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石油作为现代社会最主要的能源之一,有工业血液之称[1]。然而,石油在生产、储运和使用的过程中也带来了许多环境问题,其中石油及其产品污染土壤的问题尤为突出,世界上98%的石油泄漏事故发生在陆地上[2]。土壤中的石油类污染物会对土壤的通透性、微生物群落及农作物生长造成影响,修复石油污染土壤对环境保护和土地可持续利用有着十分重要的意义[1]。
目前,高级氧化技术(advanced oxidation processes,AOPs)是修复石油污染土壤常用的方法之一[3]。在高级氧化技术中常用到的氧化剂为双氧水(H2O2)。但由于H2O2有稳定性差、易催化分解等缺点,导致其修复效果受到限制[4]。过氧化钙(CaO2)被称为固态H2O2,因其具有强氧化性、持久缓释性、残留物无害性以及微生物友好性而被广泛应用于土壤和地下水化学修复[5]。GOI等[6]用CaO2代替H2O2修复电气绝缘油污染的土壤,发现投加适量的CaO2可在21 d去除96%的绝缘油。ZHANG等[7]利用Fe(Ⅲ)催化CaO2降解地下水中三氯乙烯,在180 min内达到了99.95%的降解率。
基于H2O2和CaO2的高级氧化技术被广泛应用于去除土壤和地下水中的污染物,但关于其对土壤及地下水中微生物群落、植物等造成的影响的研究却相对较少[8]。本研究利用类Fenton氧化技术修复石油污染土壤,考察氧化剂种类(H2O2和CaO2)、氧化剂投加量、Fe(Ⅲ)及柠檬酸浓度对污染物去除效率的影响,通过比较CaO2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸体系和H2O2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸体系修复前后土壤原著微生物及植物生长情况的变化,评估2种类Fenton技术所产生的生态毒性效应。
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实验材料:四氯化碳(CCl4,红外测油仪专用)、过氧化氢(H2O2,30%)、硫酸铁(Fe2(SO4)3)、柠檬酸(C6H8O7·H2O)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙醇(C2H5OH)、丙酮(CH3COCH3)为分析纯,并均购自国药集团化学试剂有限公司;过氧化钙(CaO2,75%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
供试土壤:取自上海市东华大学松江校区校园园圃地表10~15 cm深的土壤,自然风干,去掉碎屑、石块、草根等杂物后,研磨并过20目筛。以0#柴油代替原油,取适量柴油溶于二氯甲烷后,加入过筛后的土壤中,振荡摇匀后,置于通风橱内,待二氯甲烷挥发完全后,在室温25℃下,老化1个月,制得模拟石油污染土壤,石油初始浓度为13.2 g·kg−1[9-10]。受试土壤理化性质如下:砂粒(>20 µm)14%、粉粒(2~20 µm)57.2%、黏粒(<2 µm)28.8%,pH=7.54、含水率1.44%、有机质含量3.22%。
实验仪器:OLB3000B红外分光测油仪(天津金贝尔科技有限公司);FA114A电子天平(上海豪晟科学仪器有限公司);HY-5A回旋式振荡器(常州朗越仪器制造有限公司);FE28 pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司),SRG-800C恒温培养箱(杭州硕联仪器有限公司)。
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在锥形瓶中加入5 g受试土壤,依次向瓶中加入25 mL去离子水、柠檬酸溶液、Fe(Ⅲ)溶液、氧化剂H2O2或CaO2,随后将锥形瓶放置在回旋振荡摇床中,转速为170 r·min−1,混合反应时间为24 h,取样测定土样中剩余柴油的含量。控制氧化剂投加量为166.67 mmol·L−1,柠檬酸浓度为27.78 mmol·L−1,Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L−1,处理无外加柴油污染的土壤样品,考察CaO2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸体系和H2O2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸体系对土壤原著微生物的影响。取适量处理后土壤样品,离心,取下层固体装入无菌离心管中,在−80 ℃条件下保存用于高通量测序;另取相同处理土壤样品,在25 ℃恒温培养箱中培养48 h后,按上述操作进行高通量测序;再取适量处理后的土壤泥水混合物样品,放入恒温培养箱中,进行豌豆种子的萌发及培育实验,每份土壤样品培育60颗豌豆种子,待种子生长7 d后,测定植株的生长情况(发芽率、植株干重、株高、叶绿素含量)。每组实验设2个平行样,结果取平均值。
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取反应后土水混合物样品,离心,使样品固液分离,使用四氯化碳萃取上清液,测得柴油浓度,取出下层底泥,置于培养皿,放置于通风橱中,待水分挥发完全后(室温下挥发时间为1 d左右),使用四氯化碳萃取并测得干燥土壤样品中柴油浓度,二者之和即为反应后土壤样品柴油浓度。该方法测得柴油回收率为90%~110%,可保证样品测定的柴油浓度接近原土壤的实际柴油浓度。
准确称取0.5 g土壤样品于25 mL比色管中,加入20 mL四氯化碳于比色管中,在35℃条件下,超声45 min,萃取土壤中的柴油,取一定量萃取液于10 mL比色管,稀释定容到可检测浓度范围后,利用红外分光测油仪测定溶剂中柴油的浓度。上清液中柴油浓度的测定参考文献中的方法[11]。
土壤中细菌16S rRNA高通量测序和分析参考王慕华等[12]的研究方法;豌豆植株的发芽率、干重、株高的测定参考SERA等[13]的研究方法;叶绿素的测定参考汪艳杰等[14]的研究方法。
