马铃薯淀粉废水资源化制备<i>Paenibacillus polymyxa</i>农用菌剂

刘浩; 李瑞; 包丽君; 王分分; 张旭坡; 曲东; 白志辉

doi:10.12030/j.cjee.202006179

马铃薯淀粉废水资源化制备Paenibacillus polymyxa农用菌剂

1.
西北农林科技大学资源环境学院，杨凌 712100
2.
中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085
3.
中国科学院生态环境研究中心，环境生物技术重点实验室，北京 100085
4.
中国科学院大学资源与环境学院，北京 100049
5.
河北科技大学环境科学与工程学院，石家庄 050018

作者简介: 刘浩(1988—)，男，博士研究生。研究方向：微生物肥料。E-mail：lh880330@qq.com

通讯作者: 白志辉(1971—)，男，博士，研究员。研究方向：环境生物技术。E-mail：zhbai@rcees.ac.cn

基金项目:
国家水体污染控制与治理科技重大专项(2018ZX07110)；国家重点研发计划项目(2016YFC0501400)
中图分类号: X703.1

Production of Paenibacillus polymyxa biofertilizer using potato starch wastewater for vegetable cultivation

1.
College of Resource and Environment, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
2.
State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
3.
Key Laboratory of Environmental Biotechnology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
4.
College of Environment & Resources, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
5.
College of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China

Corresponding author: BAI Zhihui, zhbai@rcees.ac.cn

摘要: 马铃薯淀粉废水中含有高浓度的淀粉、蛋白质等有机物。利用马铃薯淀粉废水培养植物促生菌，是实现其资源化利用的方法。采用单因素方法结合中心复合设计(CCD)的方法，对废水体积分数(浓度)、培养温度、初始pH这3个因素进行研究，优化马铃薯淀粉废水培养Paenibacillus polymyxa EBL06菌株的适宜生长条件。实验得到马铃薯淀粉废水培养P. polymyxa的最佳条件：废水COD为13.7 g·L⁻¹，初始pH为7.17，培养温度为31.4 ℃。该条件下，培养21 h后，微生物活菌数为6.2×10⁹ cfu·mL⁻¹，与模型预测结果基本一致，可以达到《农用微生物菌剂国家标准》 (GB 20287-2006)。为了验证该菌剂的应用效果，进行了蔬菜种植实验。结果表明：P. polymyxa菌剂能有效提高小白菜的产量与品质，作物鲜重、干重、株高，以及维生素C含量别提高了68.6%、13.7%、5.6%、41.3%；相比于只施用化肥的组，菌剂同尿素的混施能提高氮肥的利用效率，小白菜植株中维生素含量提高了25.3%、硝酸盐含量减少了15.3%。以上研究结果可为马铃薯淀粉废水的资源化利用，以及P. polymyxa菌剂的应用推广提供参考。
- 马铃薯淀粉废水 /
- Paenibacillus polymyxa /
- 植物促生菌 /
- 中心复合设计(CCD) /
- 微生物肥料
Abstract: Potato starch wastewater contains high concentration of starch, protein and other organic matter. Using potato starch wastewater to cultivate plant growth-promoting bacteria is a method to realize its resource utilization. The growth conditions of Paenibacillus polymyxa EBL06 strain cultured in potato starch wastewater were optimized using a comibined single-factor and central composite design (CCD) approach, in which three key factors, i.e., wastewater volume fraction (concentration), culture temperature and initial pH, were focused. In this context, the optimum conditions for the culture of P. polymyxa obtained from the experiment were as follows: COD concentration 13.7 g·L⁻¹, initial pH 7.17, culture temperature 31.4 ℃. Under this condition, the number of living bacteria was 6.2×10⁹ cfu·mL⁻¹, which was consistent with the CCD predictions, and satisfying the national standard of agricultural microbial agents (GB 20287-2006). To verify the application effect of the microbial agent, the experiment of vegetable planting was then carried out. The results showed that the P. polymyxa biofertilizer could significantly increase the yield and quality of pakchoi; its fresh weight, dry weight, plant height and vitamin C content increased by 68.6%, 13.7%, 5.6% and 41.3%, respectively; compared with the fertilization of chemical fertilizer only, the mixed fertilization of P. polymyxa biofertilizer and urea fertilizer could improve the nitrogen utilization efficiency, and resulted in an increment in the content of vitamin in pakchoi plant by nearly 25.3%, and meanwhile, contributed to an decrease in the content of nitrate decreased by 15.3%. Overall, this study provides a meaningful reference for the resource utilization of potato starch wastewater, as well as the application and popularization of P. polymyxa.
- potato starch wastewater /
- Paenibacillus polymyxa /
- plant growth-promoting bacteria /
- central composite design (CCD) /
- biofertilizer

硝化菌是活性污泥体系中起硝化作用的主要因素，但硝化菌生长缓慢，易受外界环境影响，pH、温度、溶解氧(dissolved oxygen, DO)和C/N等会使硝化菌活性受到抑制^[1]。研究团队在对全国58座污水处理厂进行的全流程调研分析中发现，污水处理厂平均硝化速率仅为2.9 mg·(g·h)⁻¹(以VSS计)，远低于理论硝化速率4 mg·(g·h)⁻¹ (GB 50014-2006)。这可能是因为硝化菌易受环境影响导致菌体流失^[2]，因此，将硝化性能良好的活性污泥进行固定化处理具有重要意义。

