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悬浮填料生物膜反应器细菌群落季相更替对处理效果的稳定作用

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郝志鹏, 张会宁, 彭维, 葛向阳, 梁运祥, 靳慧霞, 陈正军. 悬浮填料生物膜反应器细菌群落季相更替对处理效果的稳定作用[J]. 环境工程学报, 2019, 13(11): 2601-2609. doi: 10.12030/j.cjee.201812193
引用本文: 郝志鹏, 张会宁, 彭维, 葛向阳, 梁运祥, 靳慧霞, 陈正军. 悬浮填料生物膜反应器细菌群落季相更替对处理效果的稳定作用[J]. 环境工程学报, 2019, 13(11): 2601-2609. doi: 10.12030/j.cjee.201812193
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HAO Zhipeng, ZHANG Huining, PENG Wei, GE Xiangyang, LIANG Yunxiang, JIN Huixia, CHEN Zhengjun. Stabilizing effect of seasonal alternation of bacterial communities on the effluent qualities in moving bed biofilm reactor[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(11): 2601-2609. doi: 10.12030/j.cjee.201812193
Citation: HAO Zhipeng, ZHANG Huining, PENG Wei, GE Xiangyang, LIANG Yunxiang, JIN Huixia, CHEN Zhengjun. Stabilizing effect of seasonal alternation of bacterial communities on the effluent qualities in moving bed biofilm reactor[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(11): 2601-2609. doi: 10.12030/j.cjee.201812193
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悬浮填料生物膜反应器细菌群落季相更替对处理效果的稳定作用

  • 1.

    华中农业大学生命科学技术学院，农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070

  • 2.

    浙江大学宁波理工学院，宁波 315000

    • 作者简介: 郝志鹏(1992—)，男，硕士研究生。研究方向：低浓度污水处理技术。E-mail：229266017@qq.com
    通讯作者: 陈正军(1976—)，男，博士，副教授。研究方向：微生物修复技术。E-mail：chenzhengjun@163.com
  • 基金项目:
    浙江省自然科学基金资助项目(2017C510006)

  • 中图分类号: X703

Stabilizing effect of seasonal alternation of bacterial communities on the effluent qualities in moving bed biofilm reactor

  • 1.

    State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

  • 2.

    Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315000, China

    • Corresponding author: CHEN Zhengjun, chenzhengjun@163.com

摘要

  • 摘要: 针对生物实验室污水处理难度高及其秋冬季节达标率低的问题，采用改进工艺的悬浮填料生物膜反应器(moving bed biofilm reactor, MBBR)进行连续处理，观察秋冬季节MBBR水质处理效果，利用高通量测序技术研究环境因子水温(Tw)、溶解氧(DO)、pH对生物膜细菌群落更替的影响以及主要微生物种群变化。结果表明，Tw由26 ℃下降到10 ℃期间，反应器COD、NH+4-N去除率仍然分别保持在75%、80%左右，MBBR出水稳定在一级A标准。变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和浮霉菌门(Planctomycetes)是生物膜主要优势菌门，Tw的下降引起拟杆菌门的相对丰度显著升高。假单胞菌属(Pseudomonas)和黄杆菌属(Flavobacterium)在低Tw下成为优势菌属，动胶菌属(Zoogloea)相对丰度保持稳定。通过冗余分析(RDA)发现，DO与短波单胞菌属(Brevundimonas)、pH与脱氯单胞菌(Dechloromonas)、固氮弧菌属(Azoarcus)具有显著正相关性，Tw与假单胞菌属、黄杆菌属具有显著负相关性。MBBR结果揭示，细菌群落动态更替是MBBR出水水质仍然保持稳定的重要原因。
    Abstract: Biological laboratory wastewater is complicate and the effluent quality of its common treatment process is fluctuant during autumn and winter. An innovated moving bed biofilm reactor (MBBR) was used to continuously treat this wastewater, and its treatment effects were detected in autumn and winter. High-throughput sequencing technology was used to explore the effects of environmental factors, such as water temperature (Tw), dissolved oxygen (DO), and pH, on alternation of bacterial communities, as well as the change of dominant genus. Results showed that when the system temperature drops from 26 ℃ to 10 ℃, the removal rates of COD and NH+4-N were above 75% and 80%, respectively, and the effluent quality of MBBR met the first-level A standard. Proteobacteria, Bacteroidetes and Planctomycetes were the main dominant bacteria of biofilm, the relative abundance of Bacteroidetes increased significantly with the decline of temperature. Similarly, Pseudomonas and Flavobacterium finally became the dominant genus at low temperature, while the proportion of Zoogloea remained stable accordingly. Furthermore, Redundancy analysis (RDA) showed that DO was significantly positively correlated with Brevundimonas, pH was significantly positively correlated with Dechloromonas or Azoarcus, while Tw was negatively correlated with Pseudomonas or Flavobacterium. These results revealed that the dynamic alternation of bacterial community might be the key reasons for keeping stable effluent of MBBR.