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控制Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L−1、柠檬酸浓度为27.78 mmol·L−1,投加不同浓度的CaO2或H2O2(55.56、111.11、166.67、222.22 mmol·L−1),探究氧化剂种类及投加量对污染物降解效果的影响。如图1所示,CaO2类Fenton法比H2O2类Fenton法对土壤中柴油的去除效果更好。当氧化剂投加量为166.67 mmol·L−1时,H2O2类Fenton法对柴油的去除率仅为17.65%,而CaO2类Fenton法对柴油的去除率为44.14%。这主要是由于CaO2在反应体系中,缓慢持续地释放H2O2,使得体系中H2O2的浓度长时间维持在较低水平,避免了短时间内过量的H2O2积累,造成H2O2发生分解(2H2O2→O2+2H2O)而失去氧化能力。而在H2O2类Fenton体系中,一次性投加的H2O2可发生自分解反应和体系中 · OH的清除反应(H2O2+ · OH→HO2 · +H2O),最终导致对污染物的去除效果变差。徐金兰等[3]在利用改性Fenton降解石油污染土壤时发现,将900 mmol·L−1的H2O2分4次投加对TPH的降解率比一次性投加900 mmol·L−1H2O2的TPH降解率,提高了2.2倍(由22%提高到49%)。因此,利用CaO2作为氧化剂代替H2O2,更有利于土壤中柴油污染的去除。
如图1所示,当CaO2的投加量由0增加至166.67 mmol·L−1时,土壤中柴油的降解率由4.33%提高到44.14%。这是因为随着CaO2投加量的增多,释放的H2O2及 · OH的浓度也会升高(CaO2+2H2O→H2O2+Ca(OH)2;H2O2+Fe(Ⅱ)→ · OH+Fe(Ⅲ)+HO-),从而促进了柴油的氧化降解。当CaO2的投加量由166.67 mmol·L−1增加至222.22 mmol·L−1时,土壤中柴油的降解率由44.14%下降至35.62%。这是因为过量投加CaO2会产生过量的H2O2,当H2O2浓度过高时,会发生自分解反应(2H2O2→O2+2H2O),并且多余的H2O2还会消耗 · OH等活性氧自由基(H2O2+ · OH→HO2 · +H2O),从而使目标物去除率有所下降。
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控制CaO2浓度为166.67 mmol·L−1、柠檬酸浓度为83.33 mmol·L−1,改变Fe(Ⅲ)浓度(0、13.89、27.78、41.67、55.56 mmol·L−1),探究Fe(Ⅲ)浓度对CaO2类Fenton体系修复石油污染土壤的影响。由图2可知,土壤中柴油的降解率随着Fe(Ⅲ)浓度的增加,呈现先增加后略有下降的趋势。当Fe(Ⅲ)从0增加到27.78 mmol·L−1时,柴油的降解率从14.24%增加到35.92%,随着Fe(Ⅲ)浓度的升高,促进了Fe(Ⅲ)与H2O2的反应(H2O2+Fe(Ⅲ)→Fe(Ⅱ)+HO2 · +H+),产生更多的Fe(Ⅱ),进而促进更多的 · OH等活性氧自由基的生成(H2O2+Fe(Ⅱ)→ · OH+Fe(Ⅲ)+HO–),从而导致柴油去除率升高。进一步增加Fe(Ⅲ)浓度到55.56 mmol·L−1,柴油的降解率下降了3.34%。这可能是因为过量的Fe(Ⅲ)可与CaO2溶解产生的Ca(OH)2反应,生成Fe(OH)3胶体或沉淀物,将土壤颗粒表面包裹,不利于吸附在土壤表面的柴油与氧化剂接触反应,从而降低了柴油的去除率[15]。但由于上述Fe(Ⅲ)被H2O2还原为Fe(Ⅱ)的反应速率很低(约0.001 L·(mol·s)−1),反应生成的Fe(Ⅱ)可即时与H2O2反应被消耗,因此,过量的Fe(Ⅲ)未对柴油降解产生明显的抑制作用(H2O2+Fe(Ⅲ)→Fe(Ⅱ)+HO2·+H+)[4]。
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控制CaO2浓度为166.67 mmol·L−1、Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L−1,改变柠檬酸浓度(0、13.89、27.78、55.56、83.33 mmol·L−1),探究柠檬酸浓度对CaO2类Fenton体系修复石油污染土壤的影响。如图3所示,柴油的降解率随着柠檬酸浓度的升高呈现先升后降的趋势,当柠檬酸浓度从0增加到27.78 mmol·L−1时,柴油的降解率由22.19%增加到42.03%。这是因为柠檬酸与Fe(Ⅲ)可形成螯合物,使溶液中溶解态的Fe(Ⅲ)的浓度增加,从而促进氧化反应的进行。当进一步增加柠檬酸浓度至83.33 mmol·L−1,柴油降解率下降了16.67%。这是因为过量的柠檬酸作为有机物,会与柴油污染物竞争体系中的活性自由基等氧化剂,从而降低柴油的降解率[16]。综上所述,采用CaO2类Fenton体系降解石油污染的最优条件为:CaO2 166.67 mmol·L−1,Fe(Ⅲ) 27.78 mmol·L−1,柠檬酸27.78 mmol·L−1。在此条件下反应24 h,柴油的降解率可达44.14%。
