马铃薯淀粉废水资源化制备<i>Paenibacillus polymyxa</i>农用菌剂

刘浩; 李瑞; 包丽君; 王分分; 张旭坡; 曲东; 白志辉

doi:10.12030/j.cjee.202006179

马铃薯淀粉废水资源化制备Paenibacillus polymyxa农用菌剂

1.
西北农林科技大学资源环境学院，杨凌 712100
2.
中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085
3.
中国科学院生态环境研究中心，环境生物技术重点实验室，北京 100085
4.
中国科学院大学资源与环境学院，北京 100049
5.
河北科技大学环境科学与工程学院，石家庄 050018

作者简介: 刘浩(1988—)，男，博士研究生。研究方向：微生物肥料。E-mail：lh880330@qq.com

通讯作者: 白志辉(1971—)，男，博士，研究员。研究方向：环境生物技术。E-mail：zhbai@rcees.ac.cn

基金项目:
国家水体污染控制与治理科技重大专项(2018ZX07110)；国家重点研发计划项目(2016YFC0501400)
中图分类号: X703.1

Production of Paenibacillus polymyxa biofertilizer using potato starch wastewater for vegetable cultivation

1.
College of Resource and Environment, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
2.
State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
3.
Key Laboratory of Environmental Biotechnology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
4.
College of Environment & Resources, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
5.
College of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China

Corresponding author: BAI Zhihui, zhbai@rcees.ac.cn

摘要: 马铃薯淀粉废水中含有高浓度的淀粉、蛋白质等有机物。利用马铃薯淀粉废水培养植物促生菌，是实现其资源化利用的方法。采用单因素方法结合中心复合设计(CCD)的方法，对废水体积分数(浓度)、培养温度、初始pH这3个因素进行研究，优化马铃薯淀粉废水培养Paenibacillus polymyxa EBL06菌株的适宜生长条件。实验得到马铃薯淀粉废水培养P. polymyxa的最佳条件：废水COD为13.7 g·L⁻¹，初始pH为7.17，培养温度为31.4 ℃。该条件下，培养21 h后，微生物活菌数为6.2×10⁹ cfu·mL⁻¹，与模型预测结果基本一致，可以达到《农用微生物菌剂国家标准》 (GB 20287-2006)。为了验证该菌剂的应用效果，进行了蔬菜种植实验。结果表明：P. polymyxa菌剂能有效提高小白菜的产量与品质，作物鲜重、干重、株高，以及维生素C含量别提高了68.6%、13.7%、5.6%、41.3%；相比于只施用化肥的组，菌剂同尿素的混施能提高氮肥的利用效率，小白菜植株中维生素含量提高了25.3%、硝酸盐含量减少了15.3%。以上研究结果可为马铃薯淀粉废水的资源化利用，以及P. polymyxa菌剂的应用推广提供参考。
- 马铃薯淀粉废水 /
- Paenibacillus polymyxa /
- 植物促生菌 /
- 中心复合设计(CCD) /
- 微生物肥料
Abstract: Potato starch wastewater contains high concentration of starch, protein and other organic matter. Using potato starch wastewater to cultivate plant growth-promoting bacteria is a method to realize its resource utilization. The growth conditions of Paenibacillus polymyxa EBL06 strain cultured in potato starch wastewater were optimized using a comibined single-factor and central composite design (CCD) approach, in which three key factors, i.e., wastewater volume fraction (concentration), culture temperature and initial pH, were focused. In this context, the optimum conditions for the culture of P. polymyxa obtained from the experiment were as follows: COD concentration 13.7 g·L⁻¹, initial pH 7.17, culture temperature 31.4 ℃. Under this condition, the number of living bacteria was 6.2×10⁹ cfu·mL⁻¹, which was consistent with the CCD predictions, and satisfying the national standard of agricultural microbial agents (GB 20287-2006). To verify the application effect of the microbial agent, the experiment of vegetable planting was then carried out. The results showed that the P. polymyxa biofertilizer could significantly increase the yield and quality of pakchoi; its fresh weight, dry weight, plant height and vitamin C content increased by 68.6%, 13.7%, 5.6% and 41.3%, respectively; compared with the fertilization of chemical fertilizer only, the mixed fertilization of P. polymyxa biofertilizer and urea fertilizer could improve the nitrogen utilization efficiency, and resulted in an increment in the content of vitamin in pakchoi plant by nearly 25.3%, and meanwhile, contributed to an decrease in the content of nitrate decreased by 15.3%. Overall, this study provides a meaningful reference for the resource utilization of potato starch wastewater, as well as the application and popularization of P. polymyxa.
- potato starch wastewater /
- Paenibacillus polymyxa /
- plant growth-promoting bacteria /
- central composite design (CCD) /
- biofertilizer

土地资源是地球圈层中生命活动的空间载体，是人类社会可持续发展的重要基础资源，因此土壤资源的保护是环境领域重点关注的对象。由于受到人类活动的广泛影响，全球范围内绝大多数的土壤均受到不同程度的重金属元素污染，涉及耕地、建设用地、海底沉积物等，这些有害重金属元素通过土壤-植物-人体或者土壤-水-人体方式进入人体，危害人体健康，土壤生态环境问题越来越受到政府部门和科研工作者的关注^[1-8]。

