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改革开放以来，随着我国工业化水平和生产力的逐步提高，自然资源被过度开采、生产和消耗，产生了大量废物。这种粗放式的经济发展模式带来了资源短缺、环境污染和生态破坏等一系列问题[1]。为解决我国废弃产品的环境污染问题，化解可再生资源循环利用面临的困境，加快生态文明建设和循环经济发展，国务院及相关部门高度重视，于2016年12月印发了《生产者责任延伸制度推行方案》(国办发[2016]99号)。但这项制度在具体推行实施过程中存在很多难点和问题，须针对不同行业的特点，深入研究适合的解决方案、实施办法和可操作性强的行业管理指南[2]。本研究结合生产者责任延伸制度的重要意义和推行过程中面临的问题和难点，梳理了河南省在铅酸蓄电池行业推行试点的情况和亮点，为生产者责任延伸制度的推行和实施提供参考。
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生产者责任延伸制(extended producer responsibility, EPR)的概念最早产生于1988年，是由瑞典环境经济学者托马斯教授在向瑞典环境署递交的一份报告中[3]首次提出的。托马斯教授认为，EPR是一项环保战略，更是一项政策机制，其要旨是通过将生产者对产品的责任，尤其是环境责任延伸至废弃后的回收、利用和处置等环节，来降低产品对环境造成的污染[4-5]。在我国，EPR的理念在《环境保护法》《固体废物污染环境防治法》《循环经济促进法》《清洁生产促进法》等法律、法规中均有体现，在《生产者责任延伸制推行方案》(国办发[2016]99号)中，我国正式对EPR进行了定义：指将生产者对其产品承担的资源环境责任从生产环节延伸到回收利用、废物处置等全生命周期的制度[6]。
通常，生产者对产品有设计、生产、销售的责任，要保障产品质量，保护消费者权益。在将产品卖给消费者后，生产者和产品之间的关系就已完结。产品被废弃后(或是被消费者直接丢弃)，任由回收者随意收集、买卖、处置，如废铅酸蓄电池、废电子电器等，或是由政府相关机构负责收集和处置，如生活垃圾等。EPR的内涵则是要求生产者对产品资源环境责任延伸到回收利用和安全处置等环节，这填补了生产者责任体系中产品消费废弃后的责任空白。一方面，该项制度要求生产者在产品研发上开展生态设计，统筹考虑产品原材料选取、包装、消费、收集处理等各环节对资源和环境潜在的影响，鼓励使用再生原料；另一方面，该项制度明确了生产者对产品废弃后的回收利用处置担负主体责任，包含环境损害责任、经济责任、所有权责任等，同时，也强调了产品生命周期中尤其是回收处置过程中经销商、回收者、消费者和政府等不同身份的责任担当[1]。
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1)使废弃产品外部环境成本内部化并减轻国家的环境治理负担。生产者通过销售产品获得了经济利益，但产品被废弃后，向环境中排放则造成了对环境的负面影响和环境损失。对此，以往的模式都是政府为这一环境损失买单，故具有环境外部不经济性特征[1]。EPR则通过要求生产者将责任延伸到产品废弃后的回收、处置全生命周期，将外部环境成本内化到生产成本中。为此，不仅生产者，产品销售中受益的各相关主体如经销商、销售网点等也均应当承担相应的责任，这大大减轻了国家的环境治理负担，减少了行政资源的浪费，可将政府的人力、物力、财力更多地转移到环境治理的宏观决策和科学分配行政资源上[7]。
2)推动循环经济发展。相对于高速、粗放式的经济发展模式，循环经济追求的是高质量的、绿色的和可持续的经济发展模式。循环经济的内涵是3R原则(即减量化、再利用、资源化)。循环经济是尊重生态的、绿色的和集约型的高质量发展模式，能够实现生态文明、经济、社会共同发展。EPR充分体现了循环经济发展的实质。EPR要求改进产品生产技术，采用生态设计，减少原材料的使用和潜在的环境风险，因而符合减量化原则；EPR坚持再利用原则，鼓励生产者加大再生原料的使用比例；EPR明确了生产者承担废弃产品的回收利用责任，因而增加了资源化水平，减少了废弃物的产生量，进而有助于实现可持续发展。因此，EPR是实现循环经济发展方式重要的、必不可少的手段和途径[8]。
3)促进实施清洁生产。EPR是一种产品全生命周期责任制度。在此制度下，生产者被赋予全生命周期责任，这使生产者改变生产模式和理念。首先，在选择产品原料上，尽可能选取对环境污染小的原料，并加大再生原料的使用比例，从而将环境末端治理转化为源头控制；其次，产品废弃后，生产者负责回收、利用，从而大大减少废弃物的产生，增加再生原料，进而减少天然矿山等自然资源的开发压力；最后，对再生利用后的废物进行安全处置，可将生态环境风险降到最低。EPR对产品全生命周期的各个阶段均设计了预防环境污染的措施，以降低污染物的产生量，从而将对环境的影响降到最低，这些均为清洁生产的核心理念。可以说，清洁生产是EPR的实施手段和追求目标，EPR则对清洁生产的发展具有重要的促进作用。
4)促进企业技术升级。EPR将产品消费后的回收、处置的责任明确给生产企业后，逐利性会驱使企业想办法降低废弃产品的处置成本，增加废弃产品可再生利用产生的盈利。为此，企业会在产品的设计、原料的选择、工艺流程、再生技术、企业管理模式等各方面进行技术升级和科技创新，从而促进行业的发展。同时，勇于承担环境责任的企业将在公众中树立良好企业形象，赢得消费者和市场的认可，因而提高企业和产品的竞争力。