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Alpha多样性通过分析单个样品来反映微生物群落组成的多样性和丰度情况[17]。Alpha多样性包含多个衡量指标,分别通过不同的算法来估算微生物的多样性和丰度。其中,Shannon和Simpson指数常被用来反映物种的多样性程度,前者大小与多样性程度呈正相关,后者则与之呈负相关;Sobs、Chao1和ACE指数均被用来衡量微生物物种丰度的大小,其数值越高,物种的丰度越大;测序深度指数用于衡量各样本文库的覆盖率,其数值越高,则样本中物种被测出的概率越高。图4反映了类Fenton处理前后土壤原著微生物群落的丰富度和多样性变化情况。由图4可知,各样本的测序深度均在98%以上,说明测序结果反映了各样本微生物的真实情况。与未处理的土壤相比,H2O2类Fenton处理后的土壤的Shannon指数下降了21.77%,而CaO2类Fenton处理后的土壤的Shannon指数则上升了2.8%;H2O2类Fenton处理后的土壤的Simpson指数上升了350%,而CaO2类Fenton处理后的土壤的Simpson指数下降了25%。这表明,H2O2类Fenton处理对土壤微生物群落的物种多样性有明显的抑制作用,而CaO2类Fenton处理对土壤微生物群落的物种多样性有促进作用。另外,在物种丰度指数方面,与未处理的土壤相比,H2O2类Fenton处理后的土壤的Sobs、Chao1和ACE指数均有所下降,而CaO2类Fenton处理后的土壤的Sobs、Chao1和ACE指数则分别增加了14.78%、22.39%、21.32%。这表明,H2O2类Fenton处理对土壤微生物群落组成的丰富度有抑制作用,而CaO2类Fenton处理对土壤微生物群落组成的丰富度有明显的促进作用。
各样本在处理后继续恒温培养48 h的实验结果如图4(c)和图4(d)所示。可以看出,H2O2类Fenton处理组的微生物丰度和多样性水平在完成反应的48 h后有明显下降。以丰度指数Sobs和多样性指数Shannon为例,2种指数的降幅分别由最初培养的18.32%和21.77%增至培养48 h的49.36%和31.61%。与最初培养的结果类似,CaO2类Fenton处理组培养48 h的Alpha多样性指数与对照组相比有一定的提升。这表明H2O2类Fenton处理对土壤微生物可能造成一定程度的持续毒性作用。
造成以上结果的原因主要是:H2O2类Fenton体系反应速率快,反应程度剧烈,在短时间内,大幅提升了反应体系的氧化还原电位,从而抑制了微生物的生长;而CaO2类Fenton体系相对温和的反应机制降低了其对微生物的抑制作用。另有研究[18-19]表明,CaO2可以通过分解供氧、刺激生物酶活性、促进微生物代谢、降解污染物等多个方面来强化微生物修复效果。因此,CaO2类Fenton处理有益于提高土壤微生物群落的物种多样性及丰度。
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图5反映了各实验组微生物群落组成在门水平上的差异性。可以看出,未经处理的原受试土样微生物群落的优势菌门组成为Actinobacteria (35.21%)、Proteobacteria (28.56%)和Acidobacteria (15.09%)。经H2O2类Fenton处理后,上述3种菌门所占比例均明显下降,分别下降了24.63%、25.39%和14.02%;而未处理前占极小比例(0.95%)的Firmicutes在处理后增加到79.4%,成为主要优势菌门且占比远高于其他优势菌门。相较而言,CaO2类Fenton处理后的Firmicutes占比同样有一定程度的提升,提升到16.22%,而在未处理前为主要优势菌门的Actinobacteria、Proteobacteria和Acidobacteria均有所下降,分别下降了2.37%、12.64%和4.25%。以上结果表明,CaO2及H2O2类Fenton处理影响了土壤微生物优势菌门的组成,类Fenton处理明显激活并促进了Firmicutes的生长,同时抑制了土壤原著优势菌群的生长。土壤中优势菌门的构成比例变化可能会影响土壤有机质的代谢。有研究[20]表明,Proteobacteria的相对丰度与土壤有机质含量呈显著正相关,其处理后相对丰度占比下降可能与土壤有机质含量的降低有关;Firmicutes可释放细胞胞外酶,促进半纤维素、纤维素和蛋白质的降解和水解,在土壤类富里酸的合成和腐殖化过程中起着重要作用[21-22]。因此,CaO2及H2O2类Fenton处理可能会促进土壤后期有机质的降解和腐殖化进程。
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图6反映了CaO2及H2O2类Fenton处理对土壤中豌豆植株的发芽率、植株株高、干重和叶绿素含量的影响。由图6可知,相比于未处理的土壤,H2O2类Fenton处理后土壤培育的豌豆发芽率、植株株高、干质量和叶绿素含量与未处理相比分别下降了72.73%、93.22%、97.3%和98.59%;而CaO2类Fenton处理后土壤培育的豌豆发芽率、植株株高、干质量和叶绿素含量分别下降了5.45%、5.39%、10.02%和15.14%。以上结果表明,CaO2及H2O2类Fenton处理对豌豆的生长均有一定的抑制作用。相较而言,CaO2类Fenton处理对豌豆生长的影响比H2O2类Fenton处理的影响更小。这主要是因为CaO2类Fenton体系有更温和的反应机制。经2种类Fenton处理后,空白组、H2O2及CaO2类Fenton处理组的Eh分别为(116±4.2)、(557±11.3)和(297±18.2) mV,H2O2类Fenton处理组的Eh约为CaO2类Fenton处理组相应值的1.8倍,由此推测,H2O2类Fenton处理后,体系中残留的活性氧(ROS)浓度较CaO2类Fenton组更高,超出了豌豆种子抗氧化酶系统转化和降解ROS的能力,从而导致H2O2类Fenton组豌豆的发芽率等4项指标远低于未处理组。相反,CaO2类Fenton处理由于氧化剂本身的长效性及缓释性,体系中Eh维持较低水平且仍释放低水平的H2O2。
陈颖等[23]研究表明,低浓度的H2O2(0.5~5.0 mmol·L−1)可提高银杏细胞中SOD和CAT酶的活性;张晓龙等[24]使用1.5 mmol·L−1 H2O2处理黄瓜幼苗12 h,处理后,SOD、CAT等酶的活性增强,同时显著降低了O2·-的生成速率。GAO等[25]使用0.5 mmol·L−1 H2O2处理本研究同一品种豌豆植株,处理后,豌豆植株的株高和干重有所提高。结合上述研究分析,CaO2类Fenton处理24 h后,体系中低浓度H2O2可能在一定程度上增强了豌豆植株的抗氧化酶活性,并缓解了类Fenton体系对其造成的氧化胁迫作用,导致CaO2类Fenton组豌豆的生长及发育受到相对较小的抑制影响。