  • 已有研究[1-2]表明，生活污水中包含一定量的潜在致病微生物(大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)。因此，在污水处理系统末端需增加消毒，处理达标之后方可排放。近2年，随着新冠疫情的全球肆虐，不同层面的生物安全问题受到了广泛关注。我国于2021年4月15日起全面实施《生物安全法》，标志着我国生物安全问题进入了依法治理的新阶段[3]。目前，我国现行城市污水生物处理过程中已全部覆盖消毒工艺。但是，对于卫生设施相对薄弱的农村地区，污水中潜在致病微生物的分布、相应污水处理设施的消毒效果等仍存在认识不清、运维不稳等问题，从而对农村地区居民身体健康及区域生态安全造成了极大的潜在风险。

    截至2020年，全国共有约5.1亿农村人口，占全国总人口的36%，生活污水排放量很大，而目前针对已有农村污水处理设施的监测重点仍然为COD、NH3-N、TP等基础水质排放控制指标[4-5]。农村生活污水主要来源于厨房污水、生活洗涤污水和冲厕水等，其具有分散性强、水质水量变化大等特点；同时，我国农村区域相对城市而言，经济水平比较低。因此，成本低廉、高度集成、占地面积较小、施工工程量小、运行维护简便的小型化、装备化污水处理设施在农村地区得到广泛应用，净化槽即是其中一种[6-10]。基于其在单户或联用处理中的优势，目前净化槽已经在上海、江苏、云南、山东、黑龙江等地多数农村投入实际使用[11]。调研发现，目前市场上销售的净化槽在工艺单元是配有消毒设施的。但在实际运用中，由于消毒工艺投入成本高，投入的化学消毒试剂如次氯酸钠等在维护不当时可能会造成泄露而引起二次污染，因此，大部分农村地区一体化污水处理设备的消毒设施处于闲置状态，农村污水处理后，未经消毒就直接排放[10]。基于以上研究现状，本研究选取江苏省常熟市虞山街道(N 120°40′48″，E 31°40′48″)处理量为1 m3·d−1的一体化污水处理设施，解析不同工段潜在致病微生物的分布特征，为后续村镇小型污水处理设施运行过程中的健康风险评估研究提供参考。

    1.   材料与方法

    1.1   设备简介

    本研究选择江苏省常熟市虞山街道(N 120°4′48″，E 31°40′48″)处理量为1 m3·d−1的一体化污水净化槽(HJA-10，江苏中车环保设备有限公司；长×宽×高=2 190 mm×1 120 mm×1 550 mm)进行研究。净化槽采用A/O处理工艺，主要由夹杂物去除槽-厌氧滤床槽-载体流动槽-沉淀槽-消毒槽处理单元组成(图1)。其中厌氧滤床槽采用PE滤料，载体流动槽即为加有曝气设施和圆球状填料的生物处理单元，消毒槽设定为添加三氯异氰尿酸消毒剂消毒。该村现有农户370多户，共计1 500余人，其中青年人(非假期外出务工、上学等)和老年人(长期在当地居住)的占比分别为60%和40%。净化槽主要收集处理村民家中排放的生活污水(厨房洗涤废水、洗漱用水、马桶废水等)，实际运行时，槽中污水依次经过夹杂物去除槽、厌氧滤床槽、载体流动槽和沉淀槽，载体流动槽出水处设有回流管，向夹杂物去除槽回流。

    图 1  一体化污水净化槽装置示意图
    Figure 1.  Schematic diagram of the integrated Johkasou
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    1.2   样品采集

    样品按照《水质采样技术指导》( HJ 494-2009 ) 和《水质采样样品的保存和管理技术规定》( HJ 493-2009 ) 要求[12-13]，分别从净化槽进水口(A1)、夹杂物去除槽(A2)、厌氧滤床槽(A3)、载体流动槽(A4)、沉淀槽(A5)、出水口处(A6)、出水受纳水体(A7)，各采集1 L水样。采样容器材质为聚乙烯，容器采样前均进行灭菌处理，以满足采样需要。水样分别采集于夹杂物去除槽液面下0.8 m，厌氧滤床槽、载体流动槽、沉淀槽液面下0.3 m。各处理单元所采样品分成2份：1份于4 ℃保存，用于理化指标测定；另1份存于−20 ℃，用于微生物多样性分析。

    1.3   理化指标测定

    采用重铬酸钾法(HJ 828-2017)测定COD值[14]；采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)测定NH3-N浓度[15]；采用哈希法测定TN浓度；采用重量法(GB 11901-1989)测定SS浓度[16]。

    1.4   16S rDNA高通量测序

    利用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对 16S rRNA基因V3~V4 可变区进行 PCR 扩增[17-18]，产物纯化定量后通过Illumina Miseq平台进行测序。使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行聚类并剔除嵌合体，然后利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对数据库，设置比对阈值为70%，最终生成操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU) [19-21]。利用mothur进行微生物群落的α多样性分析，计算参数分别为Ace、Chao1、Shannon和Simpson指数。Ace和Chao1指数反映微生物种群丰度，其值越高表明微生物丰度越高；Shannon和Simpson指数反映微生物种群多样性，高Shannon指数和低Simpson指数代表高多样性，其数值受样品群落中丰度和物种均匀度的影响[22]。多样性指数根据式(1)~式(3)计算[23]。

    SChao1=Sobs+n1(n1−1)2(n2+1) (1)

    式中：SChao1表示估计的OTU数；Sobs表示实际测得OTU数；n1表示只含1条序列的OTU数；n2表示只含2条序列的OTU数。

    DSimpson=Sobs∑i=1ni(ni−1)N(N−1) (2)

    式中：Sobs表示实际测得OTU数；ni表示第i个OTU所含序列数；N表示所有序列数。

    HShannon=−Sobs∑i=1niNlnniN (3)

    式中：Sobs表示实际测得OTU数；ni表示第i个OTU所含序列数；N表示所有序列数。

    2.   结果与讨论

    2.1   一体化污水净化槽运行效果

    对首次投入使用的一体化污水净化槽进行长期连续进出水水质监测，时间为200 d。结果如图2所示。运行期内，设备进水中COD值为27~537 mg·L−1，NH3-N和TN的质量浓度分别为13~174 mg·L−1和15~238 mg·L−1。50 d内，设备运行处于启动状态，COD去除效果较好， NH3-N和TN去除波动较大。随着设备的运行，在50 d后，其出水COD值稳定在(35.5±22.5) mg·L−1，NH3-N和TN的质量浓度稳定在(5±3) mg·L−1和(22±10) mg·L−1，表明该设备出水水质达到了《农村生活污水处理设施水污染物排放标准》(DB 32/ 3462-2020)[24]。