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与发达国家相比，EPR在我国起步较晚，在具体的推行实施过程中存在很多难点和问题亟需解决。《生产者责任延伸制推行方案》中确定率先选择铅酸蓄电池等产品实施EPR，鼓励铅酸蓄电池生产企业通过自有销售渠道在消费末端建立的网络回收铅酸蓄电池。因此，现以铅酸蓄电池行业为例，进行逐一分析EPR推行实施过程中面临的问题和难点。
1)相关法律和制度不健全。废铅酸蓄电池(废电池)属于危险废物，而现有的再生资源、循环经济方面的相关法律、法规均不适用于废电池的回收管理，但危险废物经营许可制度及其仓储、车辆运输、转移许可制度等有关规定又和社会源废物回收利用的现实情况不匹配。因此，在国家层面上，目前，尚无依据行业实际情况制订的EPR实施办法和细则等。显然，制度的不匹配和不健全严重制约了EPR在铅酸蓄电池行业的推行和实施[9-10]。
2)废物回收利用体系尚不完善。首先，电池生产者回收主体责任难落实。根据《危险废物许可证管理办法》，生产企业依靠销售渠道逆向建立的回收体系无法取得回收资质，废电池暂存和转运更无法按照危险废物管理办法执行。其次，具有废物回收资质的单位无法建立畅通的回收渠道。持危险废物经营许可证的再生铅企业虽然具有废电池的收集许可资质，但在过去十几年里，再生铅企业主要是点对点收集企业产生的废电池，而针对产生量巨大且分散的社会源废电池，则没有足够的人力、物力和财力来建设畅通的回收渠道。最后，缺乏行业合作。废电池回收利润大，行业竞争性强，生产、回收和再生等企业都想占领回收市场并将利益最大化，因而不愿相互联合起来。此外，社会上也没有正规的行业协会组织共建回收体系。而正规回收体系建设的不完善，使大量的社会源废电池不可避免地流向非法渠道[11]。
3)缺乏多部门联动的监管机制。铅酸蓄电池回收利用涉及到环保、发改、工信、工商、公安、交通、财税等多个政府部门，任何一个部门都无法独自解决废电池回收渠道不畅通、违规回收、非法拆解和非法冶炼现象猖獗的问题。目前，各部门之间尚未建立联动机制，有些部门仅针对行业某个环节进行监管，有些部门至今未有任何监管动作，而社会源废电池产生的源头—销售网点目前尚处于无任何部门进行监管的状态。缺乏部门联动的监管机制，势必对行业EPR的实施进展及其效果产生负面影响。
4)缺乏有效的经济激励政策。EPR是一项针对企业的环境政策，因此，企业既要实施EPR，承担起废弃产品的回收利用和处置的责任，又要考虑成本有效性，在商业行为中盈利。企业非常需要政府给予经济上的激励政策，以获得推行EPR的积极性并增加正规企业与无环保成本的非法企业抗衡的能力，减轻企业生存压力。然而，我国目前尚缺乏有效的经济激励政策[9, 12]。以铅酸蓄电池行业为例，电池生产企业在销售网点有偿回收废电池，但无法取得发票与进项税相抵扣；我国针对废电池回收的增值税退税政策也在弱化；国家每年还征收生产企业4%的消费税。相比之下，违规回收、非法拆解冶炼的小作坊，因无任何环保成本、不开票不缴税，故能抬高废电池的回收价格，垄断废电池回收市场，导致正规的生产企业按照核算成本价格无法收到废电池，从而降低了企业EPR推行效果和积极性[13-15]。
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河南省是铅蓄电池生产、消费和再生利用大省。因此，河南省为推进实施EPR提出的试点方案具有较大的参考意义。为贯彻落实国家的EPR推行方案，最大限度地化解EPR推行实施过程中面临的问题与困难，扭转因废铅蓄电池无序回收引起的非法冶炼、含铅废酸非法倾倒的现状，实现资源循环和环境保护双重效益，中共河南省委已将开展废铅蓄电池收集处理制度试点纳入全面深化改革领导小组在2018年的工作要点中，并由省生态环境厅牵头，工信、公安、交通、工商等多部门联合研究其解决方案，出台了废铅蓄电池收集处理制度试点方案。生态环境部、交通运输部办公厅印发《铅蓄电池生产企业集中收集和跨区域转运制度试点工作方案》后，河南省将《河南省废铅蓄电池收集处理制度试点方案》对照部方案印发了补充通知。在河南省推行EPR方案中，完善了相关制度和实施细则，建立健全了废电池回收责任体系，探索了“互联网+溯源管理”创新监管模式，建立了多部门联动的监管工作机制。
1)完善相关制度和实施细则。其一，突破EPR实施的制度障碍，让责任能够落实到生产者。试点方案明确，铅酸蓄电池生产企业凡是工商和环保手续齐全，具备开展试点工作的资金、人员、场地和销售回收网络等条件，均可申请成为试点企业，通过专家审核、网上备案后，即可开展废电池的回收工作。这一措施解决了生产者要履行回收责任却无法拿到危险废物许可证以回收废电池的难题。其二，针对社会源废物的特性，设计废电池回收实施办法和操作指南，指导生产企业建立回收体系，规范收集和转运行为，让生产者有操作性强的实施细则可依。其三，对废电池进行分类管理，完成EPR和危险废物管理制度的衔接。根据废电池特性进行分类管理，即对完好的废电池，因其环境风险低，故在收集和转运的过程中可按照新产品管理方式，带托贮存带托运输；对破损的废电池，则按照危险废物进行管理，运行危险废物联单，遵守危险货物运输相关规定。
2)建立健全的废电池回收责任体系。鼓励铅蓄电池生产企业通过自建或共建等方式建立和管理废电池回收体系，将收集网点、经销商等回收体系中的单位由无法人管理变为有法人管理，环境责任由政府承担转变为由企业及其组织共同承担。明确回收链上电池生产企业、经销商、销售网点、消费者、溯源平台、再生铅企业、环保机构等在污染防治、环境赔偿、信息公告、溯源管理、宣传培训等方面的责任，保障废电池安全利用、环保处置。