此外,CaO2类Fenton体系在反应中释放的钙离子在植物生长过程中也起着至关重要的作用,从而间接促进了豌豆植株的生长。CORPAS等[26]研究发现,钙离子是植物细胞多种代谢过程的关键性调控因子,植物细胞的过氧化物酶蛋白如分解H2O2的H2O2酶、乙醇酸循环中的乙醇酸氧化酶等活性均会受到钙离子含量的影响。因此,CaO2类Fenton体系比H2O2类Fenton体系对植物生长的毒性效应更小。
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1) CaO2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸类Fenton体系可有效降解土壤中柴油污染。在相同条件下,CaO2类Fenton体系较H2O2类Fenton体系具有更好的降解效果。
2)土壤中柴油的去除率会随着氧化剂的投加量、Fe(Ⅲ)浓度及柠檬酸浓度的增加而先增加后减少。当CaO2浓度为166.67 mmol·L−1,Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L−1,柠檬酸浓度为27.78 mmol·L−1时,反应24 h后,土壤中柴油降解率达到44.14%。
3) CaO2类Fenton处理后土壤微生物群落的丰富度和多样性指数均有所提高,H2O2类Fenton处理后则均有所降低,2种处理方式均改变了土壤微生物群落的优势菌门组成及比例。
4) CaO2类Fenton处理和H2O2类Fenton处理前后豌豆的发芽率、植株干质量、株高和叶绿素含量均有所降低,其中CaO2类Fenton体系比H2O2类Fenton体系对植物生长的毒性效应更小。
CaO2及H2O2类Fenton降解土壤石油烃污染
Degradation of total petroleum hydrocarbons pollution in soil by CaO2/H2O2-Fenton-like system
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摘要: 采用H2O2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸类Fenton体系和CaO2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸类Fenton体系修复土壤石油污染,考察了氧化剂种类、氧化剂投加量、Fe(Ⅲ)浓度和柠檬酸浓度对柴油降解效果的影响,并进一步研究比较了CaO2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸和H2O2/Fe(Ⅲ)/柠檬酸2种修复方式对土壤原著微生物群落变化及豌豆植株生长所带来的生态毒性效应。单因素实验结果表明:在其他条件相同的情况下,CaO2类Fenton降解柴油效果优于H2O2类Fenton降解效果;柴油降解率随着氧化剂投加量、Fe(Ⅲ)和柠檬酸浓度的增大呈现先增后降的趋势。当CaO2浓度为166.67 mmol·L−1、Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L−1、柠檬酸浓度为27.78 mmol·L−1时,反应24 h后,土壤中柴油降解率达到44.14%。生态毒性实验表明:CaO2类Fenton处理后土壤微生物群落的丰富度和多样性指数均有所提高,H2O2类Fenton处理后均有所降低,2种处理方式均在不同程度上改变了土壤微生物群落的优势菌门构成;CaO2及H2O2类Fenton处理均抑制了豌豆植株的生长,发芽率、植株干重、株高、叶绿素含量等测试指标均下降,其中H2O2类Fenton处理的抑制效果更为明显。进一步分析可知,CaO2类Fenton处理技术比H2O2类Fenton处理技术更适用于石油污染土壤修复。
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关键词:
- CaO2类Fenton /
- Fe(Ⅲ) /
- 柠檬酸 /
- 石油烃 /
- 生态毒性效应
Abstract: In this study, H2O2/Fe(Ⅲ)/citric acid and CaO2/Fe(Ⅲ)/citric acid Fenton-like systems were used to degrade total petroleum hydrocarbons (TPH) in soil, and the effects of H2O2 and CaO2 dosages, Fe(Ⅲ) and citric acid concentrations on diesel oil degradation efficiency in soil were investigated. Furthermore, the ecotoxicological effects of these two remediation modes on the variation of indigenous microbial communities in soil and pea plant growth were compared. The results showed that under the situation of other conditions being equal, CaO2-Fenton-like system had a better performance on diesel oil degradation than H2O2-Fenton-like system. The diesel oil degradation efficiency increased first and then decreased with the increase of CaO2 dosage, Fe(Ⅲ) and citric acid concentration. At CaO2 dosage of 166.67 mmol·L−1, Fe(Ⅲ) concentration of 27.78 mmol·L−1, and citric acid concentration of 27.78 mmol·L−1, the diesel