    图 2  净化槽污水进、出水水质变化
    Figure 2.  Changes of water quality of the influent and effluent in the the Johkasou
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    在装置运行约100 d后，考察不同工段污水中NH3-N、SS质量浓度和COD值的沿程变化，结果如图3所示。沿设备运行工段流程，NH3-N、SS质量浓度和COD值均呈逐步下降趋势，NH3-N在A2、A3、A4、A5、A6单元的去除率分别为55.42%、67.47%、70.48%、92.77%、93.98%；SS在A2、A3、A4、A5、A6单元的去除率分别为54.35%、82.61%、86.30%、96.09%、96.52%；COD在A2、A3、A4、A5、A6单元的去除率分别为13.50%、32.43%、54.46%、89.19%、94.59%。以上结果表明，该设备处于长期稳定运行状态，并且不同处理单元对污染物的去除率有所不同。

    图 3  污水处理过程主要污染物去除效率变化
    Figure 3.  Changes in removal efficiency of key pollutants in wastewater treatment process
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    2.2   一体化污水净化槽各处理单元中微生物群落多样性

    采用高通量测序分别对不同处理单元中样本进行了细菌多样性分析，其中Ace和Chao1指数用来表征不同处理单元微生物种群丰度，Shannon和Simpson指数用来表征微生物种群多样性，具体结果如表1所示。由表1可以看出，A3单元Chao1和Ace值最高，分别为2 404.32和2 396.72；Shannon指数最高、Simpson指数最低，分别为5.49和0.01。在该设备中，A3单元中细菌不仅丰度最高，而且多样性也是最高的。这可能与本设备中污水的流程有密切的关系，污水经夹杂物去除槽后，首先进入厌氧滤床槽。因此，该单元有机物更为丰富，异养微生物快速繁殖，从而导致该单元细菌种类及丰度均相对较高。这一结果与前人研究结果存在一定的差异。黄潇等[22]发现，当采用多级A/O工艺处理城市污水时，最高的Shannon和Simpson指数出现在第2好氧区，这可能与工艺流程和污水来源的差异有关。

    表 1  不同处理单元微生物群落丰度和多样性
    Table 1.  Microbial community abundance and diversity in different treatment units
    处理单元AceChao1覆盖率/%ShannonSimpson
    A11 252.211 025.0199.302.250.26
    A21 986.921 965.4898.934.130.15
    A32 396.722 404.3298.755.490.01
    A42 260.192 221.7598.955.010.02
    A51 910.351 841.8299.164.920.02
    A62 029.491 981.2798.685.060.03
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    2.3   一体化污水净化槽各处理单元中的种群结构

    进一步分析受纳水体和设备运行稳定状态下不同单元中细菌种群结构特征，其差异如图4所示。在门水平上，进水中Proteobacteria和Firmicutes是优势菌门，其相对丰度分别为56.21%和37.65%。随着污水流经各处理单元，这2个菌门虽然仍然处于优势地位，但其相对丰度却逐步下降。由图4可见，由A2到A5，Proteobacteria相对丰度分别为48.00%、45.33%、44.58%和41.47%。Proteobacteria在各单元中检测片段数基本不变，在A2~A5单元相对丰度降低是由于各单元其他菌门种类和丰度的增加。由A2到A5，Firmicutes相对丰度分别为15.04%、6.14%、5.21%和5.27%。A2单元Firmicutes相对丰度下降主要是由其门下Chryseomicrobium属相对丰度急降所导致；在A3~A5单元，Firmicutes所测片段数基本不变，其相对丰度变小是由各单元其他菌门种类和丰度的增加所导致。在出水中，检测到的细菌总片段变少，导致Proteobacteria相对丰度增高，此时Firmicutes门下梭菌纲丰度上升是导致Firmicutes相对丰度上升的主要原因，梭菌纲适合在氧气浓度相对较低的出水中繁殖。同时，图4中的结果也表明，进水中Bacteroidota相对丰度较低，为1.08%，但在各单元中Bacteroidota相对丰度呈现逐步升高趋势，尤其是在A4和A5单元，其相对丰度分别可达31.43%和37.42%，这与已有研究结果基本一致 [25-26]。Bacteroidota相对丰度变化主要由其门下Flavobacterium属相对丰度变化引起，Flavobacterium是一种好氧反硝化细菌，适合在含氮物质和氧气含量充足的环境中生存。 本研究中，净化槽消毒单元处于关闭状态，因此，出水中检出的细菌多样性也较高，Proteobacteria仍是优势菌门，其相对丰度为53.41%，Firmicutes、Bacteroidota、Patescibacteria、Actinobacteriota的相对丰度也分别达到了11.31%、11.73%、11.86%、4.68%。与净化槽出水相似，排水口处受纳水体中Proteobacteria也是优势菌门，相对丰度为89.09%，且Patescibacteria、Actinobacteriota相对丰度则显著降低，这可能是由受纳水体中微生物相互作用导致的。