硝化菌富集包括纯菌扩大培养和活性污泥富集培养2种主要培养方式^[3]。使用活性污泥富集法中的序批式间歇反应器(sequencing batch reactor, SBR)富集方法进行硝化菌富集时，具有成本低、菌种稳定、生物相容性好等优点，该富集方法通过调节水质中氨氮负荷，抑制异养型菌属的增长，促进硝化菌的繁殖，达到富集硝化菌的目的，即依靠硝化菌自我代谢提高硝化菌占比，但是富集效果相对较弱。

PVA水凝胶空间网络稳定，有丰富的孔隙结构，微生物亲和性好，可用作活性污泥包埋剂^[4]，但是PVA凝胶球总孔容相对较小且胶连过程中易发生曳尾现象。而聚氧化丙烯三醇是一种聚醚多元醇，常用作增韧剂^[5]，可用作凝胶球改性。

本研究通过基于降低C/N比的活性污泥富集法提高活性污泥硝化性能，并将驯化后的活性污泥制作成改性凝胶包埋颗粒，分析比较了改性材料性能和活性污泥在不同阶段的微生物群落变化及污泥活性指标，为研究活性污泥包埋颗粒在废水治理领域的可行性提供参考。

1. 材料与方法

1.1 活性污泥培养

以无锡市某市政污水处理厂好氧池活性污泥(activated sludge, AS)作为接种污泥，采用SBR反应装置进行培养驯化。驯化过程中，调节进水水质COD为300 mg·L⁻¹；TP为4 mg·L⁻¹；进水 ${\rm{NH}}_4^ +$ -N浓度以5 d为一周期，每周期进行一次调整，依次为25、35、45 mg·L⁻¹，通过此方式改变进水碳氮比，实现硝化菌的富集，并添加一些稀有元素，促进活性污泥中微生物更好地生长繁殖。培养过程中不断添加适量Na₂CO₃溶液，调节进水pH为7.5~8.5，以满足硝化菌最佳生存条件。

1.2 凝胶颗粒制备

实验选择PVA作为主要的包埋材料，添加少量的海藻酸钠(sodium alginate, SA)，以缓解PVA的附聚性，并添加少量PPT(PPT是一种聚醚多元醇，常用作增韧剂^[6])，改善凝胶球的机械强度和传质性能，同时通过延时包埋等方法来改善材料的水溶膨胀性。实验选择饱和硼酸CaCl₂溶液作为交联剂，通过NaHCO₃调节交联剂的pH，冷冻-解冻来增加固定化小球的强度，并采用Na₂SO₄溶液进一步交联，以减轻硼酸对微生物活性的影响。包埋颗粒的制备包括以下5个步骤。

1)将PVA(国药1799型)、去离子水分别以体积分数为10%和90%于烧杯中混合，采用电磁炉加热2~3 h，在加热过程中，须不断搅拌使溶液受热均匀，直至PVA颗粒完全溶解后，停止加热并冷却至室温。

2)驯化后的硝化污泥在3 000 r·min⁻¹条件下离心15 min，再用0.9% NaCl溶液冲洗，重复该操作2次。

3)将浓缩后的硝化污泥、SA、PPT以及静置后的混合物以体积比10:1:0.2:88.8混合均匀后，滴入含2%氯化钙的饱和硼酸溶液形成球形颗粒，于4 ℃冰箱中放置30 min交联固化，然后将颗粒滤出，用0.9% NaCl溶液清洗表面残留的硼酸溶液。

4)为增加包埋颗粒的机械强度，将颗粒在-20 ℃的冰箱里反复冻融3次。

5)冻融后的颗粒用去离子水清洗，放置于模拟生活污水中，于4 ℃条件下保藏待用。

1.3 分析方法

取约10 mL泥水混合液，50 W功率超声1 min，后向混合液中加入60 μL甲酰胺及5 mL NaOH溶液(1 mol·L⁻¹)，并于4 ℃条件下振荡3 h后，在4 ℃、10 000 r·min⁻¹条件下离心15 min，所得上清液用0.22 μm滤膜过滤，得到污泥的EPS。采用考马斯亮蓝法和蒽酮-硫酸比色法^[7]对胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)中蛋白(PN)和多糖(PS)含量进行测定。

将待测包埋凝胶球在纯水中曝气30 min，以去除颗粒内部及表面的氨氮，烧杯中配置一定氨氮浓度的模拟废水，颗粒与废水混合的体积比为1:4。调节溶液pH小于5，以抑制包埋颗粒的硝化反应；采用恒温水浴锅将烧杯中混合液温度控制在(30.0±0.1) ℃，采用磁力搅拌器确保溶液充分混合，测试氨氮浓度的变化，计算凝胶颗粒氨传质系数。将包埋颗粒与去离子水以1:4的体积比混合，盛满250 mL的溶氧瓶，持续通入氮气2 h，使包埋颗粒内部的溶解氧完全消耗，采用恒温水浴锅控制温度为(30.0±0.1) ℃，采用磁力搅拌器使溶液充分混合，溶解氧仪记录混合液中溶解氧的变化，计算凝胶颗粒氧传质系数。

