亚硝酸盐氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)在生物硝化反应中驱动${\rm{NO}}_2^{-}$-N氧化为${\rm{NO}}_3^{-}$-N的过程，对于工业、养殖业水体净化修复至关重要。NOB严格好氧，是一类以CO₂为唯一碳源、${\rm{NO}}_2^{-}$-N为能源的自养细菌，生长代时普遍在10 h以上^[1]，生长率低，对环境因素极为敏感，这些特点限制了NOB菌株的分离纯化和机理研究^[2]。随着工农业废水中重金属和抗生素累积的问题日益突出，过高的重金属、抗生素影响微生物群落结构和代谢功能，进而影响生态系统的净化修复特别是硝化细菌生物脱氮能力，故有必要对其进行进一步探讨。

由于NOB分离和纯培养较为困难，目前其菌种资源并不多，国内外研究多集中于以硝化活性污泥为材料的资源开发及其种群生态分布的研究上，且大多为基于氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)的研究。王勤^[3]的研究表明，在生物脱氮系统中，应控制重金属Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、Cd²⁺的质量浓度分别不高于0.5、30、0.5、5 mg·L⁻¹；TIAN等^[4]的研究表明，50 mg·L⁻¹的链霉素可以完全抑制生物膜废水处理系统中的硝化反应；KATIPOGLU等^[5]的研究表明，对活性污泥系统连续供给50 mg·L⁻¹的盐酸四环素，硝化细菌活性丧失，NOB在系统中相对丰度降低了10倍。在实际应用上，NOB菌株世代时间长、数量少、对环境敏感，导致硝化效果欠佳，对比探究NOB和硝化菌群在环境胁迫下的活性变化对废水脱氮应用有一定理论意义，而基于不同重金属、抗生素胁迫下比较NOB和硝化菌群脱${\rm{NO}}_2^{-}$-N效果的研究尚未见报道。

本研究采集珠江水样富集硝化菌群，并分离纯化一株NOB，考察了不同浓度重金属离子和抗生素对菌株亚硝酸盐氧化能力的影响，探究了菌株在环境胁迫下的一般规律，再对比NOB和硝化菌群富集物(初始NOB数量相等情况下)在不同种重金属和抗生素胁迫下的亚硝酸盐氧化活性的变化，以期为NOB的研究及其在工业、养殖业水体净化的实际应用提供参考。

1.   材料与方法

1.1   材料、试剂和仪器

所用化学试剂均为分析纯；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209，北京天根生化科技有限公司)；零背景pTOPO-TA克隆载体试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；TransStart® Tip Green qPCR SuperMix(AQ142-11，北京全式金生物技术公司)。富集硝化菌群的水样取自珠江穗石码头。

紫外-可见光分光光度计(UV-2800A，上海尤尼柯仪器有限公司)；立式压力蒸汽灭菌锅(GI80DP，美国致微仪器有限公司)；振荡培养箱(ZQLY-180G，上海知楚仪器有限公司)；pH测量仪(HQ40d，美国Hach公司)；超微量紫外可见光分光光度计(Nano Drop 1000，美国Thermo Fisher公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，美国Thermo Fisher公司)。

1.2   培养基

NOB液体培养基：0.5 g·L⁻¹ KCl，0.485 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O，1 g·L⁻¹ NaCl，0.3 g·L⁻¹ KH₂PO₄，0.1 g·L⁻¹ CaCl₂·2H₂O。以上成分高压蒸汽灭菌冷却后，加入过0.22 μm滤膜除菌的NaHCO₃、NaNO₂、微量元素母液，使其在培养基中的含量最终分别为2.5 mmol·L⁻¹、10 mmol·L⁻¹、体积分数1‰。在NOB液体培养基中加入质量分数为1.6%的琼脂。硝化菌群富集培养基：NOB液体培养基中NaNO₂替换为等浓度NH₄Cl。微量元素母液^[6]：10 mL 浓HCl，2.1 g·L⁻¹ FeSO₄·7H₂O，0.062 g·L⁻¹ H₃BO₃，0.017 g·L⁻¹ CuCl₂·2H₂O，0.100 g·L⁻¹ MnC1₂·4H₂O，0.036 g·L⁻¹ Na₂MoO₄·2H₂O，0.070 g·L⁻¹ ZnCl₂，0.190 g·L⁻¹ CoCl₂·6H₂O，0.024 g·L⁻¹ NiCl₂·6H₂O。

