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随着社会经济的发展，柴油的使用量增加，但是柴油在生产、运输、装卸、加工及使用过程中的泄露会对土壤环境造成一定的污染，直接或间接地危害人类的生命与健康[1-2]。因此，解决柴油污染土壤问题已成为世界各国所共同面临的问题[3]。
目前，针对柴油污染土壤修复的方法主要包括机械、物理、化学和生物修复方法等[4]。其中，机械、物理、化学修复方法具有费用高、容易产生二次污染等不足[5-7]。而生物修复技术是一种高效、环境友好、低成本的技术，能够将柴油等污染物通过微生物代谢转化成无毒的终产物[8-9]，因而被广泛应用于修复柴油污染土壤之中[10]。刘沙沙等[11]已成功利用醋酸钙不动杆菌降解柴油以及污染物，经过62 d的生物修复实验，柴油去除率为69.8%。然而，柴油组成的复杂性决定了其降解需要有不同菌株的参与[12]，TAO等[13]研究了土著细菌联合体与外源芽孢杆菌(Bacillus subtilis)共同培养降解原油的实验，细菌群落分析结果表明，在确定的共培养条件下，细菌多样性降低，降解效率提高，同时证明芽孢杆菌对长链烷烃有很好的降解效果。
大量的研究证明，微生物在修复有机物污染土壤的过程中具有良好的应用前景，但目前对于构建微生物菌群的研究较少，本研究从柴油污染土壤中筛选、分离出能够降解柴油污染物的微生物，采用组合实验构建优势菌群，探究了其柴油生物降解特性，研究分析了该菌群中各菌种之间的互作机制，为构建降解柴油的菌群提供参考。
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紫外分光光度计(UV-2102C，中国上海)，GC-MS(Agilent6890/5975I，安捷伦)，台式高速冷冻离心机(H-2050R，中国长沙)，恒温振荡培养箱(HZQ-X160，中国太仓)。实验所用试剂均为分析纯。
柴油污染土壤取自上海金山卫金山大道城河路；柴油为市售0#柴油(密度：0.84 kg·L−1)；菌种：实验所用菌种均为从柴油污染土壤样品中筛选分离得到。
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1)微生物菌种生物量的测定方法。将菌落接种于灭菌的种子培养基中，每2 h取样，采用分光光度计在波长600 nm下测定吸光度值，绘制柴油降解细菌的生长曲线。
2)微生物菌种对柴油降解能力的测定方法。残余柴油浓度采用分光光度法[14]进行测定。菌株对柴油的降解能力采用柴油降解率表示。降解率计算公式如式(1)所示。
式中：R为柴油降解率；C0为柴油的初始浓度，mg·mL−1；Ct为柴油的降解过程测定浓度，mg·mL−1。
3)微生物高效降解柴油的条件优化实验。以构建好的柴油污染物降解菌群为研究对象，考察了初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、初始柴油浓度(1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL·L−1)、初始接种量(体积比5.0%、10.0%、15.0%)对柴油降解率和细菌生物量的影响结果。在30 ℃，150 r·min−1条件下培养5 d，定时取样并测定其中的柴油降解率以及生物量的变化，每组实验重复3次，取其平均值。
4)微生物多样性测试。将培养24 h的菌群混合液按10%的接种量接种到无机盐培养基中，柴油浓度为7.0 mL·L−1，pH=7.0，在30 ℃，150 r·min−1条件下培养，14 d后，将混合菌进行收集，离心弃上清液，收集菌体，测试微生物多样性，该工作由上海美吉医药科技有限公司完成。
5)微生物降解柴油产物的检测。将筛选获得的高效单菌种分别接种到种子培养基中，培养24 h后，离心收集菌体，稀释使其OD600=1.50，并按照最佳的体积比混合后接种于无机盐培养基中，以不加细菌为对照组，柴油浓度为7.0 mL·L−1，在30 ℃、150 r·min−1的恒温振荡培养箱中培养14 d。然后将培养基取出加入1∶1(体积比)硫酸5.0 mL酸化水样，继续加入0.2 g·L−1的氯化钠破乳[15]，然后加入石油醚20.0 mL(60~90 ℃)超声10 min。将上述溶液8 000 r·min−1离心10 min，将上清液转移至另一干净的三角瓶中，下层溶液倒入原三角瓶并用石油醚重新提取1次。合并2次提取液，过膜，利用GC-MS测定培养基内降解产物组成及含量。
6)微生物降解十五烷产物的检测。将本研究所构建的混合菌群接种于添加了十五烷(7.0 mL·L−1)的无机盐培养基中，在30 ℃、150 r·min−1的振荡箱里培养14 d，分别取降解3、6、14 d的培养液，按照上述方法处理并检测。
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从柴油污染土壤中筛选获得4株具有较强柴油降解能力的菌株，其菌落形态和柴油降解能力结果见表1。
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微生物初步鉴定结果如表2所示。通过16S rRNA测序结果可知，1#、2#、3#、4#菌株分别与Bacillus sp. VOC18、Enterococcus faecalis、Lysinibacillus、Rhodococcus equi有97%、98%、99%、99%的相似性。本研究分别对1#、2#、3#、4#菌株命名为Bacillus sp. VOC18-L1，Enterococcus faecalis-L2，Lysinibacillus-L3，Rhodococcus equi-L4(简称L1，L2，L3和L4)。
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每种菌的生长曲线如图1所示。由图1可知，4种细菌在24 h均进入指数生长阶段，在该阶段，微生物生长速度快，活性较强，因此，后续实验均采用培养24 h的菌液为接种液。
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菌群构建的结果如表3所示。由表3可知，编号11的菌群组合在5 d内对柴油的降解率最高，可达到39.6%，这可能是由于不同菌种之间的协同作用，使得混合培养的菌群对于柴油污染物的降解效果要优于单菌，因此，选用该混合菌群作为最佳降解菌群进行后续的研究。
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1)采用正交实验法确定柴油降解菌群的最佳菌种混合比例。菌群中各菌种的相对含量对柴油等有机物的降解效率有显著的影响。因此，本研究通过正交实验研究了不同混合比例的菌种对柴油降解效率的影响关系，结果如表4所示。由表4可知，降解效果最好的菌种比例为L1∶L2∶L3∶L4=3∶1∶3∶4，在5 d时，降解柴油效率为52.5%，本研究将此比例的微生物组合命名为OCDL-3134。由于该菌群中的每种细菌都具有特定的作用，因此，柴油降解效率明显得到提高[16-17]。然而，将培养了14 d的微生物进行多样性分析结果如图2所示，由图2可以看出，OCDL-3134经过14 d的培养后，菌种之间的比例变为2∶6∶5∶1，这说明在降解过程中，4种菌根据环境的变化发挥着协同作用，并自行调整他们之间的相对丰度，以实现充分利用柴油污染物的目的。此时L2和L3菌种变为优势菌种，说明在培养后期，L2和L3菌种发挥了重要作用，这与其自身的功能是相一致的。同时也表明确定各种微生物的初始接种比例的菌群构建方案具有一定的合理性。有研究[18]表明，一旦长链烷烃耗尽，就会缺乏碳源和能量用于其生长，而由长链烷烃降解形成的短链烃类化合物则被其他菌种继续代谢利用而进一步降解。