目前军事地质在生态环境保护方面的研究包括两个方面，一是过去战争对战区环境的遗留影响评估。二是在军事基地内开展的军事训练及武器装备测试对周围生态环境的影响评价^[9-10]。近年来对军事活动区的生态环境研究较为广泛，得到了很多学者的关注。国外很早就开展了射击场土壤重金属的环境化学行为、健康风险分析和污染治理与修复技术等方面的研究^[11-14]。近些年来，国内学者也相继发表了有关军事环境的研究成果，如含砷高危废旧弹药销毁中易造成水质污染^[15]，轻武器射击（步枪或手枪）靶场表层土壤存在重金属元素Pb、Cu、Hg、Sb污染，并且Pb、Cu、Sb具有较高的迁移性和生物利用性，对周围环境和人体健康具有潜在的毒理^[16-17]。报废弹药烧毁作业环境废气污染治理研究^[18]。由此可见，战场环境弹药的使用和弹药的销毁对所在环境产生了严重的破坏，特别是重金属在土壤中受进一步的风化作用后，在垂向和侧向迁移，会危害到周边土壤、地下水、地表河流水质和农田耕地土壤等，甚至危害人体和家畜健康。因此重金属对土壤的污染越来越引起人们的高度重视。

前人的研究多集中在轻武器射击靶场（步枪或手枪）和报废弹药销毁场地的重金属污染研究方面，对类似高寒山区重武器（火炮、榴弹炮、坦克炮）射击靶场的研究还尚未涉及。由于重武器与轻武器在弹壳材质、火药容量和类型、弹药爆破对土壤的破坏程度等方面截然不同，同时，对于该军事训练场的环境研究仅限于有害生物监测与喷雾器械的应用方面^[19]，并未涉及到重武器射击对土壤重金属污染方面。因此，本文通过在西藏某军事训练场炮弹靶场与背景区系统采集土壤样品，并通过试验分析测试其重金属元素含量，利用统计分析原理，对炮弹靶场土壤重金属元素富集特征、污染来源、生态风险等级进行深入研究，从而为军事训练场地土壤环境质量评价和生态修复提供理论支撑。

1. 材料与方法(Materials and Methods)

1.1 研究区概况

本次研究工作区位于西藏某综合军事训练场。隶属于西藏自治区拉萨市当雄县，地处藏北高寒山地，平均海拔4300 m，炮弹靶场面积约0.66 km²，属高原温带季风半湿润气候与高原亚寒带季风半干旱气候的过渡带，气候湿润，日照充足。年平均气温2.1 ℃，土壤类型为砂土和黏土，平均厚度大于5 m，土壤表层主要生长高寒草甸。该军事训练靶场主要开展重武器射击活动，如榴弹炮、坦克炮、火箭炮等。

1.2 样品采集

本次调查在工作区共采集29件土壤样品，样点间距80 m，采样深度为0—20 cm、采用手持式GPS对采样点进行标定，采用组合样法采集，即一个样品在设计点位20—30 m范围内3—5处多点采集组合而成。为了便于分析和进行对比，采用对比对照的方式采集土壤样品，在炮弹靶场采集25件土壤样品，样品主要采自炮弹着落点附近。在邻近炮弹打击区的东侧背景区采集4件土壤样品作为对照样品（图1）。采集时，避开草根，碎石等杂物。经自然风干、研磨后，过2 mm（20目）的尼龙筛，混合均匀后装入样品带，样品重量大于150 g，最后送往实验室进行分析测试。

图 1 研究区采样点位图

Figure 1. Sampling point of study area

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1.3 样品分析

土壤样品的分析测试由国土资源部成都矿产资源监督检测中心完成。严格按照《地质矿产实验室测试质量管理规范》(DZ/T 0130-2006)^[20]的要求开展分析测试工作。基本样品分析29件，国家一级标准物质样品分析3件，重复样品分析3件。元素As和Hg采用原子荧光光谱仪（AFS）测定，Cd、Cu、Ni、Pb电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定，Cr和Zn采用X射线荧光光谱仪（XRF）测定。各元素标准物质合格率均为100%；各元素报出率均为100%；各元素重复性检验合格率均为100%（表1）。

表 1 土壤样品分析方法、检出限、分析质量

Table 1. analysis method, detection limit, analysis quality of Soil sample

指标Index	检测方法Detect method	检出限/（mg·kg⁻¹)Detection limit	标准物质合格率/%Qualified rate of standard substance	重复样合格率/%Qualified rate of repeated samples
Cd	ICP-MS	0.03	100	100
Hg	AFS	0.0005	100	100
As	AFS	0.5	100	100
Pb	ICP-MS	2	100	100
Cr	XRF	2.5	100	100
Cu	ICP-MS	1	100	100
Ni	ICP-MS	2	100	100
Zn	XRF	4	100	100

