本研究中所用菌株为实验室收集保存的野生型Geobacter sulfurreducens DL1(ATCC 51573)，在含有10 mmol·L⁻¹的乙酸作为唯一电子供体和50 mmol·L⁻¹的富马酸作为唯一电子受体的厌氧培养基中恒温(30 °C)培养。

培养基的制备：每升去离子水中加入0.42 g KH₂PO₄、0.22 g K₂HPO₄、0.2 g NH₄Cl、0.38 g KCl、0.36 g NaCl、0.04 g CaCl₂·2H₂O、0.10 g MgSO₄·7H₂O、1.80 g NaHCO₃，0.50 g Na₂CO₃，2.04 g NaC₂H₃O₂·3H₂O、6.40 g Na₂C₄H₄O₄，再加入0.50 mL质量分数为0.1%刃天青，1 mL浓度为100 mmol·L⁻¹的Na₂SeO₄溶液，10 mL 维生素溶液以及10 mL 微量矿物质溶液。维生素溶液成分参考文献[9]。微量矿物质溶液的制备：每升去离子水中添加0.10 g MnCl₂·4H₂O、0.3 g FeSO₄·7H₂O、0.17 g CoCl₂·6H₂O、0.20 g ZnSO₄·7H₂O、0.30 g CuCl₂·2H₂O、0.005 g AlK(SO₄)₂·12H₂O、0.005 g H₃BO₃、0.09 g Na₂MoO₄、0.11 g NiSO₄·6H₂O及0.2 g Na₂WO₄·2H₂O。

Ag⁺以硝酸银(AgNO₃)形式添加，浓度为0.000 1~1 mmol·L⁻¹。在厌氧条件下，用一次性无菌注射器从接种培养后的培养基中取出1 mL菌液至一次性比色皿中，在可见分光光度计600 nm波长下检测菌液的OD值，再根据培养时间换算出生长速率^[10]。

用上述培养基培养野生型G. sulurreducens。培养条件分别为菌液中不加Ag⁺和添加0.05 mmol·L⁻¹ 的Ag⁺。培养至指数增长期后，使用RNEasy Plus minikit(Qiagen)提取RNA，并用不含DNA的DNase(Ambion)处理。RNA样品纯度通过琼脂糖凝胶电泳进行检查，A₂₆₀/A₂₈₀的比率为1.8~2.0，并用相关基因引物以提取的RNA样品为模版进行PCR扩增，确保RNA样品不含DNA污染。最后，用Superscript III first-strand synthesis SuperMix(Invitrogen)试剂盒将纯化后的RNA样品反转录为cDNA。

从美国能源部联合基因组研究所网站(www.jgi.doe.gov)获得基因组序列数据用于设计定量反转录PCR(qRT-PCR)引物，主要关注的基因包括助阳离子扩散体(CDF)家族的cdf1(GSU0487)、cdf2(GSU2613)，抗瘤细胞分裂蛋白(RND)家族的czcA1(GSU3400)、czcA2(GSU0830)和P型ATP酶(P-type ATPase)家族的copZ(GSU1338)、copA(GSU2452)(见表1)。然后，以上述反转录的cDNA为模版，用7500 qPCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR扩增和检测，并用已知浓度的纯化cDNA做系列稀释，构建覆盖6个数量级的标准曲线。

构建copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株采用基因重组方法^[11]，对G. sulfurreducens DL1的copZ基因的上游和下游各约500 bp的区域设计PCR引物(见表2)，并在上游后引物的3′端和下游前引物的5′端添加AvrII(CCTAGG，NEB)限制性酶切位点。对copZ基因的上游和下游区间进行高保真的JumpStart AccuTaq LA DNA聚合酶(Sigma-Aldrich)的PCR扩增，产物用AvrII限制性核酸内切酶(NEB，Beverly，MA)消化，乙醇沉淀，并与T4 DNA连接酶(NEB)连接。然后将连接反应混合物的约1 kb长度的产物条带进行琼脂糖凝胶回收Qiaquick凝胶提取试剂盒Qiagen)，并连接到pCR2.1 TOPO克隆载体中，形成PCR2.1上游5′+3′下游质粒，通过Sanger测序以验证克隆产物的序列。然后提取测序结果完全准确的克隆子的质粒载体，再用AvrII限制性核酸内切酶消化，用T4 DNA连接酶将消化产物与同样用AvrII酶切处理过的庆大霉素抗性基因片段连接形成PCR2.1上游5′+庆大霉素抗性基因+3′下游质粒，测序验证质粒序列的准确性。接着用限制性内切酶KpnI (GGTACC，NEB)对上述构建的质粒进行酶切使质粒线性化。线性化的质粒通过电转进入G. sulfurreducens菌株的感受态细胞，方法见文献[9]。最后，利用厌氧手套箱中制备的已添加了20 μg·mL⁻¹庆大霉素的NBAF固体培养基筛选copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株，并通过PCR检验copZ基因是否被替换成功。