oil degradation efficiency in soil reached 44.1% at 24 h. The ecotoxicological impacts showed that CaO2 -Fenton-like treatment promoted soil microbial richness and diversity indexes, while H2O2 -Fenton-like treatment reduced them. This indicated that these two treatment modes changed the compositions of soil microbes and dominant bacterial phyla in varying degrees. The CaO2 and H2O2-Fenton-like treatments inhibited the growth of pea plants, and decreased the indexes of germination rate, shoot length, plant dry weight and chlorophyll content, and H2O2-Fenton-like treatment had more serious inhibition effects. In summary, the CaO2 Fenton-like treatment is more suitable for TPH-contaminated soil remediation than H2O2 Fenton-like treatment.-
Key words:
- CaO2-Fenton-like systems /
- Fe(Ⅲ) /
- citric acid /
- total petroleum hydrocarbons /
- ecotoxicological impacts
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纳米银颗粒(silver nanoparticle,AgNPs)因其抗菌广谱、高效和不易产生耐药性等特点,广泛应用于医药、个人护理、家纺和家电等行业[1]。包含AgNPs的产品在其生产、加工、储存、使用和废弃等过程中,不可避免地直接或间接释放到环境中。据估算,约有60%的AgNPs通过污水管网进入市政污水处理厂[2],因此,污水处理系统是AgNPs重要的环境归趋。HOQUE等[3]的研究结果表明,污水中AgNPs的质量浓度一般在100~200 ng·L−1;ZHOU等[4]检测到活性污泥系统污泥中Ag质量分数可达到1.6 mg·kg−1。随着含有AgNPs材料的广泛应用,进入市政污水处理厂的AgNPs浓度会不断增加。活性污泥工艺是目前应用最广泛的污水生物处理技术,该工艺利用活性污泥(微生物聚集体)去除水中的各种污染物[5-6],包含AgNPs的污水可对活性污泥微生物活性产生抑制作用、降低出水水质、给水生生态系统带来负面影响[7-8]。
微生物群体感应(quorum sensing,QS)是指细菌自发产生、释放一些特定的信号分子,并能感知细菌群体中细胞密度变化进行种内或种间信息交流,从而调节微生物的群体行为[9]。作为高菌群密度的生态系统,活性污泥细菌的群体感应对环境变化非常敏感,可参与调控外来污染物胁迫下的自身应激代谢反应[10-11]。在污水处理系统中,细菌可分泌和释放酰基高丝氨酸内酯类(acyl-homeserine lactones,AHLs)信号分子,诱导生物膜形成并促进生物脱氮等过程[12-16]。HAN等[17]的研究表明,活性污泥系统中假单胞菌属细菌分泌AHLs并参与胞外聚合物分泌、种间竞争与脱氮等过程。污水中氮的去除是污水处理厂运行的首要目标之一[18-19]。外源投加信号分子[20-22]和群感菌[23-24]是目前利用微生物群体感应现象强化污水生物脱氮的主要方法。DE CLIPPELEIR等[20]发现,向活性污泥系统中添加适量外源AHLs信号分子可提高氨氧化速率和污泥中氨氧化菌的丰度。目前,关于AgNPs胁迫下活性污泥污水处理系统中微生物分泌AHLs信号分子的变化,以及这种变化与改进系统污染物去除效率间的关系研究鲜有报道。
因此,研究AgNPs胁迫下活性污泥污水生物处理系统的脱氮性能、AHLs对AgNPs胁迫的响应及外源添加AHLs对活性污泥脱氮效率恢复的调控,对阐明活性污泥系统中AgNPs对微生物的胁迫效应,采取可行的调控污泥微生物活性的生物措施具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 模拟活性污泥污水处理系统
以序批式反应器(sequencing batch reactors,SBRs)模拟活性污泥污水处理系统。SBRs有效容积为1.6 L,曝气系统包括空气泵和曝气头,空气流速为2.0 L·min−1。SBRs每日运行2个周期,每周期5 h,包括进水15 min、搅拌90 min、曝气90 min、静置90 min和排水15 min,非运行期的SBRs处于静置状态。SBRs启动第20 天,污泥浓度(mixed liquor suspended solids,MLSS) 和污泥容积指数(sludge volume index,SVI)分别达到(6 503±39) mg·L−1和(52.6±0.8) mL·g−1,活性污泥系统运行稳定。这时在进水中分别添加AgNPs和Ag+,开始实验。SBRs中活性污泥混合液在一个运行周期内的溶解氧(dissolved oxygen,DO)和pH分别为0.2~7.0 mg·L−1和7.5~8.4,每个运行周期内均有厌氧-好氧-缺氧交替的生境,有利于SBRs对有机物、氮、磷等污染物的去除[25]。预备实验结果表明,在1 mg·L−1 AgNPs胁迫下,AHLs在SBRs泥水混合液中的浓度常常低于文中所用UPLC-MS/MS的检测限。为了准确检测AgNPs胁迫下微生物分泌AHLs的变动,实验进水中分别添加了10 mg·L−1和20 mg·L−1的AgNPs。活性污泥系统分为5组,每组SBRs设置3个重复,5组SBRs分别为CK(进水中不添加AgNPs,也不添加Ag+),进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs,进水中分别添加3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+ (对应10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs溶解释放的Ag+浓度)。活性污泥系统运行周期内换水率为50%。