3)探索“互联网+溯源管理”创新监管模式。采用“互联网+溯源管理”模式，将线上溯源管理和线下回收体系有机融合。采用废电池溯源管理平台，使生产企业、经销商、收集网点等参与回收的各责任主体均在溯源管理平台上注册登记，采用扫描二维码的方式使管理部门能够实时掌握每支废电池状况及每个回收体系的运营情况，从而实现废电池自产生至再生铅企业来源可查、去向可追、全程可控。溯源平台具备废电池回收处理情况查询、汇总、统计、分析和预警等功能，数据真实可靠，可为公安、环保、工信、工商、交通、发改等多个政府部门在各自职能范围内进行监督管理提供基础信息，更能够为未来国家推出积极的经济政策，例如免税、退税等提供可靠的数据支撑。
4)建立多部门联动的监管工作机制。环保、公安、工信、交通、工商等政府部门发挥各自职能，对废电池回收体系建设、贮存场所规范、废电池转运、溯源平台运行等开展指导协调、督察督办、警示约谈、考核评议等工作。各部门建立工作协同配合机制及信息通报、联合打击、协调联动等机制，定期召开联席会议，相互通报情况，凝聚合力。
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在全国范围内推进实施EPR具有重要的意义。河南省的试点工作进一步细化、落实了生产者及其回收体系在废铅酸蓄电池回收各环节的责任，并将溯源管理真正运用到试点工作中。试点通过一段时间的运行，试点企业建立了的回收体系，并按照要求采用全过程溯源管理的模式回收到了废铅酸蓄电池，安全转运至再生铅企业进行再生利用，证明了试点模式可行、技术可行，有显著的成效和借鉴价值。尽管如此，在河南省推行实施EPR的实际工作中，仍存在很多难点和问题，还有很多做法需要改进。例如，要明确多部门职责分工，加强协作监管和执法检查、完善市场导向奖惩机制，研究出台财政激励、税收减免和铅循环税收调节政策，加强行业沟通合作、完善信用评价体系、促进平台经济规范健康发展，与行业更好地融合，加大宣传力度，发挥公众监督作用，推行实施EPR过程中边试边改、不断完善。
铅酸蓄电池行业生产者责任延伸制在我国实施的难点和解决方案
Difficulties and solutions of lead-acid battery industry EPR implementation in China
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摘要: 为解决我国废弃产品环境污染问题和再生资源循环利用的困境，加快生态文明建设和循环经济发展，国务院现已推行生产者责任延伸制度。该项制度的推行实施，可减轻环境治理负担，推动循环经济和清洁生产模式，促进企业技术升级，但该项制度在具体实施过程中尚存在一些问题。以铅蓄电池行业为例，存在的主要问题包括相关制度不健全、回收利用体系不完善、缺乏多部门联动监管机制和有效的经济激励政策等。针对上述问题，结合河南省的废铅蓄电池收集处理制度试点工作，提出铅酸蓄电池行业生产者责任延伸制实施的建议方案，为生产者责任延伸制度更好地推行和实施提供参考。
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关键词:
- 生产者责任延伸制度(EPR) /
- 铅酸蓄电池行业 /
- 废物回收与资源化处置
Abstract: In order to solve the environmental pollution problems of solid waste and the difficulties in the circular utilization of renewable resources, and to accelerate ecological civilization construction and circular economy development, extended producer responsibility has been introduced by the State Department of China. Through the implement of this system, the burden of environmental governance will be reduced, the model of circular economy and cleaner production will be promoted, as well as the enterprise technology upgrading. However, there are still some problems during its implementation. Take lead-acid battery industry for example, the relevant systems and the recycle system are not perfect yet, a lack of the multi-sector linkage supervision mechanism and effective economic incentive policies. Aiming at these problems, combining with the pilot work of waste lead-acid battery collection and treatment system in Henan province, a proposal was raised for the implementation of the extended producer responsibility in lead-acid battery industry, to provide reference on the promotion and implementation of EPR. -