2)初始pH对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。环境pH可引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，改变营养物质的可给性和有害物质的毒性。本研究探讨了初始pH对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。由图3(a)可知，当环境pH过高或过低时，会对微生物产生抑制，这可能是由于此条件严重影响了细菌利用柴油的能量和物质代谢进程，从而影响菌体生长，因此会显著降低柴油的生物降解效率。当pH为7.0时，OCDL-3134对柴油降解的效率达到最佳，此时生物量也达到最高，如图3(b)所示。因此，OCDL-3134对柴油的降解效率和生物量的最佳初始pH均为7.0。
3)柴油浓度对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。柴油浓度是微生物代谢过程的一个重要因素，对微生物降解性能有一定影响[19]。柴油浓度较低时，碳源不足，细菌生长缓慢，对柴油降解效果不佳。随着柴油浓度的增加，碳源可以满足微生物生长，微生物的降解效果也随之增大。但随着柴油浓度继续增加，柴油降解菌的活性受到抑制，同时培养基表面形成一层油膜，使得溶液内的溶解氧浓度降低，抑制微生物的生长繁殖，从而影响对柴油的降解。如图4(a)所示，随着柴油浓度的增大，微生物的柴油降解率呈先上升后下降的趋势，在柴油浓度为7.0 mL·L−1时，降解效果最好，达到50.0%以上。同时，图4(b)为初始柴油浓度对生物量的影响结果，随着柴油初始浓度的增加，生物量呈先增后降的趋势，结果表明OCDL-3134在初始柴油浓度为7.0 mL·L−1时生物量最佳。
4)接种量对OCDL-3134菌体生长和柴油降解效率的影响。如图5所示，接种量在体积比为10.0%时，微生物对柴油的降解率较高。此后，再增加接种量反而导致新增细胞减少，进而使菌株整体活性下降，降解柴油的后劲不足。15.0%的接种量虽然生物量最多，但由于微生物大量繁殖，造成菌株集中，短时间内消耗了培养基中大量营养成分，不利于新菌株的持续生长，从而影响了菌株对柴油的降解率，因此，根据实验结果最佳接种量为10.0%。
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1)菌群OCDL-3134降解柴油过程中的产物分析。各单菌种和OCDL-3134对柴油降解的产物结果如图6所示。图6(a)是原始柴油的组分，由此可知，原始柴油的组分非常复杂，主要包括C13~C24的烷烃。图6(b)是L1培养14 d后的产物，通过与图6(a)对比可发现，L1对短链烷烃降解效果好，推测可能是由于该菌在生长代谢过程中产生了相应的表面活性剂[13]，促进了微生物与柴油的接触，从而对短链烷烃具有较好的降解效果；图6(c)是L2培养14 d后的产物，通过与图6(a)对比可发现，整体烃类的含量降低。该菌株具有利用该有机物代谢产酸的能力[20]，可以将柴油降解的一些产物分解成小分子的酸，因此，在柴油降解过程中发挥着重要作用；图6(d)是L3培养14 d后的产物。与图6(a)对比可发现，短链以及长链烷烃的含量菌有所减少。该菌能够在好氧条件下代谢简单的碳水化合物，因此，在小分子烃类物质的降解过程具有重要作用，同时在柴油降解的后期可能会具有重要贡献，这一点与图3的结果是一致的；图6(e)是L4培养14 d后产物，与图6(a)对比可发现，整体的烃类含量降低，而环苜蓿烯的含量也有明显的下降。有研究[20]表明，该菌株的主要特性是能够有效降解芳香烃，因此，对于柴油中芳香烃的降解具有重要作用。
综上所述，L1、L2、L3、L4对柴油污染物中的有机烃类物质具有一定的降解效果，并且不同的菌种对不同链长的烃类物质降解效果也有显著差异。然而，L1、L2、L3、L4却不能将柴油完全降解。而L1、L2、L3、L4混合形成的菌群OCDL-3134对柴油降解效果显著，如图6(f)所示，相同时间内，柴油几乎被完全降解，转化成无毒无害的酸类小分子、二氧化碳和水。这表明混合菌对柴油的降解效率显著优于单菌株。
2)菌群OCDL-3134降解十五烷过程中的产物分析。使用GC-MS检测了以柴油作为碳源的微生物降解的产物，实验结果表明，混合菌群对柴油的降解效果显著优于单菌种的效果。对此已有大量研究[21]证明了微生物对柴油等有机污染物的降解作用，但是生物降解长链烷烃的机理研究报道并不多见，而且对其降解途径也缺乏了解。由于柴油属于混合物，且主要的烷烃为十五烷和十六烷，因此，本研究选择十五烷作为研究对象，初步探讨微生物降解十五烷的机理，如图7所示。由图7(a)可知，第3天样品中的主要成分是十五烷，这表明在前3 d菌种要先适应新环境，降解效率低。而到第6天，OCDL-3134中的各菌种在协同作用下将十五烷降解为C13H28、C13H26O2等化合物，如图7(b)所示。据报道[15]，微生物对直链烷烃最常见的降解途径为烷烃末端氧化，微生物攻击直链烷烃的末端甲基，由加氧酶、脱氢酶、水化酶等混合功能氧化酶催化，生成伯醇，再进一步氧化为醛和脂肪酸，脂肪酸接着通过氧化进一步代谢，被彻底氧化成二氧化碳和水。如图7(c)所示，在第15天，十五烷以及产物被OCDL-3134彻底降解为水和二氧化碳等小分子物质。
3) OCDL-3134降解柴油过程中细菌代谢功能的预测。图8是从KEGG数据库中获得的代谢丰度图，碳水化合物代谢的丰度最好，表明微生物一开始是对柴油的代谢，而氨基酸的代谢功能丰度是其次的，可能发挥的作用是对中间代谢产物脱氨基，从而进一步代谢成醛、酮、酸等小分子物质，因此，细菌首先利用柴油，并将柴油分解成中间代谢产物，然后经过代谢途径分解成酸类小分子物质。其他的代谢途径如能量代谢、辅因子和维生素的代谢、核酸代谢等也参与进来，最终一起合作完成降解柴油的任务。而且可以发现，4种菌种的异质降解和代谢丰度较好，这一代谢丰度说明微生物具有增强降解柴油的能力，这与TAO等[13]的研究结果相一致，但由于是混合菌，故不能判断是哪一种菌种产生的作用。代谢功能预测进一步证明了混合菌在柴油完全降解方面优于单种菌种。
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1)通过排列组合的方式将筛选出的微生物菌种进行组合，得出高效柴油降解菌群OCDL-3134，通过正交实验得出它们之间接种量最优比例为3∶1∶3∶4，同时对混合菌柴油降解性能进行优化，实验测得微生物降解柴油的最优条件为pH=7.0，初始柴油的浓度为7.0 mL·L−1，初始接种量为10.0%，在此优化条件下，测得第14天柴油的最佳降解率为89.0%，这说明所筛选的混合菌种具有较高的应用价值。
2)通过GC-MS检测和微生物多样性功能预测分析证明了微生物对柴油以及十五烷的协同作用高于单菌株的降解效果，4种菌种之间存在协同作用，能够将长链烷烃降解为短链烷烃和小分子物质，并获得自身生长与代谢的能源和碳源。KEGG数据库中获得的代谢丰度图也进一步证明了混合菌在柴油完全降解方面优单种菌种。
柴油降解菌的筛选、菌群构建及其对柴油和十五烷的降解机理
Screening and community construction of diesel oil degrading bacteria and their degradation mechanism of diesel oil and pentadecane