实验用AgNPs溶液购自北京德科岛金科技有限公司,AgNPs颗粒表面包被聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP),平均粒径为10~12 nm。AgNPs经超声仪(KQ-700DE,昆山市超声仪器公司)(100 W,40 kHz)超声5 min后,加入SBRs进水中。反应器进水中添加的Ag+以AgNO3配制(进水中的
-N进行相应扣减),AgNPs在纯水中溶解释放的Ag+浓度依照孙秀玥采用超滤法测得的结果[26]。NO−3 1.2 进水水质及水质指标分析方法
实验中,采用南京某市政污水处理厂浓缩池污泥作为接种污泥。实验所用污水为人工模拟中等强度的城市污水,统一用纯水配置,具体组成参见孙秀玥的研究论文[26]。配制污水所用试剂购于阿拉丁(上海)有限公司,均为分析纯。
根据《水和废水监测分析方法》[27],水质指标
-N、NH+4 -N、NO−3 -N和TN采用可见-紫外分光光度计(Shimadzu,UV-1800,Japan)测定。DO和pH分别使用便携式溶解氧仪(JPB-607A,上海雷磁仪器厂)和pH测定仪(PB-10,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)测定。泥水混合液MLSS和SVI采用水和废水标准监测方法测定[28]。化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)采用HACH COD 快速测定仪(HACH,DR1010,USA)测定。NO−2 1.3 SBRs系统中水相和泥相Ag浓度的测定
将活性污泥混合液分为污水(水相)和污泥(泥相)2个部分,分别测定污水和污泥中的Ag浓度。取曝气结束前30 min的泥水混合物,利用低温高速离心机(Centrifuge 5810R,Eppendorf,Germany)在4 ℃和20 000 r·min−1条件下离心30 min,过0.45 μm 醋酸纤维滤膜(Whatman,USA),滤液即为污水。将剩余部分即污泥置于110 ℃烘箱中烘干至恒重,冷却至室温后研磨,过100目筛后备用[29]。在污泥中加入4 mL浓盐酸和1 mL浓硝酸,采用石墨炉消煮仪(SH220,上海海能仪器股份有限公司)消解。消煮残渣置于20 mL体积分数为50%的氨水中浸泡。污泥中的Ag浓度为消煮污泥中Ag浓度与消煮残渣的浸泡液Ag浓度之和。采用ICP-MS/MS (NexION 300,PerkinElmer,USA)测定污水和污泥中Ag浓度,加标回收率在96%以上。
1.4 细菌DNA提取与16S rDNA高通量测序
采用DNA提取试剂盒(MoBIO Laboratories,Inc,USA)提取活性污泥中细菌DNA,提取成功后涡旋混匀,用微量分光光度计(Thermo,NanoDrop 2000c,USA)测定DNA浓度(核酸纯度A260/A280>1.8),DNA样品保存于-20 ℃冰箱。
活性污泥DNA样品由MiSeq平台进行Illumina高通量测序(上海凌恩生物科技有限公司)。PCR扩增通用引物为515F(GTGCCAGCMGCCGCGG)和907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)。使用QIIME(quantitative insights in microbial ecology)软件对所得序列进行生物信息学处理。利用UCLUST分类器对有效序列进行聚类,将相似性高于97%的序列归为一个分类单元(operational taxonomic units,OTU)。OTU采用贝叶斯算法(http://rdp.cme.msu.edu/)与Silva(SSU123)核糖体数据库进行对比进行聚类分析和物种分类学分析,利用R Studio进行分析并作图。
1.5 SBRs中污水AHLs提取与检测
将SBRs中的泥水混合物于4 ℃和20 000 r·min−1下离心30 min,收集50 mL上清液,过0.45 μm醋酸纤维滤膜,采用固相萃取(solid-phase extraction,SPE)对上清液AHLs进行提纯和富集[30]。具体步骤为:依次向Oasis HLB固相萃取柱(Waters,上海)加入5 mL甲醇和5 mL超纯水活化萃取柱;50 mL过膜(0.45 μm)后的上清液以<1 mL·min−1的流速过柱;采用5 mL体积分数为10%的甲醇水溶液淋洗萃取柱;氮气吹干;最后加入5 mL乙腈洗脱,收集洗脱液,氮气吹洗脱液至近干,加入1 mL乙腈重新溶解,洗脱液过0.22 μm有机滤膜后,密封遮光保存于−20 ℃冰箱,用于后续检测分析。
采用UPLC-MS/MS超高效液相色谱串联质谱仪(Xevo TQ-Smicro,Waters,USA)定量检测活性污泥混合液水相中N-丁酰基-高丝氨酸内酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone,C4-HSL)、N-己酰基-高丝氨酸内酯 (N- hexanoyl -L -homoserine lactone,C6-HSL)、N-辛酰基-高丝氨酸内酯 (N- octanoyl -L -homoserine lactone,C8-HSL)、N-癸酰基-高丝氨酸内酯(N- decanoyl -L -homoserine lactone,C10-HSL)、N-十二烷酰基-高丝氨酸内酯 (N- dodecanoyl -L -homoserine lactone,C12-HSL)和N-十四烷酰基-高丝氨酸内酯 (N- tetradecanoyl -L -homoserine lactone,C14-HSL) 6种信号分子。液相色谱柱BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm;Waters),运行时间为4 min,柱温为40 ℃,流动相A为含甲酸的超纯水(体积分数0.1%),B为含甲酸的乙腈(体积分数0.1%),采用梯度洗脱,流速为300 μL·min−1。质谱采用双通道多反应检测模式,离子源采用正离子模式,去溶剂气体为氮气,流量为992.0 L·h−1,锥孔气体为氩气,流量为1.0 L·h−1,离子源温度为149 ℃,去溶剂化温度为497 ℃,进样量为3 μL。活性污泥混合液中6种信号分子的加标回收率为51.22%~137.71%。