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1.4 数据处理

主要运用Microsoft Excel 2010和SPSS20.0进行数理统计分析工作，利用Origin2021进行图件制作。

2. 结果与讨论（Results and discussion）

2.1 土壤重金属元素含量特征

为了比较炮弹打击对土壤中重金属元素含量的影响作用，对研究区炮弹靶场和背景区分别统计重金属元素的地球化学参数，如表2所示。由统计数据可知，炮弹靶场表层土壤pH平均值为7.01，土壤酸碱度为中性，背景区土壤pH平均值为6.47，为弱酸性。炮弹靶场表层土壤8项重金属元素Cd、Hg、As、Pb、Cr、Cu、Ni、Zn的平均值分别为：0.2、0.021、50.59、46.38、43.89、39.76、23.4、93.92 mg·kg⁻¹。背景区Cd、Hg、As、Pb、Cr、Cu、Ni、Zn的平均值分别为0.35、0.025、23.88、63.73、51.25、23.5、27.7、145.55 mg·kg⁻¹。从研究区各重金属元素含量平均值可以看出，炮弹靶场元素Cd、Pb、Cr和Zn含量低于背景区土壤含量，炮弹靶场As和Cu的平均含量显著高于背景区土壤含量，其中炮弹靶场As的含量是背景区的2.1倍，Cu含量是背景区的1.7倍。

表 2 研究区表层土壤重金属元素含量（mg·kg⁻¹）统计参数

Table 2. Statistical parameters of heavy metal elements in surface soil of the study area（mg·kg⁻¹）

指标Index	炮弹靶场（25件）Artillery projectile range				背景区（4件）Background area
指标Index	最小值Minimum	最大值Maximum	平均值Average	变异系数Variable coefficient	平均值Average
Cd	0.1	0.62	0.20	0.59	0.35
Hg	0.015	0.029	0.021	0.21	0.025
As	25.2	122	50.39	0.46	23.88
Pb	37.2	66.9	46.38	0.15	63.73
Cr	29.1	56.4	43.89	0.14	51.25
Cu	20.6	116	39.76	0.45	24.03
Ni	18.8	28.8	23.6	0.12	23.70
Zn	71.1	142	93.92	0.21	145.55
Co	7.99	12.5	10.60	0.10	11.18
Mn	497	696	594.96	0.09	792.00
F	455	616	518.60	0.08	521.75
S	88.3	264	158.02	0.31	231.00
TFe₂O₃	3.8	5.25	4.41	0.08	5.03
pH	6.56	7.4	7.01	0.03	6.47

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元素含量变异系数可以表征元素含量的数值离散程度大小，在一定程度上可以反映元素受人为干扰的程度，通常分为弱变异（CV＜0.1）、中等变异（0.1≤CV＜1）、强变异（CV≥1）^[3-4]。研究区炮弹靶场土壤重金属元素的变异系数（CV）大小顺序为1＞Cd＞As＞Cu＞Zn＞Hg＞Pb＞Cr＞Ni＞0.1。属于中度变异，表明所有重金属元素在炮弹靶场污染程度空间分异性中等，受外界干扰中等，而Cd、As、Cu的变异系数接近0.5，远超其他重金属元素。

2.2 土壤重金属富集特征

富集因子是评价土壤中相应元素富集程度的重要指标，用于分析和判断人为活动与自然过程对土壤中元素含量的贡献水平^[21-22]。一般选用在地壳中稳定存在、化学性质相对惰性、含量相对较高的元素作为参考元素，富集因子的计算公式如下：

$\mathrm{E}\mathrm{F}=\frac{{({C}_{i}/{C}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{f}})}_{\mathrm{样}\mathrm{品}}}{{({B}_{i}/{B}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{f}})}_{\mathrm{背}\mathrm{景}}}$

式中，EF为富集因子；C_i表示样品中元素i的浓度，单位为mg·kg⁻¹；C_ref表示样品中选定的参比元素的浓度；单位为mg·kg⁻¹；B_i表示元素i的背景浓度，单位为mg·kg⁻¹，B_ref表示参比元素的背景浓度。由于TFe₂O₃在土壤形成过程中，化学性质相对惰性，同一地质背景下，其含量较为稳定，炮弹靶场和背景区TFe₂O₃的变异系数（CV）相等，本次以TFe₂O₃为参比元素，选择背景区的土壤重金属元素含量均值作为元素背景值。计算所有炮弹靶场土壤样品重金属元素富集因子EF值。按照Sutherland^[23]以富集因子划分富集程度，共分为五个等级，无富集（EF＜1.5）；弱富集（1.5＜EF＜3）；中等富集（3＜EF＜5）；中等显著富集（5＜EF＜10）；显著富集（10＜EF＜25）；非常显著富集（25＜EF＜50）极度富集（EF＞50）。