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摘要: 针对柴油污染土壤生物修复技术效率低的问题，通过构建高效降解菌群修复柴油污染的土壤，采用组合优化和正交实验构建最佳组合与接种比例的菌群，并研究其柴油降解特性。结果表明，通过筛选、鉴定并命名的4株柴油降解菌为Bacillus sp. VOC18-L1、Enterococcus faecalis-L2、Lysinibacillus-L3、Rhodococcus equi-L4；当4株菌接种比例为3∶1∶3∶4，pH = 7.0，30 ℃，转速150 r·min−1时，柴油降解的效果最佳，14 d对7.0 mL·L−1的柴油降解率达到89.0%。通过气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测柴油降解产物，发现该混合菌株能将柴油中的烷烃降解为短链烷烃，最终转化为小分子物质。同时利用KEGG数据库获得代谢丰度图并初步预测每种菌的功能，根据微生物多样性测试结果，进一步证明了混合菌对柴油完全降解的效果优于单种菌种。通过人工构建的微生物菌群可以有效地应用于柴油污染土壤的修复。Abstract: In view of the current low efficiency of bioremediation technology for diesel oil-contaminated soil, a highly efficient flora was constructed to remediate the polluted soil. A combinatorial optimization and orthogonal design were used to construct the flora with the optimal combination and inoculation ratios, and their degradation characteristics of the diesel oil were also studied. The results showed that four diesel degrading bacteria were screened, identified and named as Bacillus sp. VOC18-L1、Enterococcus faecalis-L2、Lysinibacillus-L3、Rhodococcus equi-L4. The optimal degradation efficiency was obtained at their inoculation ratios of 3∶1∶3∶4, pH=7.0, 30 ℃ and the rotational speed of 150 r·min−1. After 14 days of incubation, the degradation efficiency of 7.0 mL·L−1 diesel oil reached 89.0%. The degradation products of diesel oil were detected using GC-MS, which indicated that these mixed strains could first degrade the long-chain alkanes in diesel oil into short-chain alkanes and finally converted them into some small molecular organics. The metabolic abundance maps obtained from KEGG database were used to predict the functions of each strain. According to the results of microbial diversity test, it was further proven that the mixed flora was superior to pure strain in the complete degradation of diesel oil. The artificially optimized and constructed microbial flora could effectively degrade diesel oil in contaminated soil.
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1,4-丁炔二醇(1,4-butynediol, BYD)是一种重要的化工原料，主要用于合成1,4-丁二醇(1,4-butanediol, BDO)，进而生产四氢呋喃、聚四亚甲基乙二醇醚(PTMEG)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)和聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等重要化工产品[1-3]。目前，我国已经是世界上最大的BDO生产国[4]，BDO生产首先利用乙炔和甲醛经铜铋催化合成BYD，BYD再经过精馏提浓，提浓后BYD需要通过阴阳离子树脂脱除含有的铜离子、二氧化硅和醋酸根离子等杂质，进而再催化加氢生成BDO[5]。其中，阴阳离子树脂再生产生的脱离子废液含有高浓度BYD残留[6]，废水化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)可达到6 000~20 000 mg·L−1，是BDO生产过程产生的主要高浓度有机废水，由于部分企业使用5%的硫酸进行阳离子树脂再生，从而导致该废水中硫酸盐含量也较高(6 000~10 000 mg·L−1)。BYD脱离子废液与生活污水、冲洗废水和BDO精馏废水等低浓浓度有机废水混合后即为BDO生产废水，BYD脱离子废液水量占BDO生产废水的比例为50%~70%。 BYD脱离子废液的高效低耗处理是BDO生产废水处理的关键。
厌氧生物处理技术因为具有能耗低、可回收甲烷气和污泥产量少等优势，广泛应用于高浓度有机废水的预处理[7]。其利用水解产酸菌、互养产氢产乙酸菌和产甲烷菌的协作实现有机物的厌氧甲烷转化[8]。当废水中含有硫酸根离子时，硫酸盐还原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)也会参与厌氧代谢过程，在低浓度硫酸盐含量条件下，SRB可以促进难降解有机物的降解和乙酸产生，进而促进甲烷代谢[9]；当硫酸盐含量过高时，硫酸盐还原产生的过多硫化氢可以抑制产甲烷古菌和SRB，进而抑制厌氧有机物代谢[10]。考虑到BYD是BDO生产脱离子废液的主要COD贡献者，阐明其在不同厌氧处理条件下的生物降解效果，对于脱离子废液及其他高含BYD废水的处理工艺设计具有重要指导意义。
目前关于BYD可生化性的研究较少，GOTVAJN[11]和TISLER等[12]利用快速生物降解实验方法评估了BYD的好氧可生化性，发现在60 d的培养周期内BYD浓度基本没有降低，认为BYD是一种不易生物降解有机物。陈庆磊等[13]利用批次实验评估了BDO生产废水的厌氧处理效果，发现COD去除率约为56%，没有研究BYD的去除率。且BYD分子中含有内炔烃超共轭结构，化学性质十分稳定[11]，明确BYD厌氧可生化性对于指导工程实践具有积极意义。
因此，本研究联合使用批次和连续实验方法评估了BYD在厌氧生化处理过程中的生物降解效果，同时测定了COD、BYD、硫酸盐浓度变化及微生物群落的演替情况，研究结果可为含BYD工业废水的处理提供指导。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用BYD购自上海麦克林生化科技股份有限公司(纯度98%)，为白色斜方结晶，用纯水配成50 000 mg·L−1储备液，4 ℃保存。厌氧生化实验的外加微量元素营养液组成为[14]：MgCl2 (30 mg·L−1)、NiCl2 (10 mg·L−1)、CoCl2 (10 mg·L−1)、FeCl2 (40 mg·L−1)、CaCl2 (20 mg·L−1)、ZnSO4 (20 mg·L−1)、MnSO4 (20 mg·L−1)。CaCl2等常规化学试剂均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