长荡湖流域地处太湖流域上游，是太湖重要水系。流域总面积2 161.46 km2，地势西高东低；流域内水系发达，流向复杂，主要流向为自西向东。由于大规模的农业耕作、淡水养殖以及快速城镇化，导致长荡湖流域氮、磷污染严重。据报道目前长荡湖流域水质恶化，水体受富营养化和蓝藻水华暴发的影响，进而威胁太湖流域生态安全[1-3]。而研究表明入湖河流是湖泊的主要污染来源[4-5]。如黄明雨[6]研究发现洱海入湖河流的氮磷输入是洱海氮磷的重要来源。谢培等[7]基于EFDC模型模拟不同调水方案下千岛湖上游入流和湖周入流CODMn变化对湖内CODMn的影响，发现上游入流是影响千岛湖湖内CODMn的主要因素。因此对长荡湖入湖河流的水生态环境现状进行全面调查研究是十分必要的。
微生物在维持水生态系统的功能和健康中起着至关重要的作用，它既是全球生物地球化学循环的主要驱动者，也是水生态系统中污染物的主要分解者[8]。由于微生物的存在，水中复杂且难降解的有机污染物才得以分解[9]，水生态系统才能良性循环。早期微生物检测技术主要是分离培养法，但此种方法存在培养难度大、周期长等缺陷。为弥补传统培养方法的不足，现代分子生物学技术应运而生，常见的分子生物学方法有高通量测序技术、实时荧光定量PCR和宏基因组测序技术等[10-12]。相比第一代DNA测序技术，高通量测序技术在读取样本数量、测序范围和准确性等方面有绝对优势[13]，因此被广泛应用于环境样品的16S rRNA、真菌的ITS区和功能基因的分析中[14]。作为水生态系统重要组成部分，微生物的群落结构与多样性受水体理化性质和外部环境因素的共同影响。张烨以南太湖流域长兴港和西苕溪为研究对象，发现季节变化是引起微生物群落多样性差异的主要因素，且微生物群落特征受水体理化因子影响，如入湖河流中水杆菌属(Aquabacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)与NH4+-N呈正相关、DO呈负相关[15]。刘峰等[16]利用高通量测序技术和典范对应分析(CCA)发现汾河与黄河微生物群落组成具有一定的差异，不同环境因子对不同微生物的影响程度不同，pH和溶解氧是汾河入黄口微生物群落结构的主要影响因子。SHANG等[17]基于16S rRNA高通量测序技术发现温度、pH和DO的快速变化可能是影响呼伦湖季节性细菌多样性变化趋势的主要因素。因此研究水体中微生物群落与环境因子的响应关系，对保护水体、维护水生生态系统平衡具有重要意义。
目前长荡湖流域的研究主要聚焦于长荡湖湖体的水质变化、浮游动物和底栖动物的群落结构特征以及沉积物污染风险等[3，18-21]。如王礼权等[18]采用非度量多维尺度变换(NMDS)和冗余分析等方法探讨了长荡湖浮游植物群落结构组成特征及其与环境因子的关系。巫丹等[19]则利用正定矩阵因子(PMF)模型和主成分分析多元线性回归(PCA-MLR)模型对湖泊重金属污染来源进行解析，并评估了长荡湖沉积物重金属的风险等级。但鲜有研究关注长荡湖入湖河流的微生物群落结构特征及与环境因子的关系。鉴于丰水期水中微生物多样性较高且雨量充沛；同时渔业养殖、农业生产活动强，对入湖河流水质造成较大冲击，且较其他季节的污染更为严重[22-23]。因此本研究基于2021年6月长荡湖入湖河流的采样数据，分析入湖河流的微生物群落结构特征以及与环境因子的关系，以期为长荡湖及其入湖河流污染防治和生态修复提供参考。
1. 材料与方法
1.1 采样点设置与采样时间
在综合考虑长荡湖的主要入湖河流和污染源类型等因素的基础上，在入湖河流中布设11个采样点。于2021年6月(丰水期)进行水样采集。采样点根据沿岸污染源类型，分为农村生活污染、农业面源污染和渔业养殖污染3种类型。采样点的具体位置信息见表1和图1。
表 1 长荡湖入湖河流采样点位置信息Table 1. Sampling locations in rivers entering Changdang Lake污染类型 采样点编号 经度 纬度 农村生活污染 W152 119°29′28.67″E 31°37′13.51″N W153 119°29′25.54″E 31°35′1.75″N W154 119°29′9.86″E 31°34′32.47″N W155 119°29′36.09″E 31°32′45.49″N W162 119°35′39.21″E 31°40′28.72″N 农业面源污染 W150 119°31′15.62″E 31°39′31.88″N W151 119°30′30.00″E 31°38′18.13″N 渔业养殖污染 W157 119°33′27.30″E 31°34′43.09″N W159 119°36′34.12″E 31°36′52.48″N W161 119°36′30.18″E 31°39′23.19″N W164 119°32′57.24″E 31°40′17.43″N | Show Table