如表3和图2所示，该炮弹靶场土壤Cd富集因子均值为0.7，所有样品Cd为无—弱污染；Hg富集因子均值为1.0，所有样品Hg为无—弱污染；As富集因子均值为2.3，其中16件样品为无—弱污染，占比53.3%，13件样品为中污染，占比43.3%，1件样品为显著污染，占比3.4；Pb富集因子均值为0.9，所有样品Pb为无—弱污染；Cr富集因子均值为1，所有样品Cr为无—弱污染；Cu富集因子均值为1.8，其中23件样品为无—弱污染，占比76.6%，6件样品为中污染，占比20%，1件样品为显著污染，占比3.4%；Ni富集因子均值为1.0，所有样品Ni为无—弱污染；Zn富集因子均值为0.8，所有样品Zn为无—弱污染。以上表明该炮弹靶场重金属As和Cu达到中—显著富集程度，对应污染等级为中度—显著污染，其余重金属元素为无—弱污染，同时As和Cu的富集因子值离散程度远大于其他元素（图3）。

表 3 炮弹靶场土壤重金属元素富集程度统计表

Table 3. Statistical table of enrichment degree of heavy metal elements in artillery range soil

	EF＜2	2＜EF＜5	5＜EF＜20	20＜EF＜40	EF＞40
Cd	100%	0	0	0	0
Hg	100%	0	0	0	0
As	53.3%	43.3%	3.4%	0	0
Pb	100%	0	0	0	0
Cr	100%	0	0	0	0
Cu	76.6%	20%	3.4%	0	0
Ni	100%	0	0	0	0
Zn	100%	0	0	0	0

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图 2 土壤重金属元素富集程度箱线图

Figure 2. Box diagram of enrichment degree of heavy metal elements in soil

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图 3 炮弹靶区土壤重金属元素超标情况

Figure 3. The exceeding standard of heavy metal elements in soil of shell target area

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2.3 土壤重金属污染风险评价

参照《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》（GB15618-2018）^[24]，炮弹靶区土壤中As含量超过风险值的样品数为23件，超过管控值的样品数为1件；Cd含量超过风险值的样品有4件，Cu含量超过风险值的样品数为1件（图3），其它重金属元素含量均低于相应的风险筛选值。该重武器炮弹靶场表层土壤主要遭受重金属元素As、Cd、Cu的污染，对人类健康产生风险。其中As对人类的健康风险危害最为显著，这可能与炮弹中弹壳和弹药的金属含量有关。

2.4 土壤重金属含量的影响因素

土壤重金属污染源通常主要由自然背景源、人为源以及自然背景源与人为源的混合源组成。

2.4.1 成土母质

土壤是基岩经过一定的物理风化和化学风化作用形成的表层产物。成土母质即基岩的物质成分对土壤的化学成分起到决定作用。成土母质可以作为土壤重金属元素污染的自然源因素。研究区土壤的成土母质岩石主要由酸性火山碎屑岩夹多层安山岩和少量流纹岩组成，同时发育南北向构造断裂，形成区内Cd的强烈富集^[24]。前已述及，由于区内Cd的背景值为0.34 mg·kg⁻¹，与《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》（GB15618-2018）^[25]中Cd的风险筛选值（0.3 mg·kg⁻¹）接近。因此土壤Cd的污染风险主要由于区内土壤较高的背景值导致，以自然源为主。在地质作用过程中，Cu具有亲硫的地球化学行为，多与硫形成硫化物，如黄铜矿、铜绿等。自然土壤中Cu多以黄铜矿、硫酸铜的化合物，而该炮弹靶场土壤中重金属元素Cu与S无相关关系（图4h），表明Cu的污染更可能为人为源造成。

图 4 土壤中重金属元素关系散点图

Figure 4. Relationship scatter plot of heavy metals in soil

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2.4.2 人类活动的影响

炮弹的弹头、弹头碎片和其他相关材料多由金属材质制作而成，炮弹发射出后经过碰撞摩擦，爆炸，形成大量的金属碎片，经降水和土壤的腐蚀淋溶进入土壤中，当其含量超过一定的限值而达到污染土壤。该训练场炮弹靶场土壤的重金属元素As与Cu具有较好的正相关性（R²=0.95）（图4e），炮弹靶场土壤中As和Cu的含量高于背景区域。而As与土壤中的其他重金属元素无显著相关性（图4a、b、c、d、f、g）。说明土壤中As与Cu具有同源性。由于该靶场长期进行炮弹射击活动，发射的炮弹中含有大量的Cu、As等元素，因此该炮弹靶场的土壤中As和Cu的污染主要来源于炮弹等武器装备的试验活动。

前人对国内主要的轻武器射击靶场表层土壤的研究发现，轻武器射击靶场土壤重金属污染主要以元素Pb、Cu、Hg为主。而研究区属于重武器炮弹靶场，土壤重金属的污染以As和Cu为主。与传统轻武器射击靶场的重金属污染元素种类截然不同。轻武器射击靶场主要的射击活动为步枪或者手枪等轻型武器，所消耗的弹药主要为含铅的钢制弹头，含铅钢制弹头在射击出枪膛后，由于撞击变形、摩擦等形成碎块，弹头的表面积增大，进入土壤后更容易遭受风化，造成土壤的污染。而研究区属于坦克炮、榴弹炮、火箭炮等重型武器射击靶场，这些重武器的的火药量和金属材质与轻武器不同，使用了大量覆铜钢制弹壳和含砷火药。因此火炮着落炮炸后造成重金属元素As和Cu污染。炮弹着落后对着落点的土体产生剧烈的爆炸冲击力，造成土壤土质结构松散，加快了土壤的风化淋滤进程，更有利于土壤中部分重金属元素发生迁移，使得表层土壤Cd、Pb、Cr和Zn含量低于背景对照区土壤含量。

