条件下进行热重分析，温度为50~1 050 ℃，升温速率为50 ℃·min⁻¹，通过测定样品在550~950 ℃的失重，计算样品中的CO₂质量分数w (CO₂) 和CO₂封存量K，如式 (1)~式 (3) 所示。

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$(1)$

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(2)$

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$(3)$

式中：Δ_{m550~950 ℃}表示封存的CO₂质量，g；w (CO₂) 为矿化后电石渣中的CO₂质量分数；K为CO₂的封存率；Q_CO2为单位质量新鲜电石渣的CO₂封存量，g·kg⁻¹。

1.6 分析与表征

采用X 射线荧光光谱(X-ray fluorescence, XRF)分析电石渣化学组成；采用热重分析仪分析电石渣CO₂封存量；采用Mettler Toledo-FE28 pH测试计测定实验水样pH；采用Dionex-320型离子色谱仪检测反应前后溶液中主要阴离子；采用电感耦合等离子体光谱仪 (ICP-AES) 测定阳离子。

2. 结果与讨论

2.1 化工含盐污水协同电石渣矿化封存CO₂ 性能评价

分别使用实际化工含盐污水和去离子水作为反应介质进行矿化反应，图1是湿法矿化反应前后电石渣热重 (TG) 曲线。从图1中可以看出，反应前电石渣在100~540 ℃有明显质量损失，该质量损失对应Ca(OH)₂分解。这表明，电石渣原样中含有Ca(OH)₂，而矿化反应后的电石渣仅在550~950 ℃之间出现明显质量损失，100~540 ℃之间的失重消失说明矿化反应后电石渣中的Ca(OH)₂转化为了其他物质。550~950 ℃的质量损失对应CaCO₃的分解，表明矿化反应后电石渣中的Ca(OH)₂转化成CaCO₃。根据计算结果可知，使用化工含盐污水和去离子水作为反应介质的电石渣CO₂封存率分别为59.59%和59.89%，封存率基本持平。这说明，化工含盐污水对电石渣湿法矿化封存CO₂能力影响不大，可以使用化工含盐污水代替去离子水。

图 1 湿法矿化反应前后热重 (TG) 曲线

Figure 1. Thermogravimetric (TG) curves before and after wet mineralization

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反应前后电石渣的XRD图谱如图2所示，反应前电石渣中主要矿物相为Ca(OH)₂，此外还有少量的CaO。反应后电石渣样品的XRD图谱中还存在少量Ca(OH)₂的衍射峰，使用化工含盐污水和去离子水作为反应介质的电石渣的矿物组成基本一致，这也与热重结果相符。随着反应的进行，生成的CaCO₃颗粒聚集、附着或覆盖在原样的表面，使内部的活性钙未能完全发生反应，因此反应后样品中存在Ca(OH)₂。经过矿化反应后的电石渣碱性降低，减少了环境风险，可以用作水泥、砂浆、混凝土或沥青的骨料^[23-24]，也可以通过过滤分离等手段获得高纯碳酸钙^[25-26]。

图 2 湿法矿化反应前后XRD谱图

Figure 2. XRD before and after wet mineralization

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对湿法矿化反应前后的化工含盐污水进行离子分析，如表1所示。从表中可以看出，反应后阳离子中Ca²⁺、Mg²⁺和Na⁺质量浓度出现了较明显的下降，分别从897、525、1 927 mg·L⁻¹降至556、221、617 mg·L⁻¹。阴离子中Cl⁻和SO₄²⁻质量浓度也出现了较明显的下降，分别从 4 484、3 565 mg·L⁻¹降至4 087、617 mg·L⁻¹。湿法反应前后电石渣的XRF结果如表2所示，反应后电石渣中Na、Cl、S元素含量增加。Ca²⁺和Mg²⁺质量浓度的降低可能的原因是反应过程中溶液中Ca²⁺和Mg²⁺与溶液中的CO₃²⁻发生了反应，消耗了Ca²⁺和Mg²⁺，导致其质量浓度下降。Na⁺、Cl⁻和SO₄²⁻不能与CO₃²⁻反应生成沉淀，其质量浓度下降一方面可能是电石渣的加入使溶液pH增加 (如图3所示) ，Ca²⁺与SO₄²⁻生成CaSO₄沉淀；另一方面，这些离子可能吸附在电石渣表面，造成溶液中离子质量浓度的下降^[27-28]。