    图 4  污水处理过程和受纳水体中细菌相对在门水平的丰度变化
    Figure 4.  Changes in the relative abundance of bacteria at Phylum level during wastewater treatment and in receiving water
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    为了更加准确地反映净化槽不同单元和受纳水体中细菌的组成，对所选样本中细菌种群特征进行了属水平上的分析。结果如图5所示，进水中细菌种群相对简单，其中优势菌属为Paracoccus(43.31%)、Chryseomicrobium(26.00%)、Trichococcus(6.60%)和Pseudomonas(5.00%)。同样在有夹杂物的去除槽内，其细菌种群相对也较为简单，不同之处在于其优势菌属发生了明显变化，分别为Acinetobacter(38.70%)、norank_f__norank_o__norank_c__Gracilibacteria(7.54%)和Romboutsia(3.48%)。其原因可能是，在物理去除污水中较大颗粒物的同时，附着在颗粒物上的细菌也一并被去除，从而导致其优势菌属种类发生了变化。与其形成明显对比的是，A3、A4、A5单元中细菌菌属多样性明显增加，并且该3个单元中细菌相似性明显升高。除无法鉴定种类的others之外，A3单元中主要细菌菌属分别为Acinetobacter(6.38%)、norank_f__norank_o__Saccharimonadales(5.11%)、Pseudorhodobacter(4.52%)、Flavobacterium(2.85%)、Pseudomonas(1.29%)等。在A4、A5单元里，这些细菌菌属种类并未发生明显变化，但其相对丰度呈现一定差异。在A3、A4、A5单元中，Flavobacterium相对丰度呈现逐步上升趋势，分别为2.85%、18.12%、23.19%。Flavobacterium是活性污泥工艺的常见的好氧反硝化菌[27]，适合在含氮物质和氧气含量充足的A4、A5单元中生存，A3单元的厌氧环境并不适合其生存。在A3、A4、A5单元中，Acinetobacter相对丰度呈现逐步下降趋势，分别为6.38%、3.95%、0.57%。Acinetobacter是水处理过程中常见的异养硝化-好氧反硝化细菌[28]，所以在有机物质量浓度相对较低的A4、A5单元中并不利于其生长，导致其相对丰度下降。在A3、A4、A5单元中，Pseudomonas相对丰度呈现逐步下降趋势，分别为1.29%、0.83%、0.72%。有研究[29]表明，在人工湿地等脱氮除磷工艺中发现了参与有机物去除的Pseudomonas，因此，对于有机物质量浓度相对较低的A4、A5单元，Pseudomonas相对丰度可能会有所下降。与出水相比，受纳水体细菌组成出现显著变化，其中C39和Pseudomonas为主要的优势菌属，相对丰度分别为67.61%、10.21%，二者总相对丰度超过75%。

    图 5  污水处理过程和受纳水体中细菌在属水平的相对丰度变化
    Figure 5.  Changes in the relative abundance of bacteria at Genus level during wastewater treatment and in receiving water
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    2.4   一体化污水净化槽各处理单元中潜在致病细菌种群特征

    进一步深入分析本研究中一体化污水净化槽各处理单元的细菌特征，结果发现，其检出的潜在人致病性细菌种类丰富，并且各个单元的种类及含量也存在一定差异。进水中共检测到16种潜在致病细菌属， 而出水中则检出了20种潜在致病细菌属。有研究[30-39]表明，出水中检出的相对丰度较高的Klebsiella、Aeromonas、Arcobacter、Neochlamydia、Clostridium_sensu_stricto_10、Mycobacterium、Pseudomonas、Bacteroides、Acinetobacter和Flavobacterium均对人体存在潜在危害。Aeromonas hydrophila普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻[30]；Klebsiella pneumoniae是人类呼吸道和肠道的常居菌，可引起下呼吸道、血液、泌尿道、消化道、手术切口、颅内、皮肤软组织等多个部位感染[31]；Arcobacter skirrowii与人类和动物的腹泻、菌血症等疾病密切相关[32]；属于易引起疾病衣原体目的Neochlamydia，对人体健康也存在潜在威胁[33]；Mycobacterium tuberculosis可引起人体结核病，一种传染性疾病，主要是通过呼吸道传播，以肺结核为最多见[34]；Pseudomonas aeruginosa为假单胞菌属中最为常见的一种机会致病菌，常可引起尿路感染、烧伤创面及褥疮感染、败血症和肺部感染等[35]；Bacteroides fragilis系革兰阴性厌氧菌，由于其具有黏附性、血细胞凝集素、多糖胶囊、菌毛等多种毒力因素，在拟杆菌属中致病性最强，其可引起腹腔感染、术后伤口感染、糖尿病足感染、菌血症等[36]；Acinetobacter bamnannii是我国医院感染最主要的致病菌之一，该菌最常引起的感染为下呼吸道感染，尤其为呼吸机相关性肺炎，其次为血流感染[37]；Clostridium perfringens广泛存在于自然界及人和动物的肠道中，是近年来我国家畜“猝死症”的主要病因，可引起气性坏疽和食物中毒的主要病原菌坏死性肠炎[38]；Flavobacterium可引起肺炎，也可招致脑膜炎、败血症等感染，该菌会在机体免疫力下降时引起感染[39]。以上结果表明，当污水生物处理设施末端出水不经消毒处理时，其出水中潜在致病微生物的危害可能存在升高趋势。本研究选取了9种对人体危害性较大的致病细菌，对其在不同单元中的相对丰度变化进行了分析，结果如图6所示。不同致病细菌的变化趋势各有差异，总体可分为以下3类。

    图 6  水处理过程中潜在致病菌相对丰度变化
    Figure 6.  Changes in the relative abundance of potential pathogenic bacteria during water treatment
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    第1种为进水中相对丰度较低，但在设备不同单元随着污水流向相对丰度逐步呈升高趋势。Aeromonas和 Klebsiella在进水中几乎未检出，但在A2、A3、A4、A5、A6的相对丰度则分别升高至0.007 4%和0.002 5%、0.15%和0.004 5%、0.066%和0.001 9%、0.37%和0.005 9%、1.26%和0.70%。Arcobacter (0.01%)和Bacteroides(0.21%)在进水中有少量检出，但在不同单元中也均呈现上升趋势，A2、A3、A4、A5、A6的相对丰度分别为0.064%和0.80%、0.047%和0.34%、0.068%和1.06%、0.069%和1.22%、0.24%和2.63%。这可能是因为Aeromonas、Klebsiella、Arcobacter、Bacteroides、Pseudomonas等菌属细菌是活性污泥中大量存在且具有降解有机污染物功能的菌属[24,29,40]。因此，相对进水而言，后续各处理单元中这些细菌的相对丰度呈现出上升趋势。