2.5 土壤重金属潜在生态风险评价

研究区土壤重金属潜在生态风险评价采用Lars Hakanson提出的潜在生态指数法（RI）进行评价^[26]。该方法将重金属含量、重金属的生态效应、环境效应和毒理学效应综合考虑，是目前生态风险评价中较为广泛的方法^[22]。

${\rm{RI}} =\sum _{\mathit{i}=1}^{\mathit{n}}{\mathit{E}}_{\mathit{r}}^{\mathit{i}}=\sum _{\mathit{i}=1}^{\mathit{n}}\left({\mathit{T}}_{\mathit{r}}^{\mathit{i}}\times \frac{{\mathit{C}}_{\mathit{i}}}{{\mathit{C}}_{\mathit{n}}^{\mathit{i}}}\right)$

式中， ${\mathit{E}}_{\mathit{r}}^{\mathit{i}}$ 为单项重金属元素潜在生态风险指数， ${\mathit{T}}_{\mathit{r}}^{\mathit{i}}$ 为某重金属元素的毒性相应参数， ${\mathit{C}}_{\mathit{i}}$ 为某重金属元素的实测值， ${\mathit{C}}_{\mathit{n}}^{\mathit{i}}$ 某重金属元素的参比值。由于研究区土壤的重金属元素含量的富集贫化主要受成土母质和地质背景的影响，因此，本次采用背景区土壤重金属含量的均值作为参比值。各重金属毒性响应参数为:Zn=1＜Cr=Mn＜Cu=Ni=Pb=5＜As=10＜Cd=30＜Hg=40，根据计算结果，将单因子潜在生态危害和总潜在生态风险危害分级（表4）。

表 4 潜在生态风险评价指标

Table 4. Index of Potential ecological risk evaluation

指数Index	生态危害 Ecological hazard
指数Index	轻微 Slight	中等 Medium	强 Strong	很强 Very strong	极强 Great
${\mathit{E}}_{\mathit{r}}^{\mathit{i}}$	＜40	40—80	80—160	160—320	＞320
$\mathrm{R}\mathrm{I}$	＜150	150—300	300—600	600—1200	＞1200

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通过对靶场25件表层土壤样品重金属元素统计分析（表5）可知，该炮弹靶场土壤中Pb、Cr、Cu、Ni、Zn单因子潜在生态风险指数均小于40，为轻微生态风险级别，Cd潜在生态风险指数为8.63—53.53、Hg潜在生态风险指数为23.53—47.06、As潜在生态风险指数为9.3—51.1，存在轻微-中等生态风险。其中Cd中等生态风险指数样品2件（占比8%），Hg中等生态风险指数样品9件（占比36%），As中等生态风险指数样品2件（占比8%）。因此区内土壤主要潜在生态危害重金属元素为Hg、As、Cd。靶场土壤总潜在生态风险指数RI为66.05—142.73，均小于150，存在轻微生态风险。区内长期的军事射击活动导致区内土壤Hg、As、Cd等重金属生态风险。

表 5 土壤重金属潜在生态风险指数分级统计表

Table 5. Classification Statistics of Potential Ecological Risk Index of Heavy Metals in Soil

生态危害指数Ecological Risk Index		统计值Statistic			各级样品数Number of samples at all levels
生态危害指数Ecological Risk Index		最小值Minimum	最大值Maximum	平均值Average	轻微Mild	中等Medium	强Strong	很强Very strong	极强Great
E_i	Cd	8.63	53.53	19.11	23	2	0	0	0
	Hg	23.53	47.06	34.24	16	9	0	0	0
	As	9.30	51.10	19.65	23	2	0	0	0
	Pb	2.92	6.73	3.83	25	0	0	0	0
	Cr	1.14	2.20	1.75	25	0	0	0	0
	Cu	4.29	24.14	7.82	25	0	0	0	0
	Ni	3.39	7.17	4.34	25	0	0	0	0
	Zn	0.49	1.31	0.69	25	0	0	0	0
RI		66.05	142.73	91.43	25	0	0	0	0

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3. 结论（Conclusion）

（1）该军事训练场炮弹靶场土壤重金属元素与背景区含量差异较大，As和Cu含量高于地区土壤背景值，元素Cd、Pb、Cr、Ni、Zn含量低于地区土壤背景区，元素Hg含量与背景区相近。

（2）与传统轻武器射击靶场重金属以Pb污染为主不同，炮弹等重武器靶场重金属As和Cu达到中—显著富集程度，对应污染等级为中度—显著污染，其余重金属元素为无—弱污染，部分样品重金属元素As、Cd、Cu超过风险值，1件样品重金属As超过管控值。该炮弹靶场重金属Cd的污染主要来源于高背景自然源，而As和Cu的污染主要源于炮弹射击试验活动中碎片弹壳炸裂导致的细碎残片导致。