在测定氨氧化速率(ammonia uptake rate, AUR)时，将活性污泥或含有活性污泥的物体放入到碘量瓶中，碘量瓶中加入适量NH₄Cl和NaHCO₃，曝气并维持DO约为2 mg·L⁻¹，同时不断搅拌，保证溶液与活性污泥混合均匀，通过测量碘量瓶中混合液在不同时间点的氨氮浓度，并结合混合液中活性污泥的浓度计算氨氧化速率。在测定比耗氧速率(specific oxygen uptake rate, SOUR)时，将活性污泥或含有活性污泥的物体放入到碘量瓶中，碘量瓶中加入模拟生活污水并充分曝气，然后将碘量瓶密封，同时不断搅拌，保证溶液与活性污泥混合均匀，通过测量碘量瓶中混合液在不同时间点的DO值，并结合混合液中活性污泥的浓度计算比呼吸速率。

污泥粒径采用BT-2003百特激光粒度分布仪分析系统测试；热重分析采用TGA5500型热重分析仪测试，温度为30~500 ℃，升温速率为10 ℃·min⁻¹；SEM采用SU8010型微生物扫描电镜测试；BET采用Belsorp-Max型全自动比表面及孔隙分布测定仪测试；DO浓度使用WTW FDO 925-3便携式多参数水质分析仪测试； ${\rm{NH}}_4^ +$ -N浓度采国标法^[8]测定；样品DNA的提取采用土壤基因组提取试剂盒(柱形，艾比根)，并送样到上海晶能生物有限公司完成16S rRNA基因的高通量测序和微生物群落分析。

2. 结果与讨论

2.1 活性污泥污泥特性及胞外聚合物的变化

由图1和表1可以看出，在不断提高进水中氨氮占比的条件下，活性污泥对氨氮的去除效率略有降低，由100%降低至92%，再降低至85%左右；但单位时间内氨氮的去除量在提升，由25 mg·L⁻¹提升至32 mg·L⁻¹，再提升至38 mg·L⁻¹，说明活性污泥的氨氮去除效果在驯化过程中得到了提高。经计算，经过15 d的驯化培养，活性污泥的AUR由2.044 mg·(g·h)⁻¹(以VSS计)提升至2.645 mg·(g·h)⁻¹，SOUR由19.317 mg·(g·h)⁻¹(以VSS计)提升至21.868 mg·(g·h)⁻¹。硝化性能较原活性污泥有了明显的提高，可以用作制备生物包埋凝胶球。

图 1 活性污泥氨氮去除性能

Figure 1. Removal performance of ammonia nitrogen by activated sludge

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表 1 驯化前后活性污泥生物活性

Table 1. Biological activity of activated sludge before and after domestication

阶段	MLSS/(mg·L⁻¹)	MLVSS/(mg·L⁻¹)	AUR/(mg·(g·h)⁻¹)	SOUR/(mg·(g·h)⁻¹)
驯化前	4 368	2 460	2.044	19.317
驯化后	4 008	2 387	2.645	21.868

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由图2和图3可以看出，EPS对活性污泥的理化性质有较大影响，蛋白和多糖是其主要成分。在驯化过程中，随着氨氮投加量的提高，水质C/N比不断降低，多糖和蛋白的浓度也均有不同程度降低，PN/PS不断提高。这是因为在低C/N条件下，由于碳源的缺乏，微生物将多糖用作营养物质分解使用。在驯化培养过程中，过量的曝气使活性污泥絮体破坏，导致活性污泥粒径相对减少，粒径分布向低粒径移动，中位径从最初的28.38 μm降低到27.09 μm。蛋白是微生物絮体骨架的重要成分，因此，蛋白含量也降低。C/N不断降低，微生物所需碳源增多，对多糖的消耗也增多。驯化过程中曝气程度保持稳定，在曝气过程中，活性污泥逐渐适应反应体系，蛋白降低幅度相对较小。因此，多糖降低幅度大于蛋白，PN/PS不断升高。

图 2 不同驯化阶段活性污泥粒径分布

Figure 2. Particle size distribution of activated sludge at different domestication stages

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图 3 驯化过程中活性污泥PN、PS变化

Figure 3. Changes of PN and PS in activated sludge during domestication

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2.2 改性凝胶颗粒理化性能

凝胶球半径约为3.4 mm，单颗凝胶球质量冻干前约为112.26 mg，冻干后约为33.85 mg，改性后粒径、质量与改性前大致相等。

由图4可以看出，在常温条件(30~50 ℃)下，凝胶颗粒质量损失极小，改性前后分别为1.1166%和0.8015%，说明凝胶颗粒常温下热稳定性能好。凝胶颗粒在435 ℃左右失重速率最大。等温条件下，改性凝胶球失重量和失重速率都比改性前小，说明改性后，凝胶颗粒热稳定性能有所提高。

图 4 凝胶球TG/DTG曲线

Figure 4. TG/DTG curve of gel ball

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图5为改性前后凝胶球扫描电镜图，放大倍数分别为1 000、5 000和10 000。可以看出，改性前孔隙结构比较松散，且孔径较大；而改性后，孔隙结构相对规整，且孔径大小略有降低，这与之后测得传质速率略有降低相符合。