本实验所用厌氧颗粒污泥为安徽宿州某酒精厂污水处理站的厌氧颗粒污泥，外形为规则球形，颗粒直径为0.5~4.0 mm；活性污泥采自河北石家庄市某市政污水处理厂缺氧池污泥，絮状，沉降性能优良。
1.2 厌氧批次实验设计
厌氧批次实验在AMPTS® II自动甲烷潜力测试系统(BPC Instruments AB)中进行。为探究BYD是否可在纯厌氧产甲烷体系降解、复配活性污泥和SO42−还原是否可促进BYD厌氧降解，厌氧批次实验一共设置了3组实验，每组2个平行，同时设置没有厌氧污泥接种的空白组。实验组污泥浓度均控制在15 000 mg·L−1，pH=7.1，具体物料组成见表1，硫酸盐组控制BYD/SO42− =0.299 (对应COD/SO42− 的质量比为0.5)。各组实验均加入1 mL微量元素溶液，反应总体积均为400 mL，利用恒温水浴控制反应温度稳定在37 ℃。
表 1 厌氧批次实验设计Table 1. Design of anaerobic batch experimentsmg·L−1 实验组别 接种污泥 BYD 碱度(以CaCO3计) NH4Cl KH2PO4 K2HPO4 SO42− 颗粒污泥组 厌氧颗粒污泥 500 1 000 140 30 30 — 污泥复配组 厌氧颗粒污泥与活性污泥复配a 500 1 000 140 30 30 — 外加硫酸盐组 厌氧颗粒污泥与活性污泥复配a 500 1 000 140 30 30 1 670 注：厌氧颗粒污泥与活性污泥浓度比为2:1。 | Show Table
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1.3 UASB连续实验设计
厌氧连续实验在2套平行中温有效容积为6.3 L的UASB反应器进行，种泥为30%活性污泥与70%厌氧颗粒污泥复配污泥。进水水质模拟内蒙古某BDO生产企业的实际BYD脱离子废液水质配置(表2)，进水COD由葡萄糖和BYD组成，氮源为氨氮，磷源为磷酸二氢钠，碱度由碳酸氢钠贡献，微量元素(Fe、Mn、Zn、Co)添加参考KONG等[10]，进水pH调至7.2±0.2，进水基质桶水温由低温水浴控制在4 ℃。反应器各阶段具体运行参数见表2。
表 2 厌氧UASB反应器不同阶段的运行参数Table 2. Operating parameters of anaerobic UASB reactors at different stages阶段 HRT(d) 有机负荷(以COD计) COD/SO42−(质量比) BYD(mg·L−1) 葡萄糖(mg·L−1) TCOD(mg·L−1) SO42−(mg·L−1) S1 10 0.5 — — 4 686 5 000 — S2 10 1 — 2 980 4 686 10 000 — S3 10 1 10 2 980 4 686 10 000 1 000 S4 10 1 5 2 980 4 686 10 000 2 000 S5 10 1 1 2 980 4 686 10 000 10 000 S6 — — — — — — — | Show TableDownLoad:
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1.4 检测指标与方法
厌氧发酵气体首先通过二氧化碳吸收瓶(含有3 M的氢氧化钠)，之后利用湿式气体流量计记录每日产气量。污水样品经0.22 μm滤膜过滤后，滤液用于各指标测试，其中COD和SO42−测定参照水质测定标准[15]。针对硫酸盐还原体系，滤液首先经过曝气去除溶液中的硫化物，通过硫化物测定试纸(陆恒生物)不变蓝判断硫化物被完全去除，之后再过滤测定COD。采用GC-FID (岛津GC2010 plus)测定BYD浓度，选用SH-Stabilwax-DA柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 作为气相色谱柱，温度程序如下：100 ℃保留1 min，以20 ℃·min−1升温至120 ℃，保留4 min，之后以20 ℃·min−1升温至220 ℃，保留5 min。进样口和检测器温度分别为240 ℃和260 ℃。氦气作载气，初始压力为400 kPa。采用外标法测定BYD含量，每次测试新配置标准曲线。采用内标法测定挥发性脂肪酸(VFAs)含量，取1mL滤液加入1-丁醇内标(2 000 mg·L−1)后，使用GC-FID (岛津GC2010 plus)测定VFAs浓度，选用Restek Stabilwax-DA柱(30 m×0.53 mm×0.1 μm) 作为气相色谱柱，温度程序如下：70 ℃保留1 min，以20 ℃·min−1升至150 ℃，之后以4 ℃·min−1升至 160 ℃，再以20 ℃·min−1升至210 ℃，保留2 min。进样口和检测器温度分别为240 ℃和260 ℃。氦气作载气，初始压力为167.3 kPa。
1.5 微生物样品采集与扩增子测序
针对UASB反应器，在每个运行阶段结束时分别从2个平行反应器中收集厌氧污泥样品，使用FastDNATM SPIN Kit (MP Biomedicals, Solon, USA)试剂盒提取DNA，使用NanoDrop分光光度计(ND-2000, NanoDrop Technologies, USA)测定DNA浓度和纯度。提取后DNA使用515F (GTGCCAGCMGCCGCGG)和907R (CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)引物扩增细菌16S rRNA基因[16]，PCR扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行NovaSeq PE250测序。测序数据存储于NCBI SRA (链接号：PRJNA1108964)。测序数据质控、OUT (operational taxonomic units)聚类、细菌菌属注释和主坐标分析(PCoA)通过美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com/)完成。
2. 结果与讨论
2.1 不同厌氧生化条件下BYD的降解性能
如图1(a)所示，空白组中BYD不会因为水解、挥发等原因而浓度下降。在单一厌氧颗粒污泥接种的实验组，BYD降解缓慢，31 d实验结束时去除率仅为40.72%，对应的降解速率为6.6 mg·(L·d)−1 (图1(b))，且COD去除与BYD降解表现出较高的一致性(相关系数R2=0.908，P<0.05)。KONG等[17]报道活性污泥与厌氧颗粒污泥的复配可以提高N-N-二甲基甲酰胺的厌氧产甲烷效果，发现N-N-二甲基甲酰胺首先被活性污泥中兼性厌氧水解微生物转化为二甲胺和一甲胺等中间体，再被产甲烷古菌直接利用，从而促进了N-N-二甲基甲酰胺的完全厌氧降解。厌氧颗粒污泥与活性污泥复配有可能也会促进BYD的厌氧降解，因此开展了2种污泥复配的BYD降解实验，结果如图1(c)所示。复配活性污泥后，BYD的降解速率加快，达到9.9 mg·(L·d)−1，在31 d实验结束时BYD的去除率达到了65.71%，较单一厌氧颗粒污泥实验组提升了25.01%。但是需要指出，实验结束时污泥复配体系的COD去除率仅为29.43%，与单一颗粒污泥体系(33.02%)基本一致。将实验结束时残留BYD浓度转化为COD理论值为281.2 mg·L−1，小于COD实测值(658.5 mg·L−1)，表明虽然活性污泥接种带入的BYD兼性厌氧水解菌可以将BYD转化为未知有机中间产物，使得其母体物质浓度降低速度加快，但生成的中间产物仍难以被产甲烷古菌降解。除了产甲烷古菌，在硫酸盐含量较高的厌氧体系中，SRB可以利用乳酸、丙酸和醇类等多种有机物作为电子供体[18]，SO42−为电子受体，将有机物降解并将SO42−还原成硫化氢[19]。