（3）该靶场土壤以轻微潜在生态风险等级为主，仅Hg、As、Cd部分样品存在中等风险，占总样本数的百分比分别为36%、8%、8%。其主要受靶场射击试验等军事活动影响。

图 1 废水含量对P. polymyxa生长的影响

Figure 1. Effect of wastewater content on production of P. polymyxa

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图 2 初始pH对P. polymyxa生长的影响

Figure 2. Effect of initial pH value of media on production of P. polymyxa

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图 3 不同温度对P. polymyxa生长的影响

Figure 3. Effect of different temperature on production of P. polymyxa

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图 4 各因素对菌体活菌数响应面图及等高线

Figure 4. Response surface and contour plot showing influence on living cell value

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图 5 最佳条件下P. polymyxa生长曲线

Figure 5. Growth curve of P. polymyxa under the best fermentation conditions

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图 6 COD和pH随时间变化曲线

Figure 6. Time variation curves of pH and COD

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图 7 不同处理对蔬菜质量的影响

Figure 7. Effect of different treatments on weight of vegetables

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图 8 不同处理对蔬菜株高的影响

Figure 8. Effect of different treatments on plant height of vegetables

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图 9 不同处理对蔬菜硝酸盐含量的影响

Figure 9. Effect of different treatments on nitrate content of vegetables

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图 10 不同处理对蔬菜维生素C含量的影响

Figure 10. Effect of different treatments on vitamin C content of vegetables

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表 1 中心复合设计处理选项及结果

Table 1. Central composite design arrangements and responses

序号	pH		温度		废水体积分数		活菌数/(10⁹ cfu·mL⁻¹)
序号	实际值	设计层次	实际值/℃	设计层次	实际值/%	设计层次	实际值	预测值
1	7	0	40	1.682	50	0	4.9	4.52
2	5.81	−1	36.76	1	73.78	1	2.61	2.98
3	7	0	32	0	50	0	6.25	6.27
4	8.19	1	27.24	−1	73.78	1	4.36	3.95
5	7	0	32	0	50	0	6.56	6.27
6	5.81	−1	27.24	−1	26.21	−1	2.46	2.61
7	8.19	1	27.24	−1	26.21	−1	3.99	3.59
8	7	0	32	0	50	0	6.27	6.27
9	7	0	32	0	10	−1.682	2.37	2.25
10	7	−1.682	32	0	50	0	2.33	1.79
11	7	0	24	−1.682	50	0	4.46	4.87
12	5.81	−1	36.76	1	26.22	−1	2.37	2.76
13	7	0	32	0	50	0	6.34	6.27
14	5.81	−1	27.24	−1	73.78	1	2.32	2.27
15	7	0	32	0	50	0	5.8	6.27
16	7	0	32	0	90	1.682	2.61	2.74
17	7	0	32	0	50	0	6.39	6.27
18	9	1.682	32	0	50	0	2.41	2.96
19	8.19	1	36.76	1	26.22	−1	2.45	2.47
20	8.19	1	36.76	1	73.78	1	3.57	3.39

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表 2 P. polymyxa中心设计预测数据差异性分析

Table 2. Analysis of variance for the predictive equation for production of P. polymyxa biomass

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	p值	显著性
模型	52.72	9	5.86	30.22	< 0.000 1	显著
(A) pH	1.65	1	1.65	8.52	0.015 3	不显著
(B)温度	0.15	1	0.15	0.75	0.405 3	不显著
(C)稀释度	0.29	1	0.29	1.49	0.249 6	不显著
AB	0.80	1	0.80	4.15	0.069 1	不显著
AC	0.24	1	0.24	1.26	0.288 7	不显著
BC	0.16	1	0.16	0.83	0.383 4	不显著
A²	27.20	1	27.20	140.38	< 0.000 1	不显著
B²	4.46	1	4.46	23.02	0.000 7	不显著
C²	25.55	1	25.55	131.84	< 0.000 1	显著
残差	1.94	10	0.19
矢拟	1.61	5	0.32	4.89	0.053 1	不显著
误差	0.33	5	0.07
总和	54.65	19
注：变异系数(CV)=10.9%；决定系数R²=0.964 5；调整确定系数R²=0.932 6；预测确定系数R²=0.767 2。

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图( 10) 表( 2)

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1. 材料与方法(Materials and Methods)
1.1 研究区概况
1.2 样品采集
1.3 样品分析
1.4 数据处理
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 土壤重金属元素含量特征
2.2 土壤重金属富集特征
2.3 土壤重金属污染风险评价
2.4 土壤重金属含量的影响因素
2.5 土壤重金属潜在生态风险评价
3. 结论（Conclusion）