1.3   实验方法

1)硝化菌群的富集和NOB的分离纯化。将10 mL珠江穗石码头水样接入装有90 mL富集培养基的锥形瓶中，在30 ℃、150 r·min⁻¹条件下振荡培养，每隔2 d取样检测${\rm{NH}}_4^{+}$-N、${\rm{NO}}_2^{-}$-N、${\rm{NO}}_3^{-}$-N的含量，初始${\rm{NH}}_4^{+}$-N被AOB氧化为${\rm{NO}}_2^{-}$-N，接着${\rm{NO}}_2^{-}$-N被NOB氧化为${\rm{NO}}_3^{-}$-N，完成硝化过程。当硝化率达90%以上时，以10%体积比接种到新鲜富集培养基继续培养，以此获得稳定硝化菌群富集物，提取富集物DNA送至金唯智生物公司高通量测序。将富集液稀释涂布于NOB固体培养基平板上，在30 ℃恒温培养箱倒置培养28 d以上，挑取NOB单菌落至液体培养基进一步纯化，通过光学显微镜、扫描电镜观察NOB形态。

2) NOB的鉴定。以NOB菌液作为模板，用细菌16S rDNA通用引物^[7]27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR。PCR反应体系(25 μL)：2 μL NOB菌液，27F和1492R(10 μmol·L⁻¹)各0.5 μL，12.5 μL 2×Master Mix，9.5 μL ddH₂O。PCR反应条件：94 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。使用胶回收试剂盒回收纯化16S rDNA，采用零背景pTOPO-TA克隆载体试剂盒进行T-A克隆，经菌落PCR检测出阳性转化子并送至金唯智生物科技有限公司测序。将16S rDNA完整序列通过BLAST与Genebank数据库比对后，选择相似度较高的序列，用MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统进化树并分析同源性。

3)重金属、抗生素对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响。将NOB种子液以10%体积比接种至液体培养基中(初始${\rm{NO}}_2^{-}$-N为80 mg·L⁻¹)，添加不同重金属、抗生素设置单一变量，在30 ℃、150 r·min⁻¹的条件下振荡培养，每12 h取样检测${\rm{NO}}_2^{-}$-N含量。通过参考文献^[3-5,8]及预实验设定重金属实验组质量浓度梯度为Cu²⁺(0、1、5、10、20 mg·L⁻¹)、Zn²⁺(0、1、2、3、5 mg·L⁻¹)、Cd²⁺(0、1、5、10、20 mg·L⁻¹)、Mn²⁺(0、5、20、50、70 mg·L⁻¹)、Cr⁶⁺(0、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L⁻¹)；抗生素实验组质量浓度梯度为卡那霉素(0、1、5、10 mg·L⁻¹)、氨苄青霉素(0、1、2、3 mg·L⁻¹)、链霉素(0、1、3、5 mg·L⁻¹)、盐酸四环素(0、10、20、50 mg·L⁻¹)。

4)重金属、抗生素胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响。通过绝对定量qPCR检测NOB种子液和硝化菌群富集物中NOB的绝对数量(以nxrA基因拷贝数计)：nxrA引物^[9]F1370F1(5′-CAGACCGACGTGTGCGAAAG-3′)和F2843F2(5′-TCCACAAGGAACGGAAGGTC-3′)。使用nxrA的胶回收产物作为标准品。采用改良CTAB法提取DNA^[10]。绝对定量qPCR体系与程序参考TransStart® Tip Green qPCR SuperMix试剂盒(全式金，北京)说明书。

选择一组合适的重金属离子、抗生素质量浓度(显著影响NOB氧化活性但不完全抑制活性，NOB完全耗完底物时间为无添加组的1.5倍以上)，比较NOB初始接种量相等情况下NOB和硝化菌群富集物对重金属、抗生素单一因素胁迫的亚硝酸盐氧化响应。其中重金属组：5 mg·L⁻¹ Cu²⁺、1 mg·L⁻¹ Zn²⁺、10 mg·L⁻¹ Cd²⁺、20 mg·L⁻¹ Mn²⁺、0.8 mg·L⁻¹ Cr⁶⁺；抗生素组：0.5 mg·L⁻¹ 卡那霉素、0.5 mg·L⁻¹氨苄青霉素、1 mg·L⁻¹ 链霉素、30 mg·L⁻¹ 盐酸四环素。NOB和硝化菌群富集物种子液接种量依据qPCR结果设定(见表1)，使NOB和硝化菌群实验组中初始NOB数量相等；摇床条件设为30 ℃、150 r·min⁻¹，每12 h取样检测${\rm{NO}}_2^{-}$-N含量。