图 1 批次实验中3种厌氧生化条件下BYD的降解情况Figure 1. Degradation of BYD in three anaerobic digestion systems考虑到BYD分子中含有羟基，有可能作为SRB的电子供体而被降解。因此，在复配污泥作为种泥的条件下进一步加入硫酸盐，探究硫酸盐还原是否可以加速BYD的厌氧降解。结果如图1 (d)所示，加入硫酸盐后，复配污泥中BYD降解速率进一步提升至11.2 mg·(L·d)−1，在31 d实验结束后去除率达到79.46%，比单一厌氧颗粒污泥和复配污泥实验组的BYD去除率分别提高了38.74%和13.75%。同时，COD的最终去除率达到52.03%，比单一厌氧颗粒污泥和复配污泥实验组分别提高了19.01%和22.60%。混合液SO42−的质量浓度变化与BYD和COD的质量浓度变化都表现出显著的正相关关系(P<0.05) (图1 (d))。实验开始后(0~6 d)，SO42−质量浓度即快速降低(图1 (d))，表明反应起始硫酸盐还原作用即占据主导，这可能与本研究中采用的低COD/SO42− (0.5)有关。HAO等[20]报道COD/SO42−低于1.5时，SRB会获得生长优势，厌氧代谢以硫酸盐还原为主。在反应结束时，SO42−去除率为57.32%，对应的单位硫酸盐去除所需的COD比例为0.5，低于与WU等之前报道的乙醇和醋酸盐合成废水单位硫酸盐去除所需的COD比例(0.6)[21]。将实验结束时混合液残留BYD的质量浓度转化为理论COD值为171.6 mg·L−1，同样小于实测COD值441 mg·L−1，说明外加硫酸盐虽然提高了BYD的降解，但是体系中仍有部分BYD的厌氧转化产物难以被SRB利用。
2.2 UASB连续反应器中BYD的厌氧降解性能
1)反应器运行效果。短期批次实验可以初步评估目标污染物的厌氧降解性能，而长期连续实验可以进一步解析厌氧微生物群落经过长期驯化后对目标污染物的生物降解效果(这与实际废水处理系统运行状况更相似)，2种方法的结合可以更全面地解析目标污染物的厌氧降解性能[7]。本研究中，批次实验结果表明BYD在厌氧产甲烷体系中降解较慢，厌氧颗粒污泥复配活性污泥和外加硫酸盐均可以加速BYD的厌氧降解。为此，进一步参考实际BDO生产脱离子废液水质(COD为6 000~20 000 mg·L−1，SO42−含量为6 000~10 000 mg·L−1)，建立了2套平行的UASB反应器评估了长期运行情况下BYD的厌氧降解效果，结果如图2所示。UASB反应器一共运行了388 d，根据进水水质变化分为S1~S6 6个阶段(表2)。
UASB反应器以葡萄糖为唯一碳源启动，运行20 d之后出水COD值低于120 mg·L−1，VFAs低于30 mg·L−1 (图2(b)和图2(d)) (S1阶段)，证明厌氧污泥活性优良。在第21天，反应器进水加入2 980 mg·L−1的BYD (S2阶段)，此后反应器出水COD值和BYD质量浓度逐渐上升，在52 d分别稳定在约5 000 mg·L−1和2 965 mg·L−1，对应的COD和BYD去除率仅约50.33%和0.50% (图2(a)~(b)),且在此过程中CH4产率未出现下降(图2 (e))，VFAs未累积(图2(d))。在第83天，反应器出水VFAs和COD值急剧上升，在105 d VFAs达到了1 780 mg·L−1，主要由乙酸组成(图2(d))，同时出水COD也上升到了9 365 mg·L−1 (图2(b))，COD去除率下降至6.37%，UASB出现了VFAs累积现象。考虑到BYD分子中含有—C≡C—和—OH等结构，易于与金属离子络合[22]，当其质量浓度过高时(如本文的2 980 mg·L−1)可络合带走过多铁、钴、镍等微量金属元素，导致可用于产甲烷古菌维持正常生命活动的微量金属元素含量降低，从而导致厌氧产甲烷微生物失活。随后在111 d将进水中微量元素质量浓度翻倍，反应器出水VFAs和COD值随即快速下降，系统产气恢复(图2 (e))。之后继续对UASB反应器进行了42 d的连续监测，系统再未出现抑制情况，但BYD去除率也没有进一步提升，表明即使经过长期驯化厌氧产甲烷微生物代谢体系中BYD降解速率仍较低。
此后，向反应器引入硫酸盐共运行了3个阶段(S3~S5)，通过提高进水硫酸盐质量浓度使各阶段COD/SO42−分别为10、5和1。在S3阶段(167~215 d)，进水COD/SO42− =10的情况下，UASB反应器CH4产率从0.89 L·d−1提升至1.07 L·d−1，表明少量硫酸盐加入提高了厌氧甲烷产率。同时，该阶段COD去除率为50.56%，SO42−去除率为97.15%，出水BYD质量浓度先下降后上升，最终稳定在2 847 mg·L−1，对应去除率为3.92% (图2 (a)、(b))。
在S4阶段(216~260 d)，将COD/SO42−降低至5，CH4产率从1.07 L·d−1迅速降低至0.41 L·d−1，而VFAs未发生累积(图2(d))，BYD去除率略提升至4.83%，COD去除率为51.02%，SO42−去除率93.81%。上述结果说明此阶段厌氧生化系统仍然能保持正常运行，但硫酸盐还原作用已经显著增强，开始与产甲烷代谢共同承担对乙酸的降解。
在S5阶段(263~369 d)，进一步将进水COD/SO42−下调到1，出水BYD质量浓度明显降低，去除率从S4阶段的4.83%提高到21.92% (图2(a))。但同时，厌氧生物系统迅速受到抑制，COD去除率从51.02%下降至20.31%，SO42−去除率从93.81%下降至24.48%，并且VFAs (主要为乙酸)快速累积至2 824 mg·L−1 (图2 (d))，这可能是由于在COD/SO42− =1的条件下，硫酸盐还原已经成为主导的厌氧有机物降解途径[23]，但是进水SO42−质量浓度过高，导致产生的硫化氢质量浓度超过了SRB和产甲烷古菌的耐受阈值，从而抑制了乙酸的进一步转化。O'FLAHERTY等[10]曾报道游离硫化氢对厌氧微生物的抑制阈值为38~185 mg·L−1，而本研究S5阶段UASB反应器内理论游离硫化氢质量浓度已经超过214.7 mg·L−1 (约占总硫化物8.82%)[19]，厌氧微生物活性可被完全抑制。在第370天采取停止进水的方式试图恢复厌氧系统活性(S6阶段)，在18 d的恢复期内，反应器内BYD、COD、SO42−和VFAs均有下降趋势，但下降趋势较慢。
2)微生物群落演替。利用高通量测序技术分析了UASB连续实验过程中厌氧污泥细菌群落的演替情况。如图3所示，BYD的投加(S2)显著改变了污泥中厌氧微生物群落结构，硫酸盐的投加(S3~S6)进一步显著改变了UASB厌氧系统微生物群落的结构，而在S3~S6阶段COD/SO42−的改变及停止进水过程中细菌群落结构相对稳定。