图 5 电镜扫描图

Figure 5. Scanning electron microscopic images

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表2反映了未改性凝胶颗粒和PPT改性凝胶颗粒比表面积和孔径分布情况。可以看出，使用PPT改性后的凝胶球的比表面积和总孔容积增大，平均孔径减小，分别由0.315 m²·g⁻¹、0.004 cm³·g⁻¹和51.870 nm变为1.527 m²·g⁻¹，0.015 cm³·g⁻¹和39.362 nm。这说明PPT改性使凝胶包埋更加均匀，比表面积和总孔容也得到增加，能够包埋的微生物量也增多。周素红等^[9]研究发现，适合微生物附着生长的孔径以大孔和中孔为主，PPT改性凝胶颗粒孔径大小符合微生物生长条件。与谭炳琰等^[10]制备的PVA-SA水凝胶生物载体相比，PPT改性凝胶颗粒孔容与比表面积较小，孔径几乎相等，这说明PPT改性凝胶颗粒负载微生物量仍具有一定提升空间。许晓毅等^[11]研究表明，凝胶包埋颗粒比表面积增加可以增强包埋活性污泥生物硝化和脱氮性能。因此，PPT改性凝胶颗粒可以有效用作一种活性污泥包埋材料并应用于废水治理中。

表 2 改性包埋颗粒孔结构参数

Table 2. Pore structural parameters of modified embedded particles

样品	比表面积/(m²·g⁻¹)	总孔容积/(cm³·g⁻¹)	平均孔径/nm
未改性凝胶球	0.315	0.004	51.870
改性凝胶球	1.528	0.015	39.362

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包埋颗粒是一种多孔材料，凝胶颗粒内外物质会通过孔隙进行传输，直至达到平衡。氨氮和氧气是活性污泥新陈代谢必不可少的物质。氨、氧传质特性是凝胶颗粒能否用作活性污泥载体的重要评价指标。实验选取稳定运行的凝胶包埋颗粒，探究不同污泥投加方式对凝胶球氨、氧传质性能的影响。根据PU等^[12]的研究，凝胶颗粒内基质有效扩散系数D_e的计算模型见式(1)。

${D_{\rm{e}}} = \ln \left( {\frac{{6{C_{{\rm{b}}0}}a\left( {1 + a} \right)}}{{\left( {9 + 9a + {q_1}^2{a^2}} \right)\cdot\left( {{C_{\rm{b}}}\left( {1 + a} \right) - {C_{{\rm{b}}0}}a} \right)}}} \right)\cdot\frac{{{R^2}}}{{{q_1}^2t}}$

$(1)$

式中：D_e为有效扩散系数，m²·s⁻¹；C_b为主体溶液中基质的瞬时浓度，mg·L⁻¹；C_b0为主体溶液中基质的初始浓度，取50 mg·L⁻¹；a为液相体积与颗粒容积比，取值为4；q₁为非零正根；R为颗粒半径，取值为3.4×10⁻³ m。

为简化计算过程，将式(1)进行整理变换，变换后得式(2)。

$\ln (\frac{{{C_{\rm{b}}}\left( {1 + a} \right)}}{{{C_{{\rm{b}}0}}a}} - 1) = \ln (\frac{{6\left( {1 + a} \right)}}{{9 + 9a + {q_1}^2{a^2}}}) - \left( {\frac{{{D_{\rm{e}}}{q_1}^2}}{{{R^2}}}} \right)t$

$(2)$

图6反映了氨扩散实验结果，将拟合线代入式(2)得：空白凝胶球和PPT改性凝胶球的氨扩散系数D_e分别为4.867×10⁻¹⁰ m²·s⁻¹和4.463×10⁻¹⁰ m²·s⁻¹。

图 6 氨扩散实验结果及有效扩散系数的拟合

Figure 6. Ammonia diffusion experiments and the fitting curve of effective diffusion coefficient in immobilized particles

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图7反映了氧扩散实验结果，将拟合线代入式(2)得：空白凝胶球和PPT改性凝胶球的氧扩散系数D_e分别为2.108×10⁻¹⁰ m²·s⁻¹和1.838×10⁻¹⁰ m²·s⁻¹。

图 7 氧扩散实验结果及有效扩散系数的拟合

Figure 7. Oxygen diffusion experiments and the fitting curve of effective diffusion coefficient in immobilized particles

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由实验结果可知，添加改性剂后，凝胶球氨传质性能和氧传质性能均有不同程度的降低，这可能是由于凝胶球中添加改性材料时，凝胶球中总物质量增多，部分空隙被堵塞。曹国民等^[13]测得15%PVA空白凝胶膜中氨氮扩散系数为6.9×10⁻¹⁰ m²·s⁻¹。WIESMANN等^[14]验证包埋微生物空心球的氧扩散系数为1×10⁻¹⁰~10×10⁻¹⁰ m²·s⁻¹。本实验测得改性凝胶包埋颗粒的有效扩散系数均相对较低，原因可能是温度、搅拌条件以及载体成分等对凝胶包埋颗粒传质性能的影响。