表 1  种子液qPCR结果及接种体积

Table 1.  qPCR results and inoculation volume of seed liquid

种子液	nxrA拷贝数/(拷贝·mL−1)	接种量/%
NOB	7.54×106±5.82×105	2.000
硝化菌群富集物	2.49×106±4.16×104	6.056

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1.4   分析方法

${\rm{NH}}_4^{+}$-N采用靛酚蓝法测定^[11]；${\rm{NO}}_2^{-}$-N采用N-(1-萘基)-乙二铵光度法测定^[11]；${\rm{NO}}_3^{-}$-N采用离子色谱法测定^[12]；pH通过pH计(HQ40d，美国Hach公司)测量；NOB nxrA质量浓度通过超微量紫外可见光分光光度计(Nano Drop 1000，美国)测定，标准品拷贝数按照式(1)计算；NOB nxrA基因绝对拷贝数量使用实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，美国)和7500 Software v2.3检测分析。

式中：c为NOB nxrA质量浓度，ng·μL⁻¹；L为nxrA片段长度，320 bp。

2.   结果与讨论

2.1   环境样与硝化菌群富集物高通量分析

在属水平统计珠江水环境样、富集物群落组成情况如图1所示。在富集培养过程中，AOB、NOB以及Pseudomonas逐渐成为优势菌群。在15代硝化菌群富集培养中，Pseudomonas由环境样0.88%增长到第15代的72.18%，成为富集物的主要优势菌种之一；Nitrosomonas丰度由0.11%升高至10.04%；Nitrobacter的丰度由0.014%上升到2.10%；环境样中Nitrospira、Candidatus Nitrotoga、Nitrospina等属的NOB在第15代富集物中检测不到。有研究表明，Nitrobacter的亚硝酸盐半饱和常数(K_m,NO2-)为40~1 380 μmol·L⁻¹，Nitrospira的亚硝酸盐半饱和常数为9~27 μmol·L⁻¹，Nitrospira具有更高${\rm{NO}}_2^{-}$-N亲和力，生长速率低，适合在低浓度${\rm{NO}}_2^{-}$-N下缓慢生长^[13-14]；Nitrososphaera与Nitrosomonas同样具有这种关系。这解释了10 mmol·L⁻¹ ${\rm{NH}}_4^{+}$-N和${\rm{NO}}_2^{-}$-N的选择压力下Nitrosomonas和Nitrobacter分别成为优势AOB、NOB且丰度升高的现象。

图 1  环境样和硝化菌群富集物的细菌群落丰度变化

Figure 1.  Bacterial abundance changes of environmental sample and nitrifying bacteria enrichment

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2.2   NOB的形态及分子生物学鉴定

NOB的菌落形态和细胞形态如图2所示。培养30 d，长出来NOB菌落呈针尖大小，色泽淡黄，平实不透明，边缘及表面光滑，直径0.2~0.3 mm，直径随培养时间的延长而增大(图2(a)和图2(b))；培养45 d，直径约0.5 mm。结晶紫染色结果显示：NOB为分散排列、无芽孢、两端钝圆的短杆状细菌，细胞大小为0.5~1.0 μm(图2(c))。扫描电镜成像显示：NOB呈杆状，细胞表面完整、光滑(图2(d))。

图 2  NOB的菌落形态和细胞形态

Figure 2.  Colony and cell morphologies of NOB

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菌株NOB1的16S rDNA序列在GenBank数据库通过BLAST检索对比，结果表明，NOB1与Nitrobacter winogradskyi Nb-255模式菌株相似度最高，达到99.58%。基于16S rDNA序列构建系统发育树，如图3所示，NOB1与Nitrobacter winogradskyi Nb-255同源性最高，且与各Nitrobacter处于同一聚类。

图 3  16S rDNA序列系统发育树

Figure 3.  Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

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2.3   重金属、抗生素对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响