表 1 反应前后溶液组分变化

Table 1. Change of solution composition before and after reaction mg·L⁻¹

样品	Cl⁻	NO₃⁻	SO₄²	Ca²⁺	K⁺	Mg²⁺	Na⁺
化工含盐污水	4 484	102	3 565	897	231	525	1 927
反应后滤液	4 087	93	617	556	171	221	617

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表 2 反应前后电石渣化学组成

Table 2. Chemical composition of calcium carbide slag before and after reaction %

样品	Na₂O	MgO	Al₂O₃	SiO₂	SO₃	Cl	CaO	TiO₂	Fe₂O₃	SrO	K₂O	NiO
反应前电石渣	0.020	0.170	0.950	2.700	0.470	—	90.900	—	0.170	—	—	—
反应后电石渣	0.549	0.523	0.658	1.900	1.990	0.615	93.100	0.072	0.192	0.079	0.102	0.177

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图 3 湿法矿化过程水样pH变化

Figure 3. Change of pH value of water samples during wet mineralization

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对矿化过程中不同阶段的2种水样进行pH测试，其pH变化如图3所示。可以看出，2种水样pH不同，但是在反应过程中的pH变化趋势基本一致，反应前化工含盐污水pH为5.18，去离子水pH为7.03；加入电石渣、加热至实验温度并搅拌后，化工含盐污水滤液pH升至12.02，去离子水滤液pH为12.31，pH的升高源于电石渣中碱性物质如Ca(OH)₂发生电离，产生大量OH⁻和Ca²⁺；通入CO₂后，由于CO₂与溶液中OH⁻和Ca²⁺ (或Mg²⁺) 发生矿化反应，OH⁻的消耗使溶液碱性降低，化工含盐污水滤液和去离子水滤液pH值分别下降至7.40和7.15。

2.2 化工含盐污水协同电石渣矿化封存CO₂反应特性

1) 温度对电石渣CO₂封存率的影响。CO₂封存率随温度变化关系如图4 (a) 所示。由图可见，随着温度的升高，CO₂封存率先增大后减小，在65 ℃达到最大封存率47.56%。随着温度升高，分子运动会随之变得剧烈，电石渣中钙更容易浸出形成Ca²⁺溶解于液相中，但是温度的升高会降低CO₂气体在溶液中的溶解度。在65 ℃之前，Ca²⁺的浸出是反应控制步骤，温度升高，Ca²⁺的浸出量增大，CO₂封存率升高。在温度高于65 ℃后，CO₂的溶解是反应控制步骤，随着温度升高，CO₂气体在溶液中的溶解度下降^[29]，导致封存率下降。矿化反应为放热反应，温度升高，反应平衡向左移动，也会导致封存率下降。

图 4 CO₂封存率随不同因素的变化关系

Figure 4. Variation of CO₂ sequestration rate K with different factors

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2) 压力对电石渣CO₂封存率的影响。CO₂封存率随初始压力变化关系如图4 (b) 所示。由图可见，CO₂封存率随初始压力的变化较小，随着初始压力的升高，CO₂封存率先增大后减小，在压力为1.0 MPa时K达到最大封存率52.79%。压力主要对CO₂在溶液中的溶解度产生影响。在一定的温度下，溶液中CO₂的溶解量与压力成正比，压力差越大，推动力越大，CO₂在溶液中的溶解量越大^[30]。随着压力从0.5 MPa增大到1.0 MPa，CO₂在溶液中的溶解量增大，产生的CO₃²⁺离子增加，CO₂封存率增大。当压力从1.0 MPa增大到2.5 MPa时，溶液中的CO₂质量浓度继续增加，与化工含盐污水中的Ca²⁺快速反应，生成的CaCO₃颗粒附着于电石渣表面，阻碍了电石渣中Ca的浸出^[31]，同时干扰CO₂气体在电石渣中的扩散，限制反应的进行^[32] 。

3) 液固比对电石渣CO₂封存率的影响。CO₂封存率液固比变化关系如图4 (c) 所示。由图可见，随着液固比的升高，CO₂封存率先增大后减小，在液固比为5 mL·g⁻¹时K达到最大63.47%。溶液中的Ca²⁺、CO₃²⁻质量浓度对矿化反应过程有很大的影响，而液固比会影响电石渣中碱性物质和CO₂在水中的溶解程度，进而影响溶液中Ca²⁺、CO₃²⁻质量浓度及矿化封存CO₂性能^[33]。在液固比小于5 mL·g⁻¹时，虽然提供了电石渣中碱性物质与气体发生反应的液体介质，但是液固比太小，不足使电石渣中钙充分浸出，CO₂在水中的溶解量也较少。当液固比达到一定值时，电石渣中碱性物质溶解基本完全，继续增大液固比，碱性物质的溶解量不再增加，相反，液体的增加会使溶液中Ca²⁺质量浓度下降，进而矿化反应平衡向左移动，封存量降低。