2.3 凝胶包埋活性污泥微生物活性变化

如图8所示，包埋活性污泥后，凝胶颗粒颜色由纯白色变为黄灰色。半径约为3.4×10⁻³ m，质量约为114.027 mg。

图 8 凝胶颗粒形态图

Figure 8. Colloid particle morphology

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由表3可知，OTU数量和Chao指数呈现递增趋势，说明驯化培养过程中，在持续曝气和营养底物充足的条件下，污泥中微生物物种丰度得到提高；包埋后由于凝胶颗粒形成较好的厌氧、缺氧和好氧环境，兼氧菌和厌氧菌有效繁殖，微生物物种丰度大幅提高。在驯化培养过程中，Shannon和Shannoneven生物多样性指数降低，包埋成活性污泥后升高，说明驯化培养过程中，水体环境更适合好氧菌和自养菌生长繁殖，因此，微生物菌群多样性及相对均匀程度均降低；包埋成凝胶球后，在较好的厌氧、缺氧和好氧环境以及模拟废水充足碳源条件下，各类微生物菌群都得以充分生长繁殖，因此，微生物菌群多样性及相对均匀程度升高，菌群相对均匀。

表 3 Alpha多样性指数

Table 3. Alpha diversity indexes

样品	OTU	Chao	Shannon	shannoneven
初始污泥	1 322	1 518	5.14	0.71
活性污泥	1 392	1 636	4.90	0.67
凝胶包埋污泥	1 638	1 856	5.89	0.79

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由图9可知，3个样品中的细菌门都比较丰富，以Proteobacteria(变形菌)、Bacterioidetes(拟杆菌)、Planctomycetes(浮霉状菌)和Acidobacteria(酸杆菌)为主。其中Proteobacteria和Bacterioidetes是活性污泥系统中的功能性菌群，主要参与有机物的降解和脱氮除磷过程^[15]。Planctomycetes是一个独立的细菌门，其细胞壁缺少肽聚糖，通过细胞内膜(intracytoplasmic membrane, ICM)将细胞分为不同的部分^[16]。大量的证据表明，浮霉状菌与赤潮存在一定联系，如能形成玫瑰环的浮霉状菌(如Planctomyces bekefii、Planctomyces guttaeformis和Planctomyces stramskae)，在藻类或是蓝细菌的赤潮暴发后丰度上升^[17]，其中厌氧氨氧化菌(Anammox bacteria)是浮霉状菌中最有特点的一类菌，在环境氮循环中具有重要作用。凝胶包埋后，Acidobacteria占比略有提高，是因为凝胶包埋过程会加入一定量的硼酸试剂，而Acidobacteria是一种嗜酸菌。除此之外，Nitrospirae(硝化菌门)是活性污泥硝化反应的主要菌门，微生物群落门水平分析表明，3个阶段中Nitrospirae丰度分别为0.008、0.020、0.006，这是因为C/N低、DO高的环境适合硝化菌门的繁殖代谢，驯化培养后，硝化菌门大幅提高；但凝胶包埋后，功能性菌群在不断应对环境变化，引起微生物群落结构的改变，硝化菌门受到抑制，占比降低。

图 9 门水平的微生物菌群组成解析

Figure 9. Microbial community composition at phylum level

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由图10可知，属水平在活性污泥培养3个阶段中变化较大，其中Nitrospira(硝化菌属)和Nitrosomonas(亚硝化菌属)在活性污泥脱氮过程中起着重要作用，3个阶段中Nitrospira丰度分别为0.008、0.020、0.006，Nitrosomonas丰度分别为0、0.002、0.004均先上升后下降，这是因为驯化培养过程成效明显，硝化类菌属丰度大幅提升；包埋后硝化类菌属丰度有所下降，这可能是因为硼酸等不利环境使硝化菌活性受到抑制。

图 10 属水平的微生物菌群组成解析

Figure 10. Microbial community composition at genus level

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图11反映了包埋后凝胶颗粒的AUR和SOUR的变化情况。AUR和SOUR分别为2.418 mg·(g·h)⁻¹和18.929 mg·(g·h)⁻¹，与初始污泥相比，AUR显著升高，有18.28%的升幅，有利于水体氨氮的去除；SOUR略有下降，降低幅度为2.01%，这与包埋过程环境的改变有关。这是因为包埋过程中，投加硼酸、反复冻融等条件对微生物活性有一定的抑制作用，部分微生物不适应环境被淘汰。

图 11 凝胶包埋活性污泥AUR和SOUR

Figure 11. AUR and SOUR of Gel embedded activated sludge

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如图12和图13所示，刚制备好的凝胶球，由于制备过程中采用了硼酸等实验试剂，且为了增强凝胶球机械强度，在−20 ℃环境下反复冻融，均对活性污泥的微生物活性有一定程度的影响，因此，采用模拟废水对凝胶球进行微生物活性恢复实验，进行序批式实验，每12 h为一个实验周期，6个实验周期后，凝胶球颜色由刚制备好的石灰白转变为灰黑色。通过6个周期的活性恢复，凝胶球包埋活性污泥在1个运行周期内能够有效地去除15 mg·L⁻¹氨氮，包埋凝胶球中活性污泥的微生物活性得到有效恢复。

图 12 恢复活性凝胶颗粒形态

Figure 12. Morphology of gel particles after activity recovery

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图 13 恢复活性凝胶包埋活性污泥氨氮去除性能

Figure 13. Ammonia nitrogen removal performance of gel embedded activated sludge after activity recovery

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3. 结论

1)提高进水氨氮浓度，降低C/N比，可以使活性污泥中硝化菌含量增加，硝化性能得到提升，培养后的活性污泥AUR和SOUR分别由2.044 mg·(g·h)⁻¹和19.317 mg·(g·h)⁻¹提升至2.645 mg·(g·h)⁻¹和21.868 mg·(g·h)⁻¹，菌群分析结果显示，Nitrospirae相对丰度提升150%。