1.6 外源添加AHLs类信号分子
在反应器运行第65 天,向5组反应器中分别一次性加入浓度均为10 nmol·L−1的C6-HSL、C8-HSL和C12-HSL混合溶液,并以1.1节中相同的运行方法继续运行SBRs。
1.7 数据统计和分析方法
所有数据均采用3次重复的平均值±标准偏差来表示。数据统计和分析使用Excel 2016,采用Origin 9.2软件绘图。
2. 结果与讨论
2.1 AgNPs和Ag+对SBRs污染物去除性能的影响
1) SBRs泥水混合液中水相和泥相中Ag浓度的比较分析。取CK及进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs,3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的SBRs第1、5、10、20、30、40、50和60 天曝气阶段的泥水混合物,分别测定水相和泥相中Ag质量浓度,减去CK反应器泥水混合液中水相和泥相Ag质量浓度,结果如图1所示。SBRs运行初期,各反应器水相中Ag质量浓度分别为(636.59±1.59)、(1 120.54±66.78)、(8.13±0.60)和(11.81±1.75) μg·L−1(图1(a)),运行期间,各反应器水相中Ag质量浓度呈下降趋势。SBRs运行至第60 天,进水中分别添加10 mg·L−1 AgNPs,3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+,反应器中水相平均Ag质量浓度均降至0.25 μg·L−1以下,进水中添加20 mg·L−1 AgNPs的反应器中水相平均Ag质量浓度降至17.40 μg·L−1。
由图1(b)可知,进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs,3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的反应器污泥中Ag质量浓度运行期内较稳定,分别为8 418.88~9 806.72、16 966.49~20 118.67、2 829.25~3 002.99、5 747.96~6 140.47 μg·L−1,SBRs污泥中Ag质量浓度与理论Ag添加量相近。由此可推断,进入活性污泥系统的AgNPs和Ag+主要存在泥相中[26]。
2) AgNPs和Ag+对SBRs中氮去除效率的影响。SBRs连续运行60 d后,
-N、NH+4 -N和TN去除率以及出水NO−3 -N质量浓度变化如图2所示。由图2(a)可知,进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs的SBRs在运行期间,NO−2 -N平均去除率与CK相比分别降低了5.51%~19.62%和8.23%~36.91%;而进水中分别添加3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的反应器与CK相比,NH+4 -N平均去除率没有显著差异,均高于84.73%。这说明AgNPs对活性污泥硝化反应的抑制作用比其溶解释放出的Ag+作用更显著。其他研究者也有类似发现,如ZHANG等[18]发现,进水中分别添加1 mg·L−1和10 mg·L−1 AgNPs导致SBRs对NH+4 -N的去除率由98.8%分别降低至71.2%和49.0%,AgNPs对NH+4 -N去除有显著抑制作用。LIANG等[31]发现,1 mg·L−1 AgNPs和1 mg·L−1 Ag+使SBRs中活性污泥的比耗氧速率硝化作用(活性污泥混合液中添加NH+4 -N为底物,分别测定1 mg·L−1 AgNPs和1 mg·L−1 Ag+胁迫下活性污泥的比好氧速率,以此来代表硝化作用)分别降低了41.4%和13.5%,在相同的Ag浓度下,AgNPs对硝化作用的胁迫效应高于Ag+。NH+4 由图2(b)可知,与CK相比,进水中分别添加3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的SBRs对
-N平均去除率分别降低了2.03%~8.55%和9.17%~12.73%;而与CK相比,进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs的反应器对NO−3 -N的去除率无显著差异。自第10 天后,5组SBRs的出水NO−3 -N平均质量浓度均低于0.49 mg·L−1,结果见图2(c)。由图2(d)可知,与CK相比,运行至第10 天后,进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs,3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的SBRs中,TN平均去除率分别下降了0.93%~9.22%、3.34%~8.36%、1.87%~6.05% 和1.95%~9.14%。在60 d的运行期间内,进水中添加20 mg·L−1 AgNPs的反应器对TN去除率显著低于CK。SBRs运行至第60 天时,CK与进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs,3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的活性污泥系统对COD的平均去除率分别为93.93%、71.84%、47.25%、93.49%和92.07%。从实验结果来看,进水中添加AgNPs对活性污泥微生物硝化作用的抑制影响更明显,导致NO−2 -N去除率下降,因而转化成NH+4 -N的比例降低;Ag+对活性污泥微生物反硝化作用的抑制效应较明显,但很有可能因为AgNPs抑制NO−3 -N转化为NH+4 -N,使得微生物反硝化作用的底物减少,从而导致表观上外源添加AgNPs对NO−3 -N去除率的抑制影响低于Ag+;AgNPs对活性污泥微生物去除有机碳的抑制效应明显高于其溶解释放的Ag+。NO−3 2.2 AgNPs和Ag+对活性污泥中脱氮细菌相对丰度的影响