2.3 化工含盐污水协同电石渣湿法矿化封存CO₂工艺条件优化

1) 模型建立与检验。根据单因素影响的实验结果设计响应面曲线工业条件优化实验，实验结果如表3所示。

表 3 响应面实验结果

Table 3. Experimental results of response surface methodology

实验编号	A/ ℃	B /MPa	C/(mL·g⁻¹)	K/%
1	45	0.5	5	62.6
2	85	0.5	5	63.1
3	45	1.5	5	63.9
4	85	1.5	5	56.0
5	45	1.0	2	59.8
6	85	1.0	2	36.0
7	45	1.0	8	51.9
8	85	1.0	8	56.4
9	65	0.5	2	47.5
10	65	1.5	2	51.1
11	65	0.5	8	64.9
12	65	1.5	8	59.2
13	65	1.0	5	62.4
14	65	1.0	5	63.6
15	65	1.0	5	61.7
注：A—温度；B—初始压力；C—液固比。

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根据实验结果拟合模型，由Design-Expert软件拟合出经验模型如式 (4) 所示。模型的P值为0.008 722<0.05，意味着预测模型是显著的。

$stringUtils.convertMath($ !{formula.content})

$(4)$

2) 因素交互作用。采用响应面曲线法研究3个变量之间的交互作用，图5为CO₂封存率的响应面图和等高线图。图5 (a) 、图5 (b) 表示，温度和压力之间的交互作用对CO₂封存率的影响，在液固比不变的情况下，温度与压力之间的交互作用较小，压力的改变对CO₂封存率的影响很微弱，这也与单因素试验的结果吻合。图5 (c) 、图5 (d) 为压力一定时温度与液固比的交互作用对CO₂封存率的影响，由于温度和液固比的影响，CO₂封存率增加，等高线的形状为椭圆形，说明温度和液固比的交互作用显著，是影响封存率最显著的参数之一。图5 (e) 、图5 (f) 为温度一定时压力与液固比的交互作用CO₂封存率的影响，三维图基本呈拱形，说明液固比对于反应的影响更加明显，而2者的交互作用对于CO₂的封存来说并不显著。

图 5 CO₂封存率响应面曲线和等高线图

Figure 5. Response surface plot and contour plot of CO₂ sequestration rate

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3) 最佳工艺条件。基于响应面曲线拟合结果，确定CO₂封存率最大的反应条件为：85 ℃、0.5 MPa、液固比7.5 mL·g⁻¹，在此条件下，模型预测值为66.9%。同时，在上述条件下进行含盐污水协同电石渣湿法矿化封存CO₂实验，3次平行实验所得CO₂封存率的平均值为66.1%，电石渣实际固碳量为661 g·kg⁻¹，实验值与预测值的误差小于1.5%。因此，通过上述方法可高效准确获得矿化封存CO₂实验的最佳工艺条件。

3. 结论

1) 化工含盐污水和去离子水为介质的电石渣矿化封存CO₂封存率分别为59.59%和59.89%，基本持平，可以使用化工含盐污水代替去离子水作为反应介质。

2) 温度和液固比对CO₂封存率的影响较大，压力影响较小。单因素优化实验条件下，在温度65 ℃、压力1.0 MPa和液固比5 mL·g⁻¹时CO₂封存率分别达到47.56%、52.79%和63.47%。

3) 温度和液固比之间的交互作用最为显著，温度和压力、液固比和压力的交互作用不显著。同时确定在反应温度85 ℃、初始反应压力0.5 MPa、液固比7.5 mL·g⁻¹的最优工艺条件下，含盐污水协同电石渣矿化的CO₂封存率为66.1%。

图 1 不添加和添加Ag⁺条件下G. sulfurreducens重金属转运相关基因表达变化对比

Figure 1. Comparison of the expression changes of heavy metal transport related genes in G. sulfurreducens in the absence or presence of Ag⁺

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图 2 野生型与copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株对Ag⁺的耐受浓度阈值