1)重金属对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响。不同浓度的Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响情况如图4所示。可以看出，在5种重金属组中，亚硝酸盐氧化活性随重金属浓度的变化规律基本一致，均随重金属离子浓度升高而其活性抑制作用增强。以Cu²⁺组为例，Cu²⁺添加量为0 mg·L⁻¹时亚硝酸盐氧化速率最快，在第3 天基本消耗完底物，脱${\rm{NO}}_2^{-}$-N率达到97.58%；在Cu²⁺添加量为1、5、10 mg·L⁻¹组中，分别在第4.5、6.5、8 天基本消耗完初始添加的${\rm{NO}}_2^{-}$-N，表明NOB亚硝酸盐氧化速率随Cu²⁺浓度升高而降低；Cu²⁺质量浓度为20 mg·L⁻¹时的亚硝酸盐氧化速率介于1 mg·L⁻¹与5 mg·L⁻¹组之间，其原因是Cu²⁺添加量较高(根据Ksp(Cu(OH)₂)=2.2×10⁻²⁰计算出20 mg·L⁻¹ Cu²⁺开始沉淀pH为5.92)，形成可见的Cu(OH)₂沉淀，毒害性随之减小，同样的现象亦存在于5 mg·L⁻¹的Zn²⁺实验组。从5种重金属离子对NOB亚硝酸盐氧化速率的影响来看，对NOB亚硝酸盐氧化活性抑制作用为Cr⁶⁺>Zn²⁺>Cu²⁺>Cd²⁺>Mn²⁺。重金属对微生物的损害主要体现为破坏细胞膜、抑制生物大分子合成^[15]。有学者研究^[16-18]表明，当添加Cu²⁺≥30 mg·L⁻¹、Cd²⁺≥10 mg·L⁻¹、Cr⁶⁺≥5 mg·L⁻¹时对硝化脱氮过程有显著影响，这些研究是以硝化活性污泥作为材料，活性污泥可能通过沉淀、吸附或吸收重金属而降低毒性，相比于单一菌株，活性污泥可能对重金属胁迫有更好的抗性^[19]，所以这些研究中的结果略高于本研究中的单一NOB菌株。

图 4  重金属对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响

Figure 4.  Effects of heavy metals on nitrite oxidation activity of NOB

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2)抗生素对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响。不同浓度卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素、盐酸四环素对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响如图5所示。可以看出，除盐酸四环素外，其他3种抗生素对NOB亚硝酸盐氧化活性起到显著的抑制作用。空白对照组在第2.5 天氧化完${\rm{NO}}_2^{-}$-N；卡那霉素或氨苄青霉素≥1 mg·L⁻¹时，NOB在培养前期表现较弱的亚硝酸盐氧化活性，随着培养时间的延长，NOB受抗生素毒害作用加深，活性逐渐殆尽；NOB对盐酸四环素的耐受性较强，添加盐酸四环素≤10 mg·L⁻¹时NOB亚硝酸盐氧化活性几乎不受影响，盐酸四环素为20 mg·L⁻¹时NOB活性略有降低，在高达50 mg·L⁻¹时，盐酸四环素才对NOB表现出较明显的抑制效果，但脱${\rm{NO}}_2^{-}$-N率仍能在第4 天达到90.02%。以质量浓度1 mg·L⁻¹抗生素的脱${\rm{NO}}_2^{-}$-N率为依据判断4种抗生素对NOB亚硝酸盐氧化速率的影响，对NOB亚硝酸盐氧化活性抑制作用强弱顺序为氨苄青霉素>卡那霉素>链霉素>盐酸四环素。

图 5  抗生素对NOB亚硝酸盐氧化活性的影响

Figure 5.  Effects of antibiotics on nitrite oxidation activity of NOB

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2.4   重金属和抗生素胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响

1) NOB和硝化菌群绝对定量。NOB和硝化菌群富集物中nxrA绝对定量结果见表1，可以看出NOB纯培养种子液中NOB的绝对拷贝数要高于硝化菌群富集物的，前者数量约为后者的3倍。为使两者初始接种NOB量相等，NOB种子液和硝化菌群种子液的接种量分别为2.000%和6.056%。