图 3 UASB反应器不同阶段下细菌群落结构的β多样性分析(PCoA分析，OTU水平)Figure 3. PCoA analysis of bacterial communities at OUT level in UASBs at different stages门水平下细菌群落变化如图4所示，种泥(S1阶段)细菌以绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、热孢菌门(Thermotogae)、互养菌门(Synergistota)和螺旋体门(Spirochaetota)为主，其中部分Proteobacteria和Spirochaetota细菌具有硫酸盐还原功能[24]。投加BYD后(S2阶段)，Firmicutes、Proteobacteria和Spirochaetota相对丰度分别从18.13%、9.17%和0.71%增加到32.68%、15.53%和5.67%，而Chloroflexi门丰度从21.63%减少至7.44%。进水增加硫酸盐后，在S3阶段脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、Spirochaetota和Cloacimonadota门细菌相对丰度分别由1.09%、5.67%和0.27%增加至4.53%、14.98%和11.35%，其中Cloacimonadota门细菌通常存在于厌氧发酵系统中，宏基因组组装基因组分析揭示其是一种潜在的乙酸产生菌[25]，而多种Desulfobacterota门细菌(如Syntrophobacter、Desulfoglaeba和Desulfovibrio)同时是丙酸氧化产乙酸菌和SRB，在高COD/SO42−条件下可获得更大的生存优势，成为产甲烷古菌的主要互养微生物[20, 26-28]。随着COD/SO42−降低至5(S4阶段)，厌氧系统硫酸盐还原作用被进一步加强(图2 (e))，Desulfobacterota和Proteobacteria相对丰度分别从4.53%和6.45%上升到12.64%和9.75%，而Cloacimonadota和Spirochaetota相对丰度略有降低。在S5与S6阶段，Firmicutes与Chloroflexi相对丰度分别从29.08%和7.33%减少至16.04%和2.18%，Bacteroidota和Synergistota相对丰度分别从8.30%和5.07%提升至16.88%和10.49%，而Desulfobacterota和Proteobacteria丰度基本不变(图4)。
图 4 不同运行阶段UASB污泥细菌群落组成(门水平)Figure 4. Changes in bacterial communities at phylum level in UASB at different stages考虑到硫酸盐还原作用可以增强BYD的厌氧降解，进一步在属水平上分析了实验过程中UASB内SRB的变化(图5)。本研究共检出属于5个门64个属的SRB，其中丰度较高的22个SRB在种泥中的总丰度为2.76%，优势SRB菌为互营杆菌属(Syntrophobacter) (0.76%)、史密斯氏菌属(Smithella) (0.60%)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio) (0.41%)。S2阶段引入BYD后，厌氧污泥中SRB种类未变，但总丰度明显减少(1.17%) (图5)。进入S3阶段(进水COD/SO42− =10)，Desulfovibrio、Syntrophobacter和Smithella快速生长，相对丰度分别从0.05%、0.11%和0.22%增加至1.46%、0.86%和1.42%。这3个菌属均属于Desulfobacterota[28]，其中Syntrophobacter与Smithella为互养产乙酸菌，其可利用硫酸盐作为电子受体氧化丙酸等多种有机物，生成乙酸和二氧化碳[29]，从而为产甲烷古菌提供更多的甲烷前驱物，促进甲烷代谢。而Desulfovibrio为不完全氧化型SRB[30]，在COD/SO42−≥10的条件下，同样可利用硫酸盐作为电子受体氧化乳酸、丙酸等有机物生成乙酸，从而提高了乙酸产量，促进甲烷代谢[21, 29]。
图 5 不同运行阶段UASB污泥中硫酸盐还原菌在属水平上的丰度变化Figure 5. Change in the abundances of sulfate reducing bacteria at Genus level in bacterial communities at different stages of UASBs上述3个菌属的富集可能是S3阶段观测到甲烷产率提升的原因(图2(e))。在S4阶段COD/SO42−进一步降低到5后，SRB总丰度增加至12.6%，Desulforhabdus和Desulfovibrio取代Syntrophobacter与Smithella成为优势SRB。其中，Desulforhabdus丰度由S3阶段的0.04%显著提升至4.42%，其是一种完全氧化型SRB，可利用硫酸盐作为电子受体完全氧化乙酸等有机物生成二氧化碳和硫化物[29, 31-32]，进而减少了可用于甲烷代谢的乙酸量。因此，完全氧化型SRB与产甲烷古菌对乙酸的竞争应该是S4阶段UASB反应器甲烷产率明显下降(图2(e))的主要原因。
进入S5阶段，虽然SRB总丰度有所降低，但是Desulforhabdus的相对丰度进一步增加至5.19%，说明在低COD/SO42−条件下完全氧化型SRB会获得生存优势。Desulforhabdus的进一步富集，一方面会使更多的乙酸用于硫酸盐还原，从而进一步减少甲烷产生；另一方面，在高硫酸盐存在下，完全氧化型硫酸盐还原产生的过多硫化氢会同时抑制产甲烷古菌和SRB(包括Desulforhabdus)[10]，这就导致了在S5阶段基本无甲烷产生(图2(e))，VFAs (特别是乙酸)显著累积(图2(d))，同时硫酸盐去除有限(图2(c))。需要指出，尽管S5阶段硫酸盐还原作用被显著抑制，BYD的降解仍得到显著提升(图2(a))，同时BYD的降解效率提升与Desulforhabdus丰度增加有一定相关性(图2(a)和图5)，说明完全氧化型SRB (Desulforhabdus)可能是BYD的潜在降解菌。MOTTERAN等[33]曾报道Desulforhabdus参与了直链烷基苯磺酸盐这类难降解有机物的厌氧降解，且硫酸盐浓度会影响其降解效果。除Desulforhabdus外，部分水解产酸菌(如Caldicoprobacter, Anaerofustis, Lachnoclostridium, Thiobacillus)和互养产酸菌(Thermovirga)的丰度变化与BYD的降解效果同样表现出显著正相关性(Spearman相关，P<0.05)。后续研究需结合纯菌筛选和降解实验以进一步确认BYD的厌氧降解菌。
在S6阶段，另一种不完全氧化型SRB (Desulfocurvus)[34-35]丰度显著增加(图5)。COLIN等[36]同样在含高浓度乙酸盐的河口沉积物(厌氧环境)中检测到高丰度的Desulfocurvus。这可能是因为虽然Desulfocurvus主要利用硫酸盐作为电子受体氧化乳酸或丙酮酸等有机物生成乙酸，但是在H2含量高的厌氧环境其可以利用乙酸作为碳源生长[34]，而S6阶段高浓度乙酸残留(图2 (d))和相对高H2含量(Desulfovibrio、Syntrophobacter和Smithella等SRB的代谢产氢)的环境有利于其增殖。
2.3 对含BYD废水处理工艺选择的指导意义
本研究表明对于含BYD的废水采用厌氧UASB处理时，厌氧接种污泥最好采用复配污泥；对于含有BYD同时COD和SO42−含量较高的废水(例如BDO生产过程产生的脱离子废液)，厌氧UASB工艺可考虑利用硫酸盐还原提升废水的有机质去除效果，但是需要考虑游离硫化氢抑制问题：高强度硫酸盐还原，会产生大量硫化物，同时生成大量游离硫化氢，其会进入细胞，对产甲烷古菌和SRB产生抑制[23, 37]，从而导致厌氧有机物去除效率下降(图2)。为了防止游离硫化氢的抑制，一方面可以通过稀释，降低进水硫酸盐质量浓度，比如HU等[23]研究发现在COD/SO42− =1的情况下，降低进水SO42−质量浓度至3 000 mg·L−1，可以保证80%的SO42−被还原去除；另一方面李健等[38]针对UASB反应器，设计出水循环系统和硫化物吹脱塔，即厌氧出水通过泵打入吹脱塔，吹脱塔中布置曝气装置，利用空气曝气将废水中硫化物氧化为硫单质从而降低废水中游离硫化氢含量，吹脱后液体通过泵打回到进水端，与进水混合后进入厌氧塔，从而缓解塔内游离硫化氢的抑制。利用上述措施，李健等[38]实现了高有机硫、高COD制药废水的稳定厌氧处理。最后，高质量浓度BYD本身可以络合金属离子，硫酸盐还原产生的硫化物也可以沉淀金属离子，因此通过硫酸盐还原处理高含BYD废水时，需要注意补加更多的微量元素。