2)改性凝胶颗粒具有热稳定性好、孔容大、比表面积大等优点，可有效用作活性污泥包埋材料。改性后凝胶颗粒在常温下质量损失仅为0.802%，可以在常温下稳定运行；总孔容增加至0.015 cm³·g⁻¹，可以容纳更多的包埋物质；比表面积也增大至1.528 m²·g⁻¹，可以有效增加水体中物质与包埋活性污泥的接触概率。

3)凝胶包埋会使部分微生物死亡，但经过活性恢复后，硝化性能得到恢复，AUR显著升高，升幅达到18.28%，有利于水体氨氮的去除；而SOUR略有下降，但降低幅度仅为2.01%，这与包埋过程环境的改变有关。用恢复活性的凝胶包埋颗粒处理25 mg·L⁻¹的氨氮废水时，氨氮去除率达到70%左右，凝胶包埋颗粒污泥在氨氮废水治理中具有重要研究意义。-

图 1 废水含量对P. polymyxa生长的影响

Figure 1. Effect of wastewater content on production of P. polymyxa

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图 2 初始pH对P. polymyxa生长的影响

Figure 2. Effect of initial pH value of media on production of P. polymyxa

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图 3 不同温度对P. polymyxa生长的影响

Figure 3. Effect of different temperature on production of P. polymyxa

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图 4 各因素对菌体活菌数响应面图及等高线

Figure 4. Response surface and contour plot showing influence on living cell value

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图 5 最佳条件下P. polymyxa生长曲线

Figure 5. Growth curve of P. polymyxa under the best fermentation conditions

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图 6 COD和pH随时间变化曲线

Figure 6. Time variation curves of pH and COD

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图 7 不同处理对蔬菜质量的影响

Figure 7. Effect of different treatments on weight of vegetables

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图 8 不同处理对蔬菜株高的影响

Figure 8. Effect of different treatments on plant height of vegetables

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图 9 不同处理对蔬菜硝酸盐含量的影响

Figure 9. Effect of different treatments on nitrate content of vegetables

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图 10 不同处理对蔬菜维生素C含量的影响

Figure 10. Effect of different treatments on vitamin C content of vegetables

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表 1 中心复合设计处理选项及结果

Table 1. Central composite design arrangements and responses

序号	pH		温度		废水体积分数		活菌数/(10⁹ cfu·mL⁻¹)
序号	实际值	设计层次	实际值/℃	设计层次	实际值/%	设计层次	实际值	预测值
1	7	0	40	1.682	50	0	4.9	4.52
2	5.81	−1	36.76	1	73.78	1	2.61	2.98
3	7	0	32	0	50	0	6.25	6.27
4	8.19	1	27.24	−1	73.78	1	4.36	3.95
5	7	0	32	0	50	0	6.56	6.27
6	5.81	−1	27.24	−1	26.21	−1	2.46	2.61
7	8.19	1	27.24	−1	26.21	−1	3.99	3.59
8	7	0	32	0	50	0	6.27	6.27
9	7	0	32	0	10	−1.682	2.37	2.25
10	7	−1.682	32	0	50	0	2.33	1.79
11	7	0	24	−1.682	50	0	4.46	4.87
12	5.81	−1	36.76	1	26.22	−1	2.37	2.76
13	7	0	32	0	50	0	6.34	6.27
14	5.81	−1	27.24	−1	73.78	1	2.32	2.27
15	7	0	32	0	50	0	5.8	6.27
16	7	0	32	0	90	1.682	2.61	2.74
17	7	0	32	0	50	0	6.39	6.27
18	9	1.682	32	0	50	0	2.41	2.96
19	8.19	1	36.76	1	26.22	−1	2.45	2.47
20	8.19	1	36.76	1	73.78	1	3.57	3.39

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表 2 P. polymyxa中心设计预测数据差异性分析

Table 2. Analysis of variance for the predictive equation for production of P. polymyxa biomass

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	p值	显著性
模型	52.72	9	5.86	30.22	< 0.000 1	显著
(A) pH	1.65	1	1.65	8.52	0.015 3	不显著
(B)温度	0.15	1	0.15	0.75	0.405 3	不显著
(C)稀释度	0.29	1	0.29	1.49	0.249 6	不显著
AB	0.80	1	0.80	4.15	0.069 1	不显著
AC	0.24	1	0.24	1.26	0.288 7	不显著
BC	0.16	1	0.16	0.83	0.383 4	不显著
A²	27.20	1	27.20	140.38	< 0.000 1	不显著
B²	4.46	1	4.46	23.02	0.000 7	不显著
C²	25.55	1	25.55	131.84	< 0.000 1	显著
残差	1.94	10	0.19
矢拟	1.61	5	0.32	4.89	0.053 1	不显著
误差	0.33	5	0.07
总和	54.65	19
注：变异系数(CV)=10.9%；决定系数R²=0.964 5；调整确定系数R²=0.932 6；预测确定系数R²=0.767 2。

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图( 10) 表( 2)