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图 1 长荡湖入湖河流采样点位分布Figure 1. Distribution of sampling sites in rivers entering Changdang Lake1.2 水样采集与测定方法
使用有机玻璃采水器采集距水面0.5 m的水样，每个采样点采集1 L水样，保存于已消毒灭菌并用样本底水充分清洗的聚乙烯取样瓶中，并在4 ℃条件下运回实验室。其中500 mL水样用于理化因子测定，500 mL在实验室无菌环境下使用0.45 μm滤膜过滤后放入冻封管并置于-20 ℃冰箱冷冻保存，之后送至公司进行微生物基因测序。
测定的理化因子包括总有机碳(TOC)、总氮(TN)、总磷(TP)、水温(WT)、pH值及溶解氧(DO)。总有机碳(TOC)采用燃烧氧化-非分散红外吸收法；总氮(TN)采用碱性过硫酸钾-紫外分光光度法；总磷(TP)采用钼酸铵分光光度法；采用YSI多参数水质分析仪(YSI PRO1020 美国)现场测定水温(WT)、pH值和DO。
1.3 微生物群落测序分析方法
使用PowerWater DNA试剂盒(MOBIO, USA)提取基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA。使用正向引物341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和反向引物806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')对V3-V4可变区进行PCR扩增。扩增程序：95 °C预变性3 min，27个循环(95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s)，最后72 °C延伸10 min(PCR仪: GeneAmp® 9700，Applied Biosystems, USA)。
使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。测序采用 Illumina MiSeq PE300 高通量测序平台进行测序。利用Uparse软件(7.0.1001版)进行序列分析，将相似性不低于97%的序列分配到同一个OTU进行物种注释。PCR及测序均由上海凌恩生物科技公司完成。
1.4 数据处理与分析
基于Microsoft Excel处理的原始实验数据；使用Origin 2018软件绘制物种丰度柱状图，微生物多样性指数使用QIIME软件(1.7.0版)计算。利用R.v3.3.4软件进行ANOSIM分析(相似性分析)，用于确定不同分组下微生物相对丰度的差异。依托微生信在线平台绘制Circos图分析不同污染类型的入湖河流中微生物群落结构组成。在Canoco for Windows 5.0软件中使用冗余分析确定微生物群落与理化因子的响应关系。
2. 结果与讨论
2.1 入湖河流的理化指标
长荡湖入湖河流中污染物浓度与污染类型存在一定关联。如表2所示，农业面源污染的入湖河流中总氮浓度范围为2.71~2.83 mg·L−1，平均浓度为2.77 mg·L−1。总磷浓度范围为0.10~0.12 mg·L−1，平均浓度为0.11 mg·L−1。而农村生活污染和渔业养殖污染的入湖河流中总氮、总磷的平均浓度分别约为1.66、0.96 mg·L−1和0.09、0.04 mg·L−1。由此可见，相比农村生活污染和渔业养殖污染，农业面源污染贡献了更多的有机污染物，特别是含氮污染物。农业面源污染的入湖河流中W150和W151的总氮浓度超过地表水V类水质标准(≤2.0 mg·L−1)。其总氮浓度高的原因是该区为我国重要的商品粮基地，而农业生产需要施加化肥且丰水期是农业生产的关键时期，因此，富氮的农业尾水排入河流，致使周边河流总氮浓度维持在较高的浓度范围。农村生活污染的入湖河流中W153、W154、W155的TOC和TN浓度普遍较高，这是其周边生活着农村居民，大量生活污水被直接排入河中，造成河流有机物及氮素的积累。除W164外，渔业养殖污染的入湖河流中其余点位的总氮、总磷浓度均维持在较低的浓度水平。3种污染类型的入湖河流中WT总体范围为(26.25±1.75) ℃；pH维持在7.93±0.21，呈弱碱性；DO浓度范围处于(6.22±1.67) mg·L−1。
表 2 长荡湖入湖河流水体理化指标Table 2. Physical-chemical indicators of rivers entering Changdang Lake污染类型 点位 TOC/(mg·L−1) TN/(mg·L−1) TP/(mg·L−1) WT/( ℃) pH DO/(mg·L−1) TN/TP 农村生活污染 W152 2.70 1.98 0.10 24.7 7.9 6.34 19.80 W153 5.90 1.94 0.10 26.9 8.02 6.77 19.40 W154 6.10 1.88 0.10 26.6 7.97 5.63 18.80 W155 6.30 1.83 0.11 27.4 8.02 6.56 16.64 W162 4.10 0.69 0.03 27.1 8.09 7.49 23.00 农业面源污染 W150 3.20 2.71 0.12 24.9 7.72 4.55 22.58 W151 3.00 2.83 0.10 24.5 7.83 5.71 28.30 渔业养殖污染 W157 4.20 0.70 0.04 27.2 8.14 7.28 17.50 W159 4.00 0.72 0.04 27.6 8.02 6.43 18.00 W161 4.00 0.64 0.04 28 8.01 7.89 16.00 W164 3.10 1.79 0.05 26.2 8.03 6.57 35.80 | Show TableDownLoad:
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2.2 入湖河流微生物群落分布
1) 门分类水平微生物群落结构。长荡湖入湖河流的微生物群落在门分类水平上具有较高的多样性。11个采样点中共检测出46种已知微生物菌门，入湖河流微生物在门分类水平上组成如图2所示，其中相对丰度排在10名之后的菌门和其他未知物种归为others。
图 2 长荡湖入湖河流门分类水平微生物群落相对丰度图Figure 2. Relative abundance of microbial communities of rivers entering Changdang Lake at the phylum level3种污染类型的入湖河流中优势菌门种类相同，主要包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。但不同污染类型的入湖河流中优势菌门相对丰度却有所差别。如农业面源污染入湖河流中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度为81.09%±1.37%，远高于农村生活污染(31.05%±4.68%)和渔业养殖污染(24.49%±5.98%)。这是因为变形菌门(Proteobacteria)与氮循环有关[24-25]，与氮循环密切相关的硝化细菌主要分散在变形菌门(Proteobacteria)的亚群中[26-27]。而农业面源污染的入湖河流中总氮浓度远高于其余污染类型，可见总氮对变形菌门(Proteobacteria)的生长有促进作用。农村生活污染和渔业养殖污染的入湖河流中放线菌门(Actinobacteria)相对丰度范围分别为40.19%±2.37%和38.43%±4.58%，高于农业面源污染(12.26%±0.25%)。因为农业面源污染的入湖河流DO平均浓度为5.13 mg·L−1，低于农村生活污染(6.56 mg·L−1)和渔业养殖污染(7.04 mg·L−1)。表明低DO浓度不利于放线菌门(Actinobacteria)生长。这与李明等[28]的研究结论相似，即厌氧环境能抑制放线菌门(Actinobacteria)的生长。农村生活污染、农业面源污染和渔业养殖污染的入湖河流中拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度依次为11.89%±2.48%、3.19%±1.13%、8.83%±4.89%。据报道总氮和碱解氮对拟杆菌门菌群丰度起抑制作用[28]，而农业面源污染的入湖河流中总氮浓度偏高。这与前人研究结论一致[29]。
Circos图可以更直观地展现不同污染类型的入湖河流中门分类水平微生物群落组成情况。如图3所示，变形菌门(Proteobacteria)作为长荡湖入湖河流中第一大优势菌门，其在农业面源污染的入湖河流中平均占比最高；而放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和蓝细菌门(Cyanobacteria)在农业面源污染的入湖河流中平均占比最低。再次证明入湖河流中菌门的相对丰度与污染源类型相关。
图 3 长荡湖入湖河流门分类水平微生物群落结构圈图Figure 3. Circos map of the microbial community in rivers entering Changdang Lake at the phylum level2) 属分类水平微生物群落结构。长荡湖入湖河流属分类水平微生物群落结构组成如图4所示，其中相对丰度排在15名之后的菌属和其他未知物种归为others。11个采样点共检测出617种微生物菌属；但所有采样点均有未能确定其分类学地位的菌属。入湖河流中相对丰度前5的菌属依次为：hgcI clade (6.10%~31.11%)、CL500-29 marine group(3.89%~22.64%)、Acinetobacter(0.15%~19.99%)、Comamonadaceae-Unclassified(0.66%~10.94%)和Hydrogenophaga(0.07%~22.60%)。
图 4 长荡湖入湖河流属分类水平微生物群落相对丰度图Figure 4. Relative abundance of microbial communities in rivers entering Changdang Lake at the genus taxonomic level不同污染类型的入湖河流中优势菌属种类相似，但相对丰度不同。hgcI clade在农村生活污染和渔业养殖污染的入湖河流中平均占比分别为21.55%、18.28%，高于农业面源污染(6.43%)；相同地，CL500-29 marine group在农村生活污染、渔业养殖污染和农业面源污染的入湖河流中占比依次为12.80%、19.25%、4.23%，说明农村生活污染和渔业养殖污染的入湖河流更适合hgcI clade、CL500-29 marine group的生长。反之，hgcI clade、CL500-29 marine group能利用营养物质促进自身生长繁殖，进而改善水质[30]。研究表明hgcI clade相对丰度随温度升高而明显增大，且与水质变好有关[31-32]；CL500-29 marine group能够利用含碳有机物改善水质[33]。因此农业面源污染的入湖河流TOC平均浓度(3.10 mg·L−1)低于农村生活污染(5.02 mg·L−1)和渔业养殖污染(3.83 mg·L−1)。农业面源污染的入湖河流中Hydrogenophaga的相对丰度显著高于农村生活污染和渔业养殖污染。XING等[34]研究发现Hydrogenophaga是一种兼性自养菌，能在没有或有残留可生物降解有机物的污水中保持优势地位。所以在农业面源污染的入湖河流中，Hydrogenophaga相对丰度反而更高。