为了研究AgNPs及其释放出的Ag+对SBRs脱氮效率影响的原因,采用16S rDNA高通量测序法分析了活性污泥微生物群落结构。图3为反应器运行至第60 天时,相对丰度>0.010%的典型硝化和反硝化细菌属水平热图。CK与进水中添加20 mg·L−1 AgNPs的SBRs中亚硝酸菌属Nitrosomonas[32]的平均相对丰度分别为0.160%和0.070%;进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs的SBRs中具有硝化功能的Novosphingobium[33]的平均相对丰度从CK反应器的0.034%下降到0.005%和0.002%,AgNPs对活性污泥硝化菌的胁迫作用与浓度有关;进水中分别添加3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的反应器与CK相比,反硝化菌Dechloromonas和Caldilineaceae[34]的平均相对丰度分别由6.100%和0.270%下降到4.700%和4.700%,0.180%和0.110%。动胶菌属zoogloea可以硝酸盐作为电子受体进行反硝化反应[35],进水中分别添加3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的反应器中zoogloea平均相对丰度从CK反应器的0.220%下降到0.090%和0.090%。AgNPs及其释放出的Ag+可以通过影响硝化菌和反硝化菌的相对丰度,从而影响活性污泥系统的脱氮效率。
2.3 AgNPs对活性污泥微生物分泌AHLs信号分子浓度的影响
采用UPLC-MS/MS分别检测运行至第60天时的CK与进水中添加10 mg·L−1 AgNPs反应器中活性污泥微生物分泌的6种AHLs信号分子的浓度,结果如图4所示。CK中C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL的浓度分别为(2.00±0.08)、(0.27±0.06)、(0.41±0.06)、(0.81±0.02)、(2.02±0.06)和(1.45±0.21) nmol·L−1。WANG等[36]检测离心后生物膜中C4-HSL和C12-HSL的最高浓度为0.6 nmol·g−1;SUN等[37]检测到活性污泥中含量最高的AHLs信号分子为C8-HSL,浓度达1.3 nmol·L−1。进水中添加10 mg·L−1 AgNPs反应器中只检测到C4-HSL、C6-HSL和C10-HSL 3种信号分子,其平均浓度分别为CK反应器中的1.7、0.8和1.1倍。因而,10 mg·L−1 AgNPs添加于SBRs进水中可导致活性污泥微生物分泌AHLs信号分子的数量发生变化,C4-HSL平均浓度显著增高,也可导致AHLs信号分子种类减少,其中C8-HSL、C12-HSL和C14-HSL均未检出。
2.4 外源加入AHLs信号分子对SBRs中污染物去除效能的影响
反应器运行至第65天时,外源加入混合AHLs。与加入前(第60 天)相比,CK与进水中分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs,3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+的反应器对
-N平均去除率分别降低了24.52%、28.04%、5.01%、20.73%和16.76%;对NH+4 -N平均去除率分别增加了13.33%、11.41%、5.82%、18.25%和8.06%;各反应器出水NO−3 -N浓度均有所降低,降低幅度最大的SBRs(进水分别添加3 mg·L−1和6 mg·L−1 Ag+)中出水NO−2 -N平均质量浓度降低了0.21 mg·L−1。外源加入AHLs后,进水分别添加10 mg·L−1和20 mg·L−1 AgNPs的反应器中的TN平均去除率升高,运行至第70 天时,TN平均去除率达到最大值,分别为93.01%和89.82%(图5)。综合上述结果可知,外源加入混合AHLs可在5~10 d内导致AgNPs和Ag+胁迫下反应器对NO−2 -N平均去除率降低,对NH+4 -N的平均去除率升高,且可显著提高AgNPs胁迫下反应器对TN的平均去除率。朱颖楠等[38]指出,C6-HSL可调控生物膜修复和强化脱氮。张向晖等[39]发现,外源添加0.5 g·L−1的C6-HSL和C8-HSL会抑制厌氧氨氧化菌群生长,但能提高活性污泥的脱氮性能。外源加入混合AHLs的种类、数量对其调控污水处理反应器中微生物的脱氮性能都有影响。NO−3 3. 结论
1)进入活性污泥系统中的AgNPs及其释放的Ag+主要存在污泥中,可影响活性污泥中硝化细菌和反硝化细菌相对丰度,抑制活性污泥微生物硝化和反硝化作用,从而降低活性污泥对TN的去除效率。
2) AgNPs胁迫影响活性污泥微生物分泌AHLs信号分子的数量和种类。10 mg·L−1 AgNPs胁迫下反应器中C4-HSL平均浓度与CK相比显著提升1.7倍,而C8-HSL、C12-HSL和C14-HSL 3种信号分子浓度则低于检测限。
3) 10 mg·L−1 AgNPs胁迫下的活性污泥反应器在外源加入混合AHLs 5 d后TN平均去除率由69.41%提高至93.04%,但AHLs的调节作用受种类、数量等因素影响,需要进一步开展研究。
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