Figure 2. Tolerance threshold of wild-type and copZ-deficient G. sulfurreducens strains to Ag⁺ concentration

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图 3 Ag⁺对分别接种了野生型与copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株的MFC系统的产电性能的影响

Figure 3. Effect of Ag⁺ on the electricity production performance of MFC systems inoculated with wild-type and copZ-deficient G. sulfurreducens strains

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表 1 qRT-PCR引物序列

Table 1. Primer sequences for qRT-PCR

引物名称	前引物序列	后引物序列
copZ_45f/168r	AGTGATCGTGGTGGTGCTCT	GAGCGTCTTCTCGATCTTGC
copA_2263f/2368r	GCCGGGGTCCTCTACTATCC	GGAGCAGGATCGAGTTGGTC
czcA1_451f/561r	CCCATGGAGTTGAAGGAGAC	CACTTGGTACTGCCGCTTTT
czcA2_2276f/2374r	AAGAGAACCGCAGCTTCGAC	TGCCGGTTTTCGTAGTGATG
cdf1_681f/796r	GGTCAATGCCGTTCATCAGA	GTCGTAGAACCTCGGCTTGC
cdf2_781f/876r	ATCGCCACGTGTGTCAAAAA	ATCCTCATGCTCCTCGTCGT

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表 2 copZ基因上游和下游引物序列

Table 2. Primer sequences for upstream and downstream of copZ

引物名称	引物序列
copZ_up_f	GATGCGGCCGTCAACGTCAA
copZ_up_r	TATCCTAGGCATGACAGGCTCCTTTGAAG
copZ_dwn_f	TATCCTAGGACCGGCAGTACCACCGCCTT
copZ_dwn_r	TCGGTGGCGAACTTCTTGTTGC

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图( 3) 表( 2)

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1. 材料与方法
1.1 实验原料
1.2 实验装置
1.3 实验方法
1.4 实验设计
1.5 数据处理
1.6 分析与表征
2. 结果与讨论
2.1 化工含盐污水协同电石渣矿化封存CO2 性能评价
2.2 化工含盐污水协同电石渣矿化封存CO2反应特性
2.3 化工含盐污水协同电石渣湿法矿化封存CO2工艺条件优化
3. 结论

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微生物燃料电池(microbial fuel cell，MFC)是污水处理领域的一个研究热点。MFC阳极表面生长的产电微生物的生长、活性和产电能力对MFC的性能、污水处理的效果均有重要影响。地杆菌(Geobacter)因其出色的产电能力成为这类微生物中广泛被学术界关注的电活性细菌^[1]。然而，污水中重金属等具有生物毒性的组分会影响Geobacter的生长生存和产电能力，进而制约MFC的产电性能和运行效果^[2]。因此，研究Geobacter对重金属的耐受机制对MFC在污水处理领域的应用和发展具有重要意义和现实价值。

银及其相关产品广泛应用于电子、电镀、感光材料、化工工业和科研领域。其中，照相业和电镀业是可溶性含银废液的2大主要来源，主要涉及到定影废液和电镀废液^[3]。以定影废液为例，世界每年生产感光材料所消耗的白银在3 000 t以上，我国每年的消耗量也超过了100 t。在洗印过程中，这些感光材料中70%以上的Ag会溶解进入定影废液^[4]。除了工业含银废水，Ag在环境中的迁移还来自于金属银纳米颗粒(nAg)。银纳米颗粒是一种广泛应用的抗菌剂。自2010年以来，我国纳米银抗菌剂的市场需求量已超过5×10⁶ t^[5]。然而，人类活动释放的银纳米颗粒进入自然生态环境中会形成银胶体。银胶体主要以银单质颗粒和银离子(Ag⁺)形式存在^[6]。同时，银胶体的毒性主要来源于Ag^+[7]，应妥善监测和处理。

细菌对重金属的耐受能力即其细胞结构具有的将有毒金属离子外排或泵出细胞的能力。目前，已发现3种将有毒重金属转运排出细胞的机制，分别依赖于抗瘤细胞分裂蛋白(resistance-nodulation-cell division super family，RND)家族、助阳离子扩散体(cation diffusion failitator，CDF)家族和P型ATP酶(P-type ATPase)家族。其中，由P型ATP酶驱动的金属外排被认为是细菌抵抗重金属毒性的主要模式^[8]。在基于P型ATP酶的重金属抵抗模式中，有毒重金属离子(如Ag⁺、Cu²⁺)进入细胞后会诱导细胞合成CopZ和CopA蛋白。其中，CopZ蛋白负责结合细胞质中的金属离子，并将其转移至位于细胞膜的转运蛋白CopA上，并由CopA将其转运出细胞^[8]。因此，由copZ基因编码的CopZ蛋白对细菌抵抗重金属毒性具有重要作用。然而，不同细菌利用P型ATP酶家族系统所能抵抗的重金属种类存在较大差别，需要分别探究。