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Paenibacillus polymyxa是一类宿主广泛的植物促生菌(plant growth-promoting bacteria，PGPB)。由于它能分泌酶、植物激素、多肽类抗生素、功能蛋白等多种植物生理活性物质^[1]，对多种植物真菌、细菌等引起的植物病害具有较好的防治效果^[2]、兼有生物农药和微生物肥料双重作用，且对人或动植物无致病性，所以被广泛地用于促进作物生产。很多国家和组织将其认证为可用于农业生产并商业化的微生物^[3-4]。P. polymyxa EBL-06菌株能在植物的叶际和根际定殖，对多种病原菌都有拮抗作用，并且能促进植物生长。XU等^[5]通过生产P. polymyxa微生物肥料实现了红薯淀粉废水的资源化，探索出一种可行的高浓度有机废水资源化及生物肥料生产方法；该方法生产的微生物肥料有效提升了茶树的产量及茶叶的品质。

马铃薯淀粉废水是指在生产马铃薯淀粉的过程中产生的废液。每产出1 t马铃薯淀粉，就会排出20 t相关废水^[6]。马铃薯淀粉废水中含有大量淀粉、蛋白质、纤维素等有机物^[7]，属于无毒高浓度有机废水。其中，蛋白质含量为2~8 g·L⁻¹，COD为6~30 g·L⁻¹^[8]，SS为8.5~ 10 g·L⁻¹。废水具有高泡沫、高浓度、高浊度的“三高”特点^[9]。营养丰富的马铃薯淀粉非常适合作为微生物肥料开发材料^[10]。因此，将其用于微生物肥料的开发，既能减少环境污染、减轻废水处理压力，又可实现资源的再利用^[11-13]。席淑淇等^[14]利用马铃薯淀粉废水培养光合细菌生产胡萝卜素，废水COD减小了70%以上。田雅婕^[15]和黄峻榕等^[16]发现，通过培养微生物，可以有效回收马铃薯淀粉废水中的蛋白质，降低废水COD。关晓欢^[17]用马铃薯淀粉废水培养解淀粉芽孢杆菌，在初始pH为7.00~7.50、摇瓶机转速200 r·min⁻¹、温度为36 ℃的条件下培养24 h后，微生物活菌数为2.2×10⁹ cfu·mL⁻¹。

本研究筛选出马铃薯淀粉废水培养解淀粉芽孢杆菌的最佳条件，利用马铃薯淀粉废水培养P. polymyxa，实现了废水的资源化，并通过盆栽实验研究P. polymyxa菌肥对蔬菜生长及品质的影响，验证了P. polymyxa作为菌肥使用效果，以期为马铃薯淀粉废水的资源化利用，以及P. polymyxa的应用推广提供参考。

1. 材料与方法

1.1. 实验原料

选用同课题组GU等^[18]筛选自小麦叶际的P. polymyxa (EBL-06)作为菌株来源。使用的培养基为LB培养基。P. polymyxa发酵液活菌含量为6.5×10⁹ cfu·mL⁻¹。马铃薯淀粉废水为取自某马铃薯淀粉加工厂的新鲜高浓度废液。该废液的主要理化指标：pH为5.10，COD为26.7 g·L⁻¹，SS为24.7 g·L⁻¹, EC值为3.32 mS·cm⁻¹，TN为2.15 g·L⁻¹，TP为0.57 g·L⁻¹，总钾1.06 g·L⁻¹。选用小白菜“热抗605”作为盆栽实验作物，使用直径22 cm、高18 cm的塑料花盆进行盆栽实验。

1.2. 实验方法

种子液制备：在斜面上刮取一环菌落，利用四区划线法在LB固体培养基上培养单菌落；从固体培养基上挑取单菌落接种于LB液态培养基中；35 ℃下在转速为180 r·min⁻¹的摇床中培养16 h，即微生物对数生长期。活菌数的测定：使用稀释平板涂布法确定活菌数量。COD的测定：依据HJ/T 399-2007，使用消解分光光度法测量。硝酸盐和维生素C含量的测定：使用紫外分光光度法测定，分别在紫外区波长219 nm处和波长265 nm处测量硝酸盐和维生素含量。

1.3. 单因素实验

常规生产情况下，影响发酵结果的主要影响因素有：发酵温度、过程pH、通气量、培养时间:种子液接种量、发酵底物的浓度和营养组成等。实验选取废水浓度、发酵体系的初始pH和培养温度3个指标作为活菌数的影响因子，进行单因素初步优化^[19-20]。

取新鲜的高浓度马铃薯淀粉废水(COD为26.7 g·L⁻¹)，加水稀释后废水体积分数为60%(即0.60 L废水加上0.40 L超纯水制备)；制备5组不同pH梯度的马铃薯废水(各50 mL)，调节pH分别为5.00、6.00、7.00、8.00、9.00；115 ℃的高温下蒸汽灭菌20 min，然后自然降温到室温，并接种2%的P. polymyxa种子液；在恒温30 ℃、转速180 r·min⁻¹的摇床中培养24 h；最后测量各梯度的微生物活菌数。

制备体积分数为60%的马铃薯淀粉废水50 mL共5组，调节pH至8.00；115 ℃的高温下蒸汽灭菌20 min，自然降温后按2%接种量接种P. polymyxa种子液；以180 r·min⁻¹的转速，分别在24、28、32、36、40 ℃温度下进行摇床培养；24 h后测量各梯度的微生物活菌数。