3. 结论
1)单纯的厌氧产甲烷体系中BYD的降解较慢，活性污泥和厌氧颗粒污泥复配及添加SO42−均可以提升厌氧生化对BYD的降解速率。
2)高质量浓度BYD会络合过多铁、钴、镍等微量金属元素，导致产甲烷古菌被抑制，厌氧系统VFAs显著累积，通过补加微量元素的方式可以解除抑制。
3)随着进水COD/SO42−降低，硫酸盐还原逐渐替代甲烷代谢成为主要的厌氧代谢途径，同时BYD的厌氧降解率也逐渐升高；在进水COD/SO42−为1时BYD的降解率达到21.92%，完全氧化型硫酸盐还原菌Desulforhabdus成为优势菌属，但此时因为游离硫化氢大量产生，同时抑制了产甲烷古菌和硫酸盐还原菌，使得厌氧体系乙酸大量累积，即使停止进水厌氧系统在短时间内也很难恢复。
4)后续研究需要进一步考察不同质量浓度BYD对厌氧微生物群落的影响，并设计实验评估低COD/SO42−情况下，进水硫酸盐质量浓度对硫酸盐还原降解BYD的影响。此外，还需考察非生物转化途径(如吸附作用)对BYD在厌氧生化系统去除的贡献。
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图 1 柴油降解菌L1、L2、L3和L4的生长曲线
Figure 1. Growth curves of diesel oil degrading bacteria L1, L2, L3 and L4
图 2 OCDL-3134降解柴油14 d后的菌群结构示意图
Figure 2. Analysis of microbial community structure of OCDL-3134 for diesel oil degradation after 14 d
图 3 初始pH对OCDL-3134的柴油降解效率和细菌生物量影响
Figure 3. Effect of initial pH on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134 and bacteria biomass
图 4 初始柴油浓度对OCDL-3134降解柴油效率及细菌生物量的影响
Figure 4. Effect of initial diesel oil concentration on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134 and bacteria biomass
图 5 接种量对OCDL-3134降解柴油效率及细菌生物量的影响
Figure 5. Effect of inoculation on the degradation efficiency of diesel oil by OCDL-3134and bacteria biomass
图 6 L1、L2、L3、L4和OCDL-3134降解柴油的产物气相色谱图
Figure 6. Gas chromatographic charts of products from diesel oil degradation by L1, L2, L3, L4 and OCDL-3134
图 7 OCDL-3134降解十五烷在不同时间的产物气相色谱图
Figure 7. Gas chromatographic charts of degradation of pentadecane by OCDL-3134 at different time
图 8 OCDL-3134代谢柴油的功能预测
Figure 8. Metabolic function prediction of OCDL-3134 metabolizing diesel
表 1 菌株的菌落形状及柴油降解能力
Table 1. Colony shape and diesel degradability of strains
菌株号 菌落形态 菌体形态 菌落颜色 降解率/% 1# 菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙皱褶 杆状 白色 27.0 2# 菌落透明、光滑、有光泽 球形 白色 29.0 3# 菌落微黄、表面光滑、边缘整齐 杆状 微黄色 32.0 4# 菌落淡红色、湿润、不规则 杆状 淡红色 35.0
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表 2 4种柴油降解菌株的生理生化实验结果
Table 2. Physiological and biochemical characteristics of four diesel degrading bacteria
实验类型 菌株号 1# 2# 3# 4# 淀粉水解实验 − − − − 明胶实验 + − + + 尿素实验 − + − − 甲基红实验 + − + + V-P实验 + − + − 吲哚实验 − − − − 柠檬酸盐实验 − − − − 硫化氢实验 − − − + 触酶实验 − + − + 葡萄糖发酵实验 + − + + 乳糖发酵实验 − − − − 木糖发酵实验 − − − − 麦芽糖发酵实验 + − + + 蔗糖发酵实验 + − − − 注：“+”表示显阳性，“−”表示显阴性。
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表 3 菌种组合对柴油降解效率的实验结果
Table 3. Experimental results of degradation efficiency of diesel oil by species strain combination
编号 组合 降解率/% 1 L1+L2 20.9 2 L1+L3 26.2 3 L1+L4 26.1 4 L2+L3 25.8 5 L2+L4 30.9 6 L3+L4 29.3 7 L1+L2+L3 23.5 8 L1+L2+L4 31.5 9 L1+L3+L4 25.0 10 L2+L3+L4 21.1 11 L1+L2+L3+L4 39.6 12 空白 10.9
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表 4 4种柴油降解菌的接种比例和对应的柴油降解效率表
Table 4. Inoculation ratio of four diesel oil degrading bacteria and their diesel oil biodegradation efficiency
接种比例(L1∶L2∶L3∶L4) 降解率/% 接种比例(L1∶L2∶L3∶L4) 降解率/% 3∶3∶1∶2 16.5 2∶4∶3∶2 14.8 1∶1∶1∶1 39.3 4∶1∶4∶2 18.5 2∶1∶2∶3 15.3 2∶2∶1∶4 15.7 4∶4∶1∶3 21.4 4∶3∶2∶4 19.1 3∶4∶2∶1 15.6 1∶2∶2∶2 25.5 2∶3∶4∶1 13.7 3∶1∶3∶4 52.5 1∶4∶4∶4 22.3 3∶2∶4∶3 13.2 1∶3∶3∶3 13.1 4∶2∶3∶1 11.7