反应体系由2组双极室MFC组成，阴阳两极室的容积均为250 mL，并由质子膜(CMI；CMI7000，Membranes International Inc.，美国)隔开。每升阴阳极溶液含0.42 g KH₂PO₄、0.22 g K₂HPO₄、0.20 g NH₄Cl₂、0.38 g KCl、0.36 g NaCl、0.04 g CaCl₂·2H₂O、0.10 g MgSO₄·7H₂O、1.80 g NaHCO₃、0.50 g Na₂CO₃，以及1 mmol·L⁻¹的Na₂SeO₄溶液10 mL、10 mL 微量矿物质溶液和15 mL 维生素溶液^[9]。阳极室培养液中还加入10 mmol·L⁻¹乙酸作为唯一电子供体。配制时将以上组分溶解于800 mL去离子水中，溶解后定容至1 L，各取200 mL溶液并用N₂∶CO₂=80∶20的混合气曝气30 min。阳极室用丁腈橡胶塞密封以保证厌氧环境，并利用磁力搅拌器进行搅拌。阴阳极均为石墨棒电极(Φ 6 mm×80 mm)，参比电极为饱和甘汞电极(相对标准氢电势为+199 mV)。分别在2组MFC的阳极室接种野生型G. sulfurreducens和copZ基因缺失型G. sulurreducens。通过电化学工作站(ChI1030C，上海辰华仪器有限公司)控制阳极电势为+300 mV，同时监测2组MFC的输出电流。

根据助阳离子扩散体(CDF)家族、抗瘤细胞分裂蛋白(RND)家族、P型ATP酶家族这3种已知金属转运机制，选取了G. sulfurreducens对Ag⁺耐受性可能相关的助阳离子扩散体(CDF)家族的cdf1/cdf2基因、抗瘤细胞分裂蛋白(RND)家族的czcA1/czcA2基因和P型ATP酶家族的copA/copZ基因进行研究。分别在不加Ag⁺和已添加0.05 mmol·L⁻¹ Ag⁺条件下，对野生型G. sulfurreducens的上述基因的转录量进行比较分析，结果如图1所示。

由图1可见，Ag⁺的存在对cdf1和czcA1的表达量影响较小，可推测这2种基因与G. sulfurreducens对Ag⁺解毒特性的相关性并不大。在Ag⁺浓度为0.05 mmol·L⁻¹ 的条件下，Ag⁺的存在对cdf2与czcA2的表达量有一定影响，cdf2与czcA2的表达量分别增加了3.5倍与4.2倍。而对于与P-ATPase家族相关的copZ和copA基因，在Ag⁺的浓度为0.05 mmol·L⁻¹的培养条件下，其表达量分别提升了24.8倍与8.1倍。copZ基因的表达量变化受Ag⁺的影响更为明显。

由copZ基因所编码的CopZ蛋白是一种金属伴侣蛋白，其在多种细菌如海氏肠球菌^[12](Enterococcus hirae)、枯草芽孢杆菌^[13](Bacillus subtilis)等耐受某种特定重金属(如Cu²⁺)的过程中发挥了重要作用。由此可推测，copZ对Ag⁺的响应相比于其他重金属转运相关基因更为显著，可能调控了G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受能力。

为进一步证实copZ基因在G. sulfurreducens耐受Ag⁺过程中的关键作用，本研究通过同源重组的方式构建了copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株，且在不同Ag⁺浓度的培养条件下，分别研究了野生型与copZ基因缺失型的G. sulfurreducens菌株对Ag⁺耐受浓度阈值，结果如图2所示。

由图2(a)可知，野生型G. sulfurreducens菌株对Ag⁺浓度耐受能力较强，当Ag⁺浓度为0~0.075 mmol·L⁻¹时，G. sulfurreducens菌株生长速率可保持在0.10 h⁻¹左右。随着Ag⁺浓度的增大，G. sulfurreducens菌株生长速率虽有下降，但在Ag⁺浓度增大至1.00 mmol·L⁻¹时，菌株生长速率仍能达到0.046 h⁻¹。其他细菌，如埃希大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)对Ag⁺的耐受浓度仅为 7×10⁻⁴~9×10⁻⁴ mmol·L^−1[14]，由此说明，野生型G. sulfurreducens对Ag⁺有很强的耐受能力。