制备5组浓度梯度的马铃薯淀粉废水各50 mL，废水体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%；调节pH至8.00，在115 ℃的高温下蒸汽灭菌20 min；自然降温后按接种2%的P. polymyxa种子液；最后在恒温30 ℃、转速180 r·min⁻¹的摇床中培养24 h，测量各梯度的微生物活菌数。

1.4. 中心复合实验设计

利用Design Expert 8.0软件中的中心复合设计实验^[21-22]，依据单因素实验结果，设计pH、废水体积分数、稀释度这3个影响因子的层次及范围，最终确定5个设计层次，共20组实验处理。表1为各组的处理详细信息。

1.5. 盆栽实验设计

将采集的土壤干燥过筛，随后将处理好的土壤分成42份，每份3.5 kg，分别装入盆栽花盆中。盆栽实验根据施肥不同分为7组处理：1) CK组，水500 mL；2) S组，稀释25倍的马铃薯淀粉废水500 mL(相当于0.09 g尿素)；3) C组，化肥常规施肥(每盆0.54 g尿素，相当于田间每亩投加30 kg尿素，水500 mL)；4) C+M组，常规施肥(每盆0.30 g尿素)+稀释50倍发酵液500 mL (相当于0.05 g尿素)；5) C+SM组，常规施肥(每盆0.3 g尿素)+灭菌发酵液稀释50倍500 mL(相当于0.05 g尿素)；6)H组，发酵液稀释25倍500 mL (相当于0.09 g尿素)；7) M组，发酵液稀释50倍500 mL (相当于0.05 g尿素)；8) L组，发酵液稀释100倍500 mL (相当于0.02 g尿素)。每个处理均有6个平行，每个平行中栽种5株实验作物。实验于8月下旬种植，10月上旬收获。

3. 结论

1)通过响应曲面法得到的马铃薯废水的最佳培养条件为：废水含量51.4%，初始pH 7.17，培养温度31.4 ℃。在该条件下培养21 h后，微生物活菌数为6.2×10⁹ cfu·mL⁻¹，基本吻合模型预测结果，产品满足国标要求。

2)盆栽实验结果表明，菌剂产品能有效提高蔬菜的产量与品质。与空白组相比，蔬菜的鲜重、干重、株高，以及维生素C含量分别提高了68.6%、13.7%、5.6%、41.3%。菌剂与尿素混施的效果最佳。相同氮量情况下，小白菜中维生素含量较纯尿素处理提高了25.3%，硝酸盐含量降低了15.3%。

3)利用马铃薯淀粉废水生产微生物菌剂的方法是可行的。菌剂既能保障作物产量，又能提升作物的品质。本研究可为马铃薯淀粉废水的处理与资源化利用，以及P. polymyxa菌剂的应用推广提供参考。

参考文献 (28)

马铃薯淀粉废水资源化制备Paenibacillus polymyxa农用菌剂

作者简介: 刘浩(1988—)，男，博士研究生。研究方向：微生物肥料。E-mail：lh880330@qq.com

通讯作者: 白志辉(1971—)，男，博士，研究员。研究方向：环境生物技术。E-mail：zhbai@rcees.ac.cn

Production of Paenibacillus polymyxa biofertilizer using potato starch wastewater for vegetable cultivation

Corresponding author: BAI Zhihui, zhbai@rcees.ac.cn

1. 材料与方法(Materials and Methods)

1.1 研究区概况

1.2 样品采集

1.3 样品分析

1.4 数据处理

2. 结果与讨论（Results and discussion）

2.1 土壤重金属元素含量特征

2.2 土壤重金属富集特征

2.3 土壤重金属污染风险评价

2.4 土壤重金属含量的影响因素

2.4.1 成土母质

2.4.2 人类活动的影响

2.5 土壤重金属潜在生态风险评价

3. 结论（Conclusion）

计量

出版历程

马铃薯淀粉废水资源化制备Paenibacillus polymyxa农用菌剂

通讯作者: 白志辉(1971—)，男，博士，研究员。研究方向：环境生物技术。E-mail：zhbai@rcees.ac.cn

English Abstract

Production of Paenibacillus polymyxa biofertilizer using potato starch wastewater for vegetable cultivation

Corresponding author: BAI Zhihui, zhbai@rcees.ac.cn

全文HTML

1.1. 实验原料

1.2. 实验方法

1.3. 单因素实验

1.4. 中心复合实验设计

1.5. 盆栽实验设计

2.1. 不同单因素对马铃薯淀粉废水中菌体生长的影响

2.2. 中心复合实验结果与分析

2.3. 生长曲线的测定及COD和初始pH随时间变化曲线

2.4. P. polymyxa菌剂对蔬菜生长与品质的影响

目录

全文HTML

1.1. 实验原料

1.2. 实验方法

1.3. 单因素实验

1.4. 中心复合实验设计

1.5. 盆栽实验设计

2.1. 不同单因素对马铃薯淀粉废水中菌体生长的影响

2.2. 中心复合实验结果与分析

2.3. 生长曲线的测定及COD和初始pH随时间变化曲线

2.4. P. polymyxa菌剂对蔬菜生长与品质的影响