截至目前，对于Geobacter的P型ATP酶系统耐受重金属的研究尚未见报道。本研究以Geobacter的模式菌种硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)为代表，研究其对Ag⁺的耐受能力，并对其P型ATP酶系统中copZ基因对Ag⁺耐受能力的内在影响机制进行深入探究，以期在MFC系统内揭示较高浓度Ag⁺对G. sulfurreducens产能性能的影响。

1. 材料与方法

1.1. 实验菌株培养条件及生长速率的测定方法

本研究中所用菌株为实验室收集保存的野生型Geobacter sulfurreducens DL1(ATCC 51573)，在含有10 mmol·L⁻¹的乙酸作为唯一电子供体和50 mmol·L⁻¹的富马酸作为唯一电子受体的厌氧培养基中恒温(30 °C)培养。

培养基的制备：每升去离子水中加入0.42 g KH₂PO₄、0.22 g K₂HPO₄、0.2 g NH₄Cl、0.38 g KCl、0.36 g NaCl、0.04 g CaCl₂·2H₂O、0.10 g MgSO₄·7H₂O、1.80 g NaHCO₃，0.50 g Na₂CO₃，2.04 g NaC₂H₃O₂·3H₂O、6.40 g Na₂C₄H₄O₄，再加入0.50 mL质量分数为0.1%刃天青，1 mL浓度为100 mmol·L⁻¹的Na₂SeO₄溶液，10 mL 维生素溶液以及10 mL 微量矿物质溶液。维生素溶液成分参考文献[9]。微量矿物质溶液的制备：每升去离子水中添加0.10 g MnCl₂·4H₂O、0.3 g FeSO₄·7H₂O、0.17 g CoCl₂·6H₂O、0.20 g ZnSO₄·7H₂O、0.30 g CuCl₂·2H₂O、0.005 g AlK(SO₄)₂·12H₂O、0.005 g H₃BO₃、0.09 g Na₂MoO₄、0.11 g NiSO₄·6H₂O及0.2 g Na₂WO₄·2H₂O。

Ag⁺以硝酸银(AgNO₃)形式添加，浓度为0.000 1~1 mmol·L⁻¹。在厌氧条件下，用一次性无菌注射器从接种培养后的培养基中取出1 mL菌液至一次性比色皿中，在可见分光光度计600 nm波长下检测菌液的OD值，再根据培养时间换算出生长速率^[10]。

1.2. 定量反转录PCR分析相关基因转录量的方法

用上述培养基培养野生型G. sulurreducens。培养条件分别为菌液中不加Ag⁺和添加0.05 mmol·L⁻¹ 的Ag⁺。培养至指数增长期后，使用RNEasy Plus minikit(Qiagen)提取RNA，并用不含DNA的DNase(Ambion)处理。RNA样品纯度通过琼脂糖凝胶电泳进行检查，A₂₆₀/A₂₈₀的比率为1.8~2.0，并用相关基因引物以提取的RNA样品为模版进行PCR扩增，确保RNA样品不含DNA污染。最后，用Superscript III first-strand synthesis SuperMix(Invitrogen)试剂盒将纯化后的RNA样品反转录为cDNA。

从美国能源部联合基因组研究所网站(www.jgi.doe.gov)获得基因组序列数据用于设计定量反转录PCR(qRT-PCR)引物，主要关注的基因包括助阳离子扩散体(CDF)家族的cdf1(GSU0487)、cdf2(GSU2613)，抗瘤细胞分裂蛋白(RND)家族的czcA1(GSU3400)、czcA2(GSU0830)和P型ATP酶(P-type ATPase)家族的copZ(GSU1338)、copA(GSU2452)(见表1)。然后，以上述反转录的cDNA为模版，用7500 qPCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR扩增和检测，并用已知浓度的纯化cDNA做系列稀释，构建覆盖6个数量级的标准曲线。