    第2种为进水中相对丰度较低，但在整个水处理过程中其相对丰度呈现先上升后下降趋势。Mycobacterium(0.04%)和Neochlamydia(0.02%)在A2、A3、A4、A5、A6的相对丰度分别为0.35%和0.045%、0.78%和0.54%、0.47%和0.24%、0.41%和0.39%、0.27%和0.26%。这2种致病细菌丰度的最大值均在A3单元，可能是由于这2种细菌均属于厌氧菌，当溶解氧浓度较高时会抑制其活性，甚至会影响其生存。同样，Flavobacterium (0.04%)在A2、A3、A4、A5、A6的相对丰度也呈现出先上升后下降趋势，分别为0.10%、2.85%、18.12%、23.18%、1.32%，但下降点在A5单元，这可能因为Flavobacterium同时是一种好氧反硝化细菌[24]，在氮物质、有机物含量相对较低环境中会影响其繁殖，导致其相对丰度下降。

    第3种为进水中相对丰度较低，但在整个水处理过程中呈现先上升后下降再上升趋势。Clostridium_sensu_stricto_10在进水中的相对丰度为0.06%，而在设备其他处理单元的相对丰度分别为A2(1.30%)、A3(0.85%)、A4(0.30%)、A5(0.31%)、A6(1.84%)，其相对丰度的峰值分别在A2和A6中。高通量测序结果显示，各单元检测总片段分别为38 979、40 364、44 672、51 735、50 945、36 408。分析高通量测序结果表明，A1、A2、A3、A4、A5和A6单元中Clostridium_sensu_stricto_10的核酸检出片段量分别为23、525、378、154、159、669。造成这种现象的原因可能是：在功能单元中功能菌种类和相对含量增大，而Clostridium_sensu_stricto_10较功能菌对营养物质的竞争力较小，导致相对丰度下降，但具体原因需要进一步开展研究。以上分析结果表明，无论那种类型变化趋势，其设备出水中均包含一定量的潜在致病性细菌。

    3.   结论

    1)所研究的一体化污水净化槽设施处理农村生活污水时，不同处理单元细菌中群结构呈现一定差异，尤其是进水、夹杂物去除槽和后续生化处理单元之间。出水中也包含多样性丰富的细菌。

    2)本研究在一体化污水净化槽中共检出21种潜在致病细菌，以Flavobacterium、Pseudomonas等为主。值得注意的是，在其出水中存在20种潜在致病细菌，并且有9种优势潜在致病细菌的相对丰度较进水存在明显升高现象。

  • 图 1  MBBR装置流程图

    Figure 1.  Schematic diagram of MBBR equipment

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    图 2  MBBR处理过程中水温的变化

    Figure 2.  Changes of water temperature during MBBR treatment process

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    图 3  MBBR处理过程中DO的变化

    Figure 3.  Changes of DO during MBBR treatment process

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    图 4  MBBR处理过程中pH的变化

    Figure 4.  Changes of pH during MBBR treatment process

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    图 5  MBBR进出水COD的变化

    Figure 5.  COD variations of influent and effluent of MBBR

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    图 6  MBBR进出水NH+4-N的变化

    Figure 6.  NH+4-N variations of influent and effluent of MBBR

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    图 7  MBBR样品Venn图

    Figure 7.  Venn diagram of MBBR

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    图 8  MBBR细菌群落门水平、属水平相对丰度的变化

    Figure 8.  Relative abundances of bacterial community in MBBR at phylum and genus levels

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    图 9  环境因子与MBBR细菌群落的RDA分析

    Figure 9.  RDA analysis of environmental factors and bacterial community

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    表 1  MBBR样品OTU数和Alpha多样性指数变化

    Table 1.  OTUs and Alpha diversity analysis of MBBR samples

    检测指标1号MBBR2号MBBR
    9月10月11月12月9月10月11月12月
    有效序列48 13353 62439 10755 20158 95962 49739 75953 369
    OTUs/个1 0479901 0341 4411 4941 4609251 654
    覆盖率/%98.7798.8599.0598.4198.3597.9898.9499.97
    Chao11 0589901 1811 6591 4941 4609252 052
    Shannon7.376.747.857.558.047.997.587.95
    检测指标1号MBBR2号MBBR
    9月10月11月12月9月10月11月12月
    有效序列48 13353 62439 10755 20158 95962 49739 75953 369
    OTUs/个1 0479901 0341 4411 4941 4609251 654
    覆盖率/%98.7798.8599.0598.4198.3597.9898.9499.97
    Chao11 0589901 1811 6591 4941 4609252 052
    Shannon7.376.747.857.558.047.997.587.95
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图( 9) 表( 1)
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-12-28
  • 录用日期:  2019-05-09
  • 刊出日期:  2019-11-15
郝志鹏, 张会宁, 彭维, 葛向阳, 梁运祥, 靳慧霞, 陈正军. 悬浮填料生物膜反应器细菌群落季相更替对处理效果的稳定作用[J]. 环境工程学报, 2019, 13(11): 2601-2609. doi: 10.12030/j.cjee.201812193
引用本文: 郝志鹏, 张会宁, 彭维, 葛向阳, 梁运祥, 靳慧霞, 陈正军. 悬浮填料生物膜反应器细菌群落季相更替对处理效果的稳定作用[J]. 环境工程学报, 2019, 13(11): 2601-2609. doi: 10.12030/j.cjee.201812193
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HAO Zhipeng, ZHANG Huining, PENG Wei, GE Xiangyang, LIANG Yunxiang, JIN Huixia, CHEN Zhengjun. Stabilizing effect of seasonal alternation of bacterial communities on the effluent qualities in moving bed biofilm reactor[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(11): 2601-2609. doi: 10.12030/j.cjee.201812193
Citation: HAO Zhipeng, ZHANG Huining, PENG Wei, GE Xiangyang, LIANG Yunxiang, JIN Huixia, CHEN Zhengjun. Stabilizing effect of seasonal alternation of bacterial communities on the effluent qualities in moving bed biofilm reactor[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(11): 2601-2609. doi: 10.12030/j.cjee.201812193
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悬浮填料生物膜反应器细菌群落季相更替对处理效果的稳定作用