进一步采用ANOSIM分析探究不同污染类型的入湖河流中各采样点微生物的相对丰度差异。结果表明，组间差异大于组内差异，且不同污染类型的入湖河流点位的微生物群落结构存在显著差异(p = 0.002，R = 0.579)，证明微生物群落结构与污染源类型相关。
3) 微生物群落Alpha多样性分析。长荡湖入湖河流中微生物群落Alpha多样性分析结果见表3。
表 3 长荡湖入湖河流微生物Alpha多样性指数Table 3. Alpha diversity index of microorganisms in rivers entering Changdang Lake污染类型 点位名称 Ace Chao1 Shannon Simpson Coverage 农村生活污染 W152 5897 5619 8.5312 0.0114 0.974 W153 5733 5537 8.3473 0.0129 0.978 W154 6051 5856 8.6283 0.0101 0.977 W155 6738 6415 8.7358 0.0118 0.970 W162 4443 4243 8.0785 0.0166 0.973 农业面源污染 W150 4134 4125 6.5501 0.0572 0.977 W151 3805 3687 6.8585 0.0376 0.983 渔业养殖污染 W157 3698 3619 7.9462 0.0133 0.973 W159 3733 3606 7.4672 0.0249 0.975 W161 3763 3632 7.3288 0.0339 0.978 W164 4997 4849 8.2801 0.0135 0.973 | Show TableDownLoad:
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长荡湖入湖河流采集的水体样本中，Coverage指数均在0.97以上，说明本次测序深度基本覆盖样品中的物种。3种污染类型入湖河流中Ace指数最高的是农村生活污染(5 590.5±1 147.5)，最低的是农业面源污染(3 969.5±164.5)；农村生活污染的入湖河流中Chao1指数最高(5 329.0±1 086.0)，Chao1指数最低的是农业面源污染(3 906.0±219.0)。说明丰水期农村生活污染的入湖河流中微生物群落的丰富度最高，而农业面源污染的入湖河流中微生物群落丰富度最低。这与ZHANG等[35]研究结论一致。即不同的外部污染输入与细菌群落呈显著相关，如农业污染会导致norank_p_Aminicenantes相对丰度升高。农村生活污染的入湖河流中Shannon指数平均值最高，约为8.464，其次为渔业养殖污染(7.756)，农业面源污染(6.704)。Simpson指数与Shannon指数反映的结论一致。整体上，丰水期长荡湖入湖河流的微生物群落丰富度与多样性呈现农村生活污染>渔业养殖污染>农业面源污染的规律。
2.3 入湖河流微生物群落与理化因子相关性分析
1) 入湖河流优势门分类水平微生物群落与理化因子响应分析。长荡湖入湖河流中相对丰度前10的优势菌门与7个理化因子(DO、pH、WT、TOC、TN、TP和TN/TP)的冗余分析结果如图5所示。pH、TP与长荡湖入湖河流的优势菌门呈显著相关(p<0.05)，DO、WT、TOC、TN及TN/TP与长荡湖入湖河流优势菌门的相关性不显著(p>0.05)。
图 5 长荡湖入湖河流优势菌门与理化因子间的冗余分析Figure 5. RDA between dominant bacterial phylum and physicochemical factors in rivers entering Changdang Lake长荡湖入湖河流中DO与Actinobacteria、Cyanobacteria、Verrucomicrobiota等菌门呈正相关，说明DO能促进Actinobacteria、Cyanobacteria、Verrucomicrobiota等菌门的生长[36-37]。同样地，Cyanobacteria也可通过光合作用产生氧气，增加水中溶解氧[38]。而DO与Proteobacteria呈显著负相关，表明随着DO浓度升高，Proteobacteria丰度反而降低，这与李亚莉等[39]研究结论一致。入湖河流中pH与Actinobacteria呈显著正相关，与Proteobacteria呈显著负相关。入湖河流中WT、TOC与Proteobacteria呈显著负相关，但与其余菌门呈一定程度的正相关。这与邹沈娟等[40]研究结论一致，即变形菌门与WT、TOC显著负相关。