然而，从图2(b)可知，当copZ从G. sulfurreducens的基因组中敲除后，G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受能力显著下降。在Ag⁺浓度高于0.01 mmol·L⁻¹时，copZ基因缺失型菌株的生长受到明显抑制，生长速率低于0.013 h⁻¹，仅为野生型G. sulfurreducens菌株在Ag⁺浓度为1.00 mmol·L⁻¹培养条件下的33.3%。由此可见，copZ的缺失使G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受浓度阈值降低了约100倍，也证实了copZ参与了G. sulfurreducens对Ag⁺耐受能力的调控。由于copZ的高表达协助了G. sulfurreducens菌株对Ag⁺的解毒，从而保证了其生长速率，而缺失了copZ的G. sulfurreducens菌株的生长则受到了Ag⁺毒性的抑制。

G. sulfurreducens具有出色的产电能力。分别构建接种野生型与copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株的MFC体系，通过对比2组MFC的电化学性能，探究copZ的缺失对于G. sulfurreducens产电能力的影响，同时在稳定运行24 h后，向2组MFC阳极室加入0.05 mmol·L⁻¹的Ag⁺，研究Ag⁺的存在对2种G. sulfurreducens菌株产电能力的影响，结果如图3所示。

由图3可见，当体系中不存在Ag⁺时，2种菌株产电性能差别不大，体系输出电流均为0.29 mA左右。当体系运行24 h时加入0.05 mmol·L⁻¹Ag⁺后，接种野生型G. sulfurreducens菌株的MFC体系电流出现了短暂下降，后又回升至原来的电流水平。这可能是由于Ag⁺的出现对于MFC阳极中的G. sulfurreducens细胞产生了一定毒害作用，但由于copZ基因的存在，野生型G. sulfurreducens可以实现Ag⁺的解毒，适应该Ag⁺浓度下的生存环境，使MFC体系电流又得以恢复。然而，加入0.05 mmol·L⁻¹Ag⁺后，接种了copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株的MFC系统的电流持续下降，表明基因缺失型G. sulfurreducens菌株的产电能力受到了外加Ag⁺的影响，且无法自我恢复。当体系运行到90 h后，体系电压由加入Ag⁺前的0.29 mA下降到加入Ag⁺后的0.27 mA，下降了6.99%。

copZ基因编码的金属伴侣CopZ蛋白与P-ATPase金属转运机制密切相关，当CopZ蛋白与金属结合后能够促进其外排^[15]。根据前文叙述的实验结果，当环境中Ag⁺浓度超过G. sulfurreducens细胞的适应范围时，野生型菌株可通过细胞质中的CopZ蛋白将Ag⁺运送到跨膜金属结合位点上，激活基于P-ATPase的Ag⁺转运机制，从而保持细胞内Ag⁺浓度的稳定，继而维持自身的生长与生命活动。在此过程中，copZ基因通过调控CopZ蛋白的表达影响了G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受。

低浓度Ag⁺对copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株的产电能力会产生影响，进而改变MFC的输出电压。因此，copZ基因对G. sulfurreducens的Ag⁺毒性的解毒起到了关键作用，也展现了Geobacter型MFC在实际含Ag⁺废水中潜在的应用可行性。另一方面，通过多基因敲除构建出对痕量Ag⁺极其敏感的G. sulfurreducens工程菌株，可以利用接种该菌株的MFC系统构建生物电化学传感器，对自然水环境中的Ag⁺污染通过电信号进行实时监测。该设想的可行性还有待后续研究证实。

1)野生型G. sulfurreducens对Ag⁺有较强的耐受能力，在Ag⁺浓度高达1 mmol·L⁻¹时仍能保持一定的生长速率，在含Ag⁺废水的处理领域具有潜在的应用潜力。

2) cdf2和czcA2基因与G. sulfurreducens对Ag⁺耐受作用的相关性较弱，而与P-ATPase家族相关的copZ和copA基因对Ag⁺的响应较强，表现出与G. sulfurreducens对Ag⁺耐受作用更强的相关性。copZ基因在G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受过程中起到关键作用，该基因通过调控CopZ蛋白的表达影响了G. sulfurreducens对Ag⁺的耐受。

3) copZ基因的缺失不影响野生型G. sulfurreducens MFC的产电能力，但Ag⁺会对接种了copZ基因缺失型G. sulfurreducens菌株的MFC的产电能力造成较大影响，且短时间内无法自我恢复。