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1. 材料与方法
1.1 活性污泥培养
1.2 凝胶颗粒制备
1.3 分析方法
2. 结果与讨论
2.1 活性污泥污泥特性及胞外聚合物的变化
2.2 改性凝胶颗粒理化性能
2.3 凝胶包埋活性污泥微生物活性变化
3. 结论

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Paenibacillus polymyxa是一类宿主广泛的植物促生菌(plant growth-promoting bacteria，PGPB)。由于它能分泌酶、植物激素、多肽类抗生素、功能蛋白等多种植物生理活性物质^[1]，对多种植物真菌、细菌等引起的植物病害具有较好的防治效果^[2]、兼有生物农药和微生物肥料双重作用，且对人或动植物无致病性，所以被广泛地用于促进作物生产。很多国家和组织将其认证为可用于农业生产并商业化的微生物^[3-4]。P. polymyxa EBL-06菌株能在植物的叶际和根际定殖，对多种病原菌都有拮抗作用，并且能促进植物生长。XU等^[5]通过生产P. polymyxa微生物肥料实现了红薯淀粉废水的资源化，探索出一种可行的高浓度有机废水资源化及生物肥料生产方法；该方法生产的微生物肥料有效提升了茶树的产量及茶叶的品质。

马铃薯淀粉废水是指在生产马铃薯淀粉的过程中产生的废液。每产出1 t马铃薯淀粉，就会排出20 t相关废水^[6]。马铃薯淀粉废水中含有大量淀粉、蛋白质、纤维素等有机物^[7]，属于无毒高浓度有机废水。其中，蛋白质含量为2~8 g·L⁻¹，COD为6~30 g·L⁻¹^[8]，SS为8.5~ 10 g·L⁻¹。废水具有高泡沫、高浓度、高浊度的“三高”特点^[9]。营养丰富的马铃薯淀粉非常适合作为微生物肥料开发材料^[10]。因此，将其用于微生物肥料的开发，既能减少环境污染、减轻废水处理压力，又可实现资源的再利用^[11-13]。席淑淇等^[14]利用马铃薯淀粉废水培养光合细菌生产胡萝卜素，废水COD减小了70%以上。田雅婕^[15]和黄峻榕等^[16]发现，通过培养微生物，可以有效回收马铃薯淀粉废水中的蛋白质，降低废水COD。关晓欢^[17]用马铃薯淀粉废水培养解淀粉芽孢杆菌，在初始pH为7.00~7.50、摇瓶机转速200 r·min⁻¹、温度为36 ℃的条件下培养24 h后，微生物活菌数为2.2×10⁹ cfu·mL⁻¹。

本研究筛选出马铃薯淀粉废水培养解淀粉芽孢杆菌的最佳条件，利用马铃薯淀粉废水培养P. polymyxa，实现了废水的资源化，并通过盆栽实验研究P. polymyxa菌肥对蔬菜生长及品质的影响，验证了P. polymyxa作为菌肥使用效果，以期为马铃薯淀粉废水的资源化利用，以及P. polymyxa的应用推广提供参考。

1. 材料与方法

1.1. 实验原料

选用同课题组GU等^[18]筛选自小麦叶际的P. polymyxa (EBL-06)作为菌株来源。使用的培养基为LB培养基。P. polymyxa发酵液活菌含量为6.5×10⁹ cfu·mL⁻¹。马铃薯淀粉废水为取自某马铃薯淀粉加工厂的新鲜高浓度废液。该废液的主要理化指标：pH为5.10，COD为26.7 g·L⁻¹，SS为24.7 g·L⁻¹, EC值为3.32 mS·cm⁻¹，TN为2.15 g·L⁻¹，TP为0.57 g·L⁻¹，总钾1.06 g·L⁻¹。选用小白菜“热抗605”作为盆栽实验作物，使用直径22 cm、高18 cm的塑料花盆进行盆栽实验。

1.2. 实验方法

种子液制备：在斜面上刮取一环菌落，利用四区划线法在LB固体培养基上培养单菌落；从固体培养基上挑取单菌落接种于LB液态培养基中；35 ℃下在转速为180 r·min⁻¹的摇床中培养16 h，即微生物对数生长期。活菌数的测定：使用稀释平板涂布法确定活菌数量。COD的测定：依据HJ/T 399-2007，使用消解分光光度法测量。硝酸盐和维生素C含量的测定：使用紫外分光光度法测定，分别在紫外区波长219 nm处和波长265 nm处测量硝酸盐和维生素含量。

1.3. 单因素实验

常规生产情况下，影响发酵结果的主要影响因素有：发酵温度、过程pH、通气量、培养时间:种子液接种量、发酵底物的浓度和营养组成等。实验选取废水浓度、发酵体系的初始pH和培养温度3个指标作为活菌数的影响因子，进行单因素初步优化^[19-20]。

取新鲜的高浓度马铃薯淀粉废水(COD为26.7 g·L⁻¹)，加水稀释后废水体积分数为60%(即0.60 L废水加上0.40 L超纯水制备)；制备5组不同pH梯度的马铃薯废水(各50 mL)，调节pH分别为5.00、6.00、7.00、8.00、9.00；115 ℃的高温下蒸汽灭菌20 min，然后自然降温到室温，并接种2%的P. polymyxa种子液；在恒温30 ℃、转速180 r·min⁻¹的摇床中培养24 h；最后测量各梯度的微生物活菌数。