    通讯作者: 陈正军(1976—)，男，博士，副教授。研究方向：微生物修复技术。E-mail：chenzhengjun@163.com
    作者简介: 郝志鹏(1992—)，男，硕士研究生。研究方向：低浓度污水处理技术。E-mail：229266017@qq.com
  • 1. 华中农业大学生命科学技术学院，农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070
  • 2. 浙江大学宁波理工学院，宁波 315000
  • 收稿日期:  2018-12-28
  • 录用日期:  2019-05-09
  • 网络出版日期:  2020-11-11
基金项目:
浙江省自然科学基金资助项目(2017C510006)

摘要: 针对生物实验室污水处理难度高及其秋冬季节达标率低的问题，采用改进工艺的悬浮填料生物膜反应器(moving bed biofilm reactor, MBBR)进行连续处理，观察秋冬季节MBBR水质处理效果，利用高通量测序技术研究环境因子水温(Tw)、溶解氧(DO)、pH对生物膜细菌群落更替的影响以及主要微生物种群变化。结果表明，Tw由26 ℃下降到10 ℃期间，反应器COD、NH+4-N去除率仍然分别保持在75%、80%左右，MBBR出水稳定在一级A标准。变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和浮霉菌门(Planctomycetes)是生物膜主要优势菌门，Tw的下降引起拟杆菌门的相对丰度显著升高。假单胞菌属(Pseudomonas)和黄杆菌属(Flavobacterium)在低Tw下成为优势菌属，动胶菌属(Zoogloea)相对丰度保持稳定。通过冗余分析(RDA)发现，DO与短波单胞菌属(Brevundimonas)、pH与脱氯单胞菌(Dechloromonas)、固氮弧菌属(Azoarcus)具有显著正相关性，Tw与假单胞菌属、黄杆菌属具有显著负相关性。MBBR结果揭示，细菌群落动态更替是MBBR出水水质仍然保持稳定的重要原因。

English Abstract

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  • 随着我国高校实验室种类和规模不断扩大，实验产生的污水量逐渐增加[1]。实验室污水具有成分复杂、危害大、间歇性排放、排水量无明显规律的特点，对环境的污染问题也日益严重[2]。目前，实验室污水常规的处理方法主要包括物理处理、化学处理、生物处理[3]。物理处理存在能耗高、废水处理量小等缺点，化学处理过程中会产生二次污染和处理成本较高的问题[4-5]。传统生物处理是利用活性污泥法、生物转盘法和生物膜法等处理污水，该方法存在污泥膨胀、处理效果不稳定等缺点[6]。悬浮填料生物膜反应器(MBBR)是集活性污泥法和生物转盘法优点于一体的新型生物膜反应器，可以高效、稳定地处理成分复杂的污水[7]。

    MBBR具有抗冲击负荷能力较强，处理效果稳定，微生物量大等优点[8]。贾方明[9]利用MBBR在14~18 ℃水温处理北方地区生活污水，当DO=4.5 mg·L−1，出水氨氮去除率最高达到65%；当DO=2.0 mg·L−1时，出水总氮和总磷去除率分别为45.2%和58.2%，对于低温环境处理北方生活污水具有较大帮助。庄海峰等[10]采用缺氧/好氧MBBR处理煤化工废水，硝态氮/亚硝态氮混合液回流比200%，最佳HRT=12 h，出水COD、氨氮、总氮去除率分别达到68.1%、84.0%、74.7%，出水达到国家一级A排放标准，出水酚类化合物的数量和种类分别减少了84.4%和54.5%。李月等[11]采用MBBR处理低浓度氨氮(2 mg·L−1)养殖废水，MBBR在水力停留时间为6~8 min和曝气量为180 L·h−1的条件下氨氮去除率可达到70%~75%，氨氮去除负荷为560~700 g·(m3·d−1)，能高效地处理低浓度氨氮养殖废水。

    MBBR作为污水处理的新技术，目前研究主要集中于MBBR处理生活污水和工业废水，而对实验室污水的处理效果，尤其是环境因子影响下生物膜细菌群落变化的研究则较少[12]。本研究构建了2个相同的MBBR，在秋冬季节处理实验室污水，并监测系统的Tw、DO和pH，探究MBBR水质COD、NH+4-N处理效果以及生物膜细菌群落的动态变化，分析出水水质波动和细菌群落变化之间的相关性。

1.   材料与方法

    1.1.   实验装置

  • 本研究构建2套相同的1号MBBR和2号MBBR，实验装置如图1所示。MBBR反应桶有效容积为800 L，MBBR载体填充率为30%。反应器底部曝气采用多管砂芯曝气，曝气设置好氧 6 h，间隔2 h。1号和2号MBBR分别对应实验室A、B座污水，反应器进水方式采用间歇式进水，实验来水经格栅除杂、紫外杀菌后进入反应器，MBBR连续运行的水力停留时间(HRT)为8~12 h。出水经过紫外杀菌后进入沉淀池，检测出水水质后排放。