2)重金属胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响。重金属胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响结果如图6所示。可以看出，在重金属离子胁迫作用下，硝化菌群富集物的亚硝酸盐氧化速率均高于NOB组。以5 mg·L⁻¹ Cu²⁺组为例，NOB对照和实验组分别于第3.5和5 天氧化完底物，硝化菌群对照和实验组的亚硝酸盐氧化速率更快，在第2 天的脱${\rm{NO}}_2^{-}$-N率分别达到100%和90.08%。同时，值得注意的是，硝化菌群对照组和实验组的亚硝酸盐氧化速率几乎一致，而NOB对照组和实验组的亚硝酸盐氧化速率差异显著。这表明NOB组在5 mg·L⁻¹ Cu²⁺胁迫作用下活性受到显著影响，而硝化菌群组则几乎不受到5 mg·L⁻¹ Cu²⁺的抑制作用。同样的现象发生也在1 mg·L⁻¹ Zn²⁺和20 mg·L⁻¹ Mn²⁺实验组。由此可见，在初始NOB数量相等情况下，NOB纯培养物在铜、锌、镉、锰、铬等重金属胁迫下的抗逆性和稳定性略显不足，而硝化菌群富集物亚硝酸盐氧化活性和稳定性更高，抗重金属胁迫能力更强，实际应用潜力更大。硝化菌群富集物中除了NOB、AOB，还有丰富的微生物群落，其中Pseudomonas、Rhizobiaceae、Burkholderiaceae等占比较大，分别达到72.18%、2.04%、1.39%。有研究^[20-22]表明，这些微生物有较强分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)能力。EPS上的羧基、羟基、磷酰基等阴离子基团是吸附Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺等重金属离子的主要位点^[23-24]。此外，有的微生物还有离子通道、重金属外排、氧化还原等复杂的胞内解毒机制，如Cr⁶⁺可以竞争${\rm{SO}}_4^{2-}$转运蛋白结合位点，细菌相关蛋白表达水平升高从而解毒^[25]。这些研究结论与本研究中观察到的硝化菌群富集物稳定性更高、亚硝酸盐氧化速率更快等现象一致。

图 6  重金属胁迫对NOB和硝化菌群活性的影响

Figure 6.  Effects of heavy metals stress on the activity of NOB and nitrifying bacteria flora

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3)抗生素胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响。4种抗生素胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响结果如图7所示。对比NOB与硝化菌群富集物组可以看出，在不同抗生素胁迫下，后者的亚硝酸盐氧化速率均高于前者。以0.5 mg·L⁻¹卡那霉素组为例，在无添加卡那霉素的情况下，NOB和硝化菌群分别在第5、3.5 天消耗完底物。NOB对抗生素敏感，在0.5 mg·L⁻¹卡那霉素胁迫下，NOB和硝化菌群组的亚硝酸盐氧化活性均受到显著抑制作用，培养前期氧化速率较缓慢，随着培养时间的延长受毒害作用加深，亚硝酸盐氧化活性逐步降低，第6 天NOB和硝化菌群组的脱${\rm{NO}}_2^{-}$-N率分别为24.60%和77.18%，在抗生素的抑制作用下，硝化菌群的亚硝酸盐氧化能力仍高于NOB。在硝化系统中，微生物主要通过外排泵、核糖体保护机制、以及破坏活性位点等方式抵抗抗生素；ZHANG等^[26]的研究表明，Pseudomonas、Flavobacterium和Nocardiopsis的菌群数量与抗生素抗性基因呈正相关。本研究的高通量测序结果(图1)表明，Pseudomonas和Flavobacterium在富集物菌群中占比为73.55%。这可能是硝化菌群富集物在抗生素胁迫下亚硝酸盐氧化活性、稳定性以及抗逆性都比NOB单一菌株更高的原因之一，说明硝化菌群在应对抗生素污染的环境问题具有更大的潜力。

图 7  抗生素胁迫对NOB及硝化菌群活性的影响

Figure 7.  Effects of antibiotic stress on the activity of NOB and nitrifying bacteria flora

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同时，值得注意的是，在30 mg·L⁻¹ 盐酸四环素条件下，不管是NOB还是硝化菌群富集物，实验组都比对照组先消耗完底物，即30 mg·L⁻¹ 盐酸四环素在实验中在一定程度上促进亚硝酸盐氧化而非抑制作用，表明适量浓度的四环素可能对NOB的富集有帮助。宋超^[27]在NOB的活性受到四环素抑制的结论基础上进一步研究发现，在硝化污泥中加入较高浓度的四环素，NOB的数量比四环素浓度较低的组更多，硝化性能更好。其可能原因是：四环素刺激EPS的分泌，与EPS的—OH、C—O—C、C=O和C—N等官能团作用，诱导硝化污泥形成结构紧密的聚合体，对部分优势菌种起到保护作用^[28-29]；四环素被EPS吸附并通过微生物缓慢降解而减弱毒性效应^[30]；且四环素本身易变质失效。

3.   结论

1)以珠江穗石码头水样富集硝化菌群并分离纯化一株NOB菌株，NOB的亚硝酸盐氧化活性随重金属离子(Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺)、抗生素(卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素、盐酸四环素)浓度升高而受到抑制效应增强。

2)在初始NOB相等情况下，与NOB纯培养物相比，硝化菌群富集物在重金属或抗生素胁迫下的亚硝酸盐氧化速率更快，稳定性更高，对重金属和抗生素的抗逆性更强，对于处理含氮废水有更好的应用潜力。