但刘泽岸和孙琳[41]却有不同的观点，其以浐灞河生态区为研究对象，发现Proteobacteria与WT呈正相关。原因是本文和邹沈娟等[40]研究文章中水样属于同一时间采集，而刘泽岸和孙琳[41]的研究文章中水样分别在夏、冬两季各采集一次。夏、冬两季水样的WT差距较大；同时微生物有适宜的生长温度范围，过高或过低均会降低微生物的丰度[42]。因此造成了不同研究人员研究发现Proteobacteria与WT呈现出相关性不一致的现象。微生物的生长除了WT、pH等影响因素外，营养因素N、P至关重要，许多研究也发现营养因素与微生物群落结构有较大的相关性。如张雅洁等[43]以北海湖为研究对象，发现在TN浓度为0.83~1.67 mg·L−1，TP浓度为0.04~0.11 mg·L−1时，营养盐浓度增加，能显著增加蓝细菌的丰度。薛银刚等[44]研究发现营养盐在微囊藻属的有害增殖过程中起着重要的作用，是推动微囊藻水华暴发的主要因素。但在本研究中，入湖河流中TN、TP和TN/TP除与Proteobacteria呈显著正相关，与其它菌门均呈一定程度的负相关。李先会等[45]研究发现在满足微生物生长需要的条件下，增加微生物生长所需底物(如TN、TP)浓度反而会抑制微生物生长。对比发现，长荡湖入湖河流中TN浓度为0.64~2.83 mg·L−1，TP浓度为0.03~0.12 mg·L−1；高于北海湖TN、TP浓度水平。所以在较高TN、TP浓度的环境下，微生物生长反而受到抑制。而入湖河流中TN、TP和TN/TP与Proteobacteria呈显著正相关，说明Proteobacteria对TN、TP的耐受性较强。
2) 入湖河流优势属分类水平微生物与环境因子响应分析。长荡湖入湖河流中相对丰度前15的优势菌属与7个理化因子(DO、pH、WT、TOC、TN、TP和TN/TP)的冗余分析结果如图6所示。DO、pH与长荡湖入湖河流的优势菌属呈显著相关(P<0.05)，WT、TOC、TN、TP和TN/TP与长荡湖入湖河流的优势菌属相关性不显著(P>0.05)。
图 6 长荡湖入湖河流优势菌属与理化因子间的冗余分析Figure 6. RDA between dominant bacterial genera and physicochemical factors in rivers entering Changdang Lake长荡湖入湖河流中DO、pH与Hydrogenophaga、Acinetobacter、Limnohabitans等菌属呈一定程度的负相关。Acinetobacter属于专性需氧型细菌，能在有氧条件下将氨转化为硝酸[37]。但本研究显示随着DO浓度升高，Acinetobacter生长反而受到抑制。分析可能是受其它环境因子影响或其它优势菌属争夺DO，抑制了Acinetobacter生长。Limnohabitans喜欢非酸性的环境，在溶解氧浓度较低的环境下，生长速率快，生存能力强[46]；而长荡湖入湖河流中较多的氮磷等营养物质为Limnohabitans提供了良好的生存条件且水体偏碱性，因此DO升高反而抑制Limnohabitans繁殖。长荡湖入湖河流中WT、TOC与Hydrogenophaga、Acinetobacter、Comamonadaceae_Unclassified、Limnohabitans及Arenimonas呈一定程度的负相关，与CL500-29 marine group、Candidatus Aquirestis、hgcI clade等菌属呈正相关。研究表明温度能影响微生物的活性且不同微生物的生长适宜温度并不相同[47-48]，所以当WT处于24.5~28 ℃内，WT偏低有利于Hydrogenophaga、Acinetobacter、Comamonadaceae_Unclassified、Limnohabitans及Arenimonas的繁殖，WT偏高则适宜CL500-29 marine group、Candidatus Aquirestis、hgcI clade等菌属生长。长荡湖入湖河流中TN、TP及TN/TP与Hydrogenophaga、Acinetobacter、Comamonadaceae_Unclassified及Limnohabitans等菌属呈一定程度的正相关，与CL500-29 marine group、Candidatus Aquirestis、hgcI clade等菌属呈负相关。说明长荡湖入湖河流中TN、TP浓度早已超出CL500-29 marine group、Candidatus Aquirestis及hgcI clade等菌属生长所需浓度，因此随着入湖河流中氮磷浓度升高，这些菌属的生长反而受到抑制[45]。
3. 结论
1) 高通量测序结果表明，丰水期长荡湖入湖河流11个采样点共检测出微生物群落46门，617属。在门、属分类水平上，入湖河流各采样点的微生物群落中优势菌门、菌属种类相似，但相对丰度却有所差别。进一步采用ANOSIM分析，结果表明长荡湖入湖河流微生物群落与污染源类型相关。
2) 据微生物群落Alpha多样性分析结果显示，3种污染类型的长荡湖入湖河流中微生物群落多样性和丰富度呈现农村生活污染>渔业养殖污染>农业面源污染的规律。
3) 冗余分析表明，pH、TP与长荡湖入湖河流的优势菌门呈显著相关(P<0.05)；DO、pH与长荡湖入湖河流的优势菌属呈显著相关(P<0.05)，且同一种理化因子与不同菌门、菌属的相关性不同。
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