1.3. copZ基因缺失型Geobacter sulfurreducens菌株的构建

构建copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株采用基因重组方法^[11]，对G. sulfurreducens DL1的copZ基因的上游和下游各约500 bp的区域设计PCR引物(见表2)，并在上游后引物的3′端和下游前引物的5′端添加AvrII(CCTAGG，NEB)限制性酶切位点。对copZ基因的上游和下游区间进行高保真的JumpStart AccuTaq LA DNA聚合酶(Sigma-Aldrich)的PCR扩增，产物用AvrII限制性核酸内切酶(NEB，Beverly，MA)消化，乙醇沉淀，并与T4 DNA连接酶(NEB)连接。然后将连接反应混合物的约1 kb长度的产物条带进行琼脂糖凝胶回收Qiaquick凝胶提取试剂盒Qiagen)，并连接到pCR2.1 TOPO克隆载体中，形成PCR2.1上游5′+3′下游质粒，通过Sanger测序以验证克隆产物的序列。然后提取测序结果完全准确的克隆子的质粒载体，再用AvrII限制性核酸内切酶消化，用T4 DNA连接酶将消化产物与同样用AvrII酶切处理过的庆大霉素抗性基因片段连接形成PCR2.1上游5′+庆大霉素抗性基因+3′下游质粒，测序验证质粒序列的准确性。接着用限制性内切酶KpnI (GGTACC，NEB)对上述构建的质粒进行酶切使质粒线性化。线性化的质粒通过电转进入G. sulfurreducens菌株的感受态细胞，方法见文献[9]。最后，利用厌氧手套箱中制备的已添加了20 μg·mL⁻¹庆大霉素的NBAF固体培养基筛选copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株，并通过PCR检验copZ基因是否被替换成功。

1.4. MFC体系装置及运行条件

反应体系由2组双极室MFC组成，阴阳两极室的容积均为250 mL，并由质子膜(CMI；CMI7000，Membranes International Inc.，美国)隔开。每升阴阳极溶液含0.42 g KH₂PO₄、0.22 g K₂HPO₄、0.20 g NH₄Cl₂、0.38 g KCl、0.36 g NaCl、0.04 g CaCl₂·2H₂O、0.10 g MgSO₄·7H₂O、1.80 g NaHCO₃、0.50 g Na₂CO₃，以及1 mmol·L⁻¹的Na₂SeO₄溶液10 mL、10 mL 微量矿物质溶液和15 mL 维生素溶液^[9]。阳极室培养液中还加入10 mmol·L⁻¹乙酸作为唯一电子供体。配制时将以上组分溶解于800 mL去离子水中，溶解后定容至1 L，各取200 mL溶液并用N₂∶CO₂=80∶20的混合气曝气30 min。阳极室用丁腈橡胶塞密封以保证厌氧环境，并利用磁力搅拌器进行搅拌。阴阳极均为石墨棒电极(Φ 6 mm×80 mm)，参比电极为饱和甘汞电极(相对标准氢电势为+199 mV)。分别在2组MFC的阳极室接种野生型G. sulfurreducens和copZ基因缺失型G. sulurreducens。通过电化学工作站(ChI1030C，上海辰华仪器有限公司)控制阳极电势为+300 mV，同时监测2组MFC的输出电流。

3. 结论

1)野生型G. sulfurreducens对Ag⁺有较强的耐受能力，在Ag⁺浓度高达1 mmol·L⁻¹时仍能保持一定的生长速率，在含Ag⁺废水的处理领域具有潜在的应用潜力。

2) cdf2和czcA2基因与G. sulfurreducens对Ag⁺耐受作用的相关性较弱，而与P-ATPase家族相关的copZ和copA基因对Ag⁺的响应较强，表现出与G. sulfurreducens对Ag⁺耐受作用更强的相关性。copZ基因在G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受过程中起到关键作用，该基因通过调控CopZ蛋白的表达影响了G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受。

3) copZ基因的缺失不影响野生型G. sulfurreducens MFC的产电能力，但Ag⁺会对接种了copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株的MFC的产电能力造成较大影响，且短时间内无法自我恢复。

参考文献 (15)

微生物燃料电池中地杆菌对Ag⁺的耐受机理及其对产电性能的影响

作者简介: 苑心(1998—)，女，大学本科。研究方向：水污染的生物修复和检测技术。E-mail：yuanxingr98@163.com

通讯作者: 党岩(1983—)，男，博士，教授。研究方向：环境微生物学。E-mail：yandang@bjfu.edu.cn