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[1] LI S, ZHANG S, DONG H, et al. Presence of aliphatic and polycyclic aromatic hydrocarbons in near-surface sediments of an oil spill area in Bohai Sea[J]. Marine Pollution Bulletin, 2015, 100(1): 169-175. doi: 10.1016/j.marpolbul.2015.09.009 [2] LECKLIN T, RY M R, KUIKKA S. A bayesian network for analyzing biological acute and long-term impacts of an oil spill in the Gulf of Finland[J]. Marine Pollution Bulletin, 2011, 62(12): 2822-2835. doi: 10.1016/j.marpolbul.2011.08.045 [3] 徐志霞, 张颖, 金显敏, 等. 高效石油降解菌株的筛选及菌群的构建[J]. 海南师范大学学报(自然科学版), 2015, 28(4): 421-424. [4] CHANDRAN P, DAS N. Degradation of diesel oil by immobilized Candida tropicalis and biofilm formed on gravels[J]. Biodegradation, 2011, 22(6): 1181-1189. doi: 10.1007/s10532-011-9473-1 [5] 陆秀君, 郭书海, 孙清, 等. 石油污染土壤的修复技术研究现状及展望[J]. 沈阳农业大学学报, 2003, 34(1): 64-68. [6] 张树才, 牟桂芹. 石油污染地的土壤修复技术[J]. 安全、健康和环境, 2009, 9(8): 29-31. doi: 10.3969/j.issn.1672-7932.2009.08.015 [7] 姜昌亮. 石油污染土壤的物理化学处理-生物修复工艺与技术研究[D]. 北京: 中国科学院研究生院, 2001. [8] RADWAN S S, DASHTI N, ELNEMR I M. Enhancing the growth of Vicia faba plants by microbial inoculation to improve their phytoremediation potential for oily desert areas[J]. International Journal of Phytoremediation, 2005, 7(1): 19-32. doi: 10.1080/16226510590915783 [9] ALARC N A, DAVIES J F, AUTENRIETH R L, et al. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil[J]. International Journal of Phytoremediation, 2008, 10(4): 251-263. doi: 10.1080/15226510802096002 [10] LU J. Marine oil spill detection, statistics and mapping with ERS SAR imagery in south-east Asia[J]. International Journal of Remote Sensing, 2003, 24(15): 3013-3032. doi: 10.1080/01431160110076216 [11] 刘沙沙, 陈志良, 董家华, 等. 柴油降解菌的分离鉴定及降解特性研究[J]. 土壤通报, 2013, 44(6): 1440-1444. [12] 何丽媛, 党志, 唐霞, 等. 混合菌对原油的降解及其降解性能的研究[J]. 环境科学学报, 2010, 30(6): 1220-1227. [13] TAO K, LIU X, CHEN X, et al. Biodegradation of crude oil by a defined co-culture of indigenous bacterial consortium and exogenous Bacillus subtilis[J]. Bioresource Technology, 2017, 224: 327-332. doi: 10.1016/j.biortech.2016.10.073 [14] 刘海华. 紫外分光光度法测量土壤中柴油的含量[J]. 黑龙江科技信息, 2008(18): 44-44. doi: 10.3969/j.issn.1673-1328.2008.18.044 [15] 杨丽芹, 蒋继辉. 微生物对石油烃类的降解机理[J]. 油气田环境保护, 2011, 21(2): 24-26. doi: 10.3969/j.issn.1005-3158.2011.02.009 [16] YUKI K, YOH T, TOSHIHIRO H, et al. Physiological and molecular characterization of a microbial community established in unsaturated, petroleum-contaminated soil[J]. Environmental Microbiology, 2010, 7(6): 806-818. [17] YUSTE L, CORBELLA M A E, TURI GANO M A J, et al. Characterization of bacterial strains able to grow on high molecular mass residues from crude oil processing[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2000, 32(1): 69-75. doi: 10.1111/fem.2000.32.issue-1 [18] A H, D G, E R. Sequential growth of bacteria on crude oil[J]. Applied Microbiology, 1975, 30(1): 10-19. [19] 申圆圆. 土壤中石油污染物行为特征及植物根际修复研究[D]. 西安: 长安大学, 2012. [20] BOONTAWAN A. Isolation and characterization of Jatropha oil-degradation by Enterococcus faecalis and Burkholderia cenocepacia W-1 under anaerobic condition[J]. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(63): 13841-13851. doi: 10.5897/AJB [21] PRINCE R C, MCFARLIN K M, BUTLER J D, et al. The primary biodegradation of dispersed crude oil in the sea[J]. Chemosphere, 2013, 90(2): 521-526. doi: 10.1016/j.chemosphere.2012.08.020 -
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