    • 1.2.   实验条件和检测方法

  • MBBR填料挂膜采用闷曝自然挂膜法，活性污泥取自武汉沌口污水处理厂脱水污泥，通过添加0.02%葡萄糖间隔曝气活化24 h，取SV30沉降在5 min左右的污泥，按照活性污泥和污水1∶2的比例投放，曝气时间为2 h，间隔时间为1 h[13]。经过约20 d，填料挂膜成功，MBBR运行处理实验室污水。MBBR处理实验室污水期间为自然环境温度，实验持续时间为106 d。每3 d，利用便携式多参数分析仪(HQ30D，哈希公司，美国)现场测定系统的Tw、DO、pH。同时，采集进出水水样，分别采用重铬酸盐法(GB 11914-1989)、纳氏试剂比色法(GB 7479-1987)测定样品的COD、NH+4-N。

    • 1.3.   DNA提取和高通量测序

  • 在反应器运行7、37、64、97 d(每月下旬)时，取填料生物膜提取总DNA，生物膜总DNA的提取按照土壤细菌DNA提取试剂盒(fast DNA SPIN kit for soil，MP biomedicals)的操作方法。总DNA利用微量紫外分光光度计(ND-1 000，Fisher Scientific，USA)检测其浓度和纯度，通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的完整性，并对其进行高通量测序。

    • 1.4.   数据分析

  • 采用Illumina MiSeq平台对细菌群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序，运用QIIME软件检查并剔除嵌合体等疑问序列，对获得的高质量序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列进行统计。利用R软件统计样本细菌群落多样性((即Alpha多样性)以及在各分类水平的组成并进行分析。用Canoco for Windows 4.5软件对细菌优势菌属的相对丰度和环境因子进行冗余分析(redundancy analysis, RDA)。

2.   结果与讨论

    2.1.   MBBR环境因子的变化

     

  • 图2是MBBR处理污水期间Tw的变化。由图2看出，Tw下降的趋势基本相同，由前期的26 ℃下降到中期的16 ℃，再到后期的10 ℃。水温是MBBR处理污水过程中重要的环境因子之一，对MBBR出水水质和生物膜微生物群落的演变具有显著的影响[14]。

    •  

  • 图3是MBBR处理污水期间DO的变化。1号和2号MBBR的DO含量整体保持在(4.8±0.3) mg·L−1和(5.0±0.2) mg·L−1。1号反应器在第94天时，DO含量降到最低3.8 mg·L−1，2号MBBR在94~106 d时，DO含量降低到3.7~4.3 mg·L−1。有研究[15]表明，微生物在分解利用污水中有机物等物质时，会大量消耗DO，从而引起污水中的DO含量波动。反应器DO含量增高有利于有机质的分解和硝化反应的进行，较低的DO含量有利于脱氮微生物进行反硝化作用。

    •  

  • 图4是MBBR处理污水期间pH的变化。1号、2号MBBR的pH稳定在7.5±0.3、7.8±0.3左右，整体偏弱碱性。1号反应器在第103天时，pH最高达到8.1，2号反应器在第19天时，pH最低下降到6.9。pH对微生物代谢活动影响显著，硝化过程产酸积累会导致反应受抑制，碱性环境有利于NH+4-N的去除[16]。反硝化过程产生的碱度会消耗环境酸度，较低的 pH有利于污水TN的去除。MBBR处理过程中pH处于弱碱性，有利于硝化反应的进行。

    • 2.2.   MBBR进出水质的变化

     

  • 图5(a)和图5(b)是MBBR进出水水质COD的变化。实验期间，1号和2号MBBR进水COD分别为31.02~1 003.16 mg·L−1和11.71~662.69 mg·L−1。1号MBBR整体出水COD低于50 mg·L−1，但在前22 d，出水COD为33.28~342.75 mg·L−1。监测数据表明，进水COD最高时(1 003.16 mg·L−1)，现有微生物种类和数量不能使耗氧有机污染物(以COD计)完全降解，随着微生物快速繁殖适应环境，出水COD逐渐下降且恢复正常值。2号MBBR平均出水COD低于50 mg·L−1，而在后期第97 天，出水COD达到126 mg·L−1，后期较低水温(10 ℃)和高有机负荷的进水(349 mg·L−1)是造成出水COD增加的原因。本研究中MBBR进水具有滞后性，高有机负荷的污水会对出水造成影响，而现有微生物种类、数量不足和低Tw是引起MBBR出水COD增高的主要因素[17]。

    •  

  • 图6(a)和图6(b)为MBBR进出水NH+4-N的变化结果。1号和2号MBBR进水NH+4-N浓度分别为0.20~9.69 mg·L−1和0.44~12.71 mg·L−1，进水NH+4-N浓度低但波动较大。1号和2号MBBR平均出水NH+4-N浓度保持在0.76~1.25 mg·L−1左右。1号MBBR在第46~52天，出水NH+4-N浓度均高于进水，最高可达到6.19 mg·L−1。环境因子数据表明，在49 d时，DO含量只有4.3 mg·L−1，pH降低到6.5，下降的DO和弱酸性的环境不利于硝化反应的进行，硝化细菌不能快速将NH+4-N转化为NO−3-N、NO−2-N，导致NH+4-N浓度积累，造成出水的NH+4-N浓度较高[18]。2号MBBR在后期97 d时(Tw=11.5 ℃，DO=3.7 mg·L−1)，出水NH+4-N浓度升高到3.28 mg·L−1，随后又快速恢复到正常水平，反应器较低的Tw和DO影响出水NH+4-N。结果表明，随着季节Tw下降，MBBR仍能稳定去除污水中的NH+4-N，出水NH+4-N浓度保持在达标值，而Tw、DO、pH等环境因子是引起出水NH+4-N波动的重要因素。