制备体积分数为60%的马铃薯淀粉废水50 mL共5组，调节pH至8.00；115 ℃的高温下蒸汽灭菌20 min，自然降温后按2%接种量接种P. polymyxa种子液；以180 r·min⁻¹的转速，分别在24、28、32、36、40 ℃温度下进行摇床培养；24 h后测量各梯度的微生物活菌数。

制备5组浓度梯度的马铃薯淀粉废水各50 mL，废水体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%；调节pH至8.00，在115 ℃的高温下蒸汽灭菌20 min；自然降温后按接种2%的P. polymyxa种子液；最后在恒温30 ℃、转速180 r·min⁻¹的摇床中培养24 h，测量各梯度的微生物活菌数。

1.4. 中心复合实验设计

利用Design Expert 8.0软件中的中心复合设计实验^[21-22]，依据单因素实验结果，设计pH、废水体积分数、稀释度这3个影响因子的层次及范围，最终确定5个设计层次，共20组实验处理。表1为各组的处理详细信息。

1.5. 盆栽实验设计

将采集的土壤干燥过筛，随后将处理好的土壤分成42份，每份3.5 kg，分别装入盆栽花盆中。盆栽实验根据施肥不同分为7组处理：1) CK组，水500 mL；2) S组，稀释25倍的马铃薯淀粉废水500 mL(相当于0.09 g尿素)；3) C组，化肥常规施肥(每盆0.54 g尿素，相当于田间每亩投加30 kg尿素，水500 mL)；4) C+M组，常规施肥(每盆0.30 g尿素)+稀释50倍发酵液500 mL (相当于0.05 g尿素)；5) C+SM组，常规施肥(每盆0.3 g尿素)+灭菌发酵液稀释50倍500 mL(相当于0.05 g尿素)；6)H组，发酵液稀释25倍500 mL (相当于0.09 g尿素)；7) M组，发酵液稀释50倍500 mL (相当于0.05 g尿素)；8) L组，发酵液稀释100倍500 mL (相当于0.02 g尿素)。每个处理均有6个平行，每个平行中栽种5株实验作物。实验于8月下旬种植，10月上旬收获。

3. 结论

1)通过响应曲面法得到的马铃薯废水的最佳培养条件为：废水含量51.4%，初始pH 7.17，培养温度31.4 ℃。在该条件下培养21 h后，微生物活菌数为6.2×10⁹ cfu·mL⁻¹，基本吻合模型预测结果，产品满足国标要求。

2)盆栽实验结果表明，菌剂产品能有效提高蔬菜的产量与品质。与空白组相比，蔬菜的鲜重、干重、株高，以及维生素C含量分别提高了68.6%、13.7%、5.6%、41.3%。菌剂与尿素混施的效果最佳。相同氮量情况下，小白菜中维生素含量较纯尿素处理提高了25.3%，硝酸盐含量降低了15.3%。

3)利用马铃薯淀粉废水生产微生物菌剂的方法是可行的。菌剂既能保障作物产量，又能提升作物的品质。本研究可为马铃薯淀粉废水的处理与资源化利用，以及P. polymyxa菌剂的应用推广提供参考。

参考文献 (28)

马铃薯淀粉废水资源化制备Paenibacillus polymyxa农用菌剂

作者简介: 刘浩(1988—)，男，博士研究生。研究方向：微生物肥料。E-mail：lh880330@qq.com

通讯作者: 白志辉(1971—)，男，博士，研究员。研究方向：环境生物技术。E-mail：zhbai@rcees.ac.cn

Production of Paenibacillus polymyxa biofertilizer using potato starch wastewater for vegetable cultivation

Corresponding author: BAI Zhihui, zhbai@rcees.ac.cn

1. 材料与方法

1.1 活性污泥培养

1.2 凝胶颗粒制备

1.3 分析方法

2. 结果与讨论

2.1 活性污泥污泥特性及胞外聚合物的变化

2.2 改性凝胶颗粒理化性能

2.3 凝胶包埋活性污泥微生物活性变化

3. 结论

计量

出版历程

马铃薯淀粉废水资源化制备Paenibacillus polymyxa农用菌剂

通讯作者: 白志辉(1971—)，男，博士，研究员。研究方向：环境生物技术。E-mail：zhbai@rcees.ac.cn

English Abstract

Production of Paenibacillus polymyxa biofertilizer using potato starch wastewater for vegetable cultivation

Corresponding author: BAI Zhihui, zhbai@rcees.ac.cn

全文HTML

1.1. 实验原料

1.2. 实验方法

1.3. 单因素实验

1.4. 中心复合实验设计

1.5. 盆栽实验设计

2.1. 不同单因素对马铃薯淀粉废水中菌体生长的影响

2.2. 中心复合实验结果与分析

2.3. 生长曲线的测定及COD和初始pH随时间变化曲线

2.4. P. polymyxa菌剂对蔬菜生长与品质的影响

目录

全文HTML

1.1. 实验原料

1.2. 实验方法

1.3. 单因素实验

1.4. 中心复合实验设计

1.5. 盆栽实验设计

2.1. 不同单因素对马铃薯淀粉废水中菌体生长的影响

2.2. 中心复合实验结果与分析

2.3. 生长曲线的测定及COD和初始pH随时间变化曲线

2.4. P. polymyxa菌剂对蔬菜生长与品质的影响