    • 2.3.   MBBR细菌群落的OTU和多样性

  • MBBR不同月份样品OTU数和Alpha多样性指数变化见表1。从表1可以看出，2个MBBR生物膜样品的高通量测序总共获得410 649个高质量的序列，覆盖率达到97.98%~99.97%。1号和2号MBBR样品OTU总数分别达到4 512、5 533(97%的序列相似度)。细菌群落多样性可以用侧重体现群落丰富度的Chao1和群落均匀度的Shannon指数来反映，1号和2号MBBR在12月份的Chao1指数均最大(1 689、2 050)，Shannon指数没有明显降低。2个MBBR在冬季12月份细菌群落多样性指数仍然保持在较高值，这说明填料微生物能很好地适应冬季低温环境，群落微生物多样性较高，从而能在低温环境下稳定地处理生物实验室污水。

    图7反映2个MBBR样品的Venn图。1号MBBR(A)在9、10、11、12月共有OTU数388个，独有的OTU数分别有211、171、205和677个；2号MBBR(B)在9、10、11、12月共有OTU数271个，独有的OTU数分别有383、368、213和995个。2个MBBR在不同月份都具有丰富的物种，2号MBBR的物种数量高于1号，在12月，2个MBBR独有的物种均达最高，说明MBBR在不同月份物种组成具有相似性，但每月都有其独有的物种，随着不同月份Tw的变化，物种数量也有相应的动态变化。

    • 2.4.   MBBR细菌群落结构的变化

  • 图8为 MBBR细菌群落相对丰度的变化。由图8(a)看出，MBBR处理实验室污水过程中变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和浮霉菌门(Planctomycetes)是主要优势菌门。变形菌门是所有MBBR样品最大的优势菌门，占据61.87% ~ 85.78%的相对丰度。变形菌门包含多种代谢类型，广泛分布在填料生物膜好氧和厌氧环境中，在MBBR除碳脱氮中发挥关键性作用[19]。拟杆菌门是主要优势菌门之一，1号MBBR样品拟杆菌门在9月和10月的相对丰度分别是3.12%和11.41%，在11月和12月的相对丰度升高到21.6%和15.05%。同样，2号MBBR样品相对丰度在11月和12月也升高到24.1%和16.73%。拟杆菌门的相对丰度在水温较低的环境显著增加，说明拟杆菌门细菌可以很好地适应低温环境，从而在MBBR低温处理污水中发挥显著作用[20]。

    图8(b)和图8(c)为MBBR样品细菌属水平相对丰度的变化。可以看出，在MBBR细菌群落属水平上，动胶菌属(Zoogloea)占据8.27%~15.96%的相对丰度，是明显的优势菌属之一。有研究[21]表明，动胶菌属是化能异养的专性好氧菌，通过群聚形成菌胶团，具有吸附、氧化分解、凝聚沉降等能力，高丰度的动胶菌属可以稳定生物絮团，保证充足的生物量分解污水中有机物，从而降低污水中COD值。氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)在1号、2号MBBR样品中相对丰度最高分别达到15.78%(9月)和11.06%(10月)；而在12月，分别下降到4.02%和0.21%，氢噬胞菌属更适合Tw较高的季节。氢噬胞菌属的细菌具有降解多环芳烃化合物(PAHs)的能力，通过产酶作用于苯环，经过氧化反应，进一步代谢为邻苯二甲酸等中间产物[22]。氢噬胞菌属可能在降解实验室污水的多环芳烃物质中发挥重要作用。假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度随Tw变化较显著，1号的假单胞菌属从9月的0.77%升高到12月的22.95%，同样2号的假单胞菌属从9月的0.32%上升到12月的5.86%。这表明假单胞菌属能很好地适应低温环境，成为生物膜的优势菌种，是低温环境重要的脱氮微生物之一。

    在11月和12月，MBBR出水水质能稳定保持在较低浓度，这是因为适应低温环境的微生物(如假单胞菌属)逐渐增加成为优势菌属，而不适应低温的微生物(如氢噬胞菌属)逐渐减少，通过生物膜菌群的演替，保证了MBBR在秋冬季节仍然能稳定达标的处理实验室污水。

    • 2.5.   环境因子对MBBR细菌群落结构的影响

  • 图9是环境因子与细菌群落的冗余分析(RDA)结果。MBBR的RDA排序图第1和第2主轴分别解释了优势菌群相对丰度变化的37.67%和23.96%，第1轴上，相关性较大的环境因子是DO(r=− 0.918)、NH+4-N(r=0.687)和pH(r=−0.634)；第2轴上，相关性较大的环境因子是COD(r=0.811)和Tw(r=−0.668)。可以看出，DO与短波单胞菌属(Brevundimonas)、气单胞菌属(Aeromonas)具有显著正相关性，较高的DO有利于短波单胞菌属和气单胞菌属的生长。短波单胞菌属具有广谱的烷烃类有机物降解能力，还能降解芳香族有毒物质[23]。pH与脱氯单胞菌(Dechloromonas)、固氮弧菌属(Azoarcus)具有显著正相关性，这说明脱氯单胞菌和固氮弧菌属更适合碱性的环境。脱氯单胞菌和固氮弧菌属是常见的脱氮微生物，脱氯单胞菌具有很强的硝酸盐还原能力，固氮弧菌属具有脱硫脱氮的重要作用[24-25]。Tw明显与黄杆菌属(Flavobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)具有负相关性，黄杆菌属和假单胞菌属在较低Tw环境成为优势菌种，从而在低温环境发挥分解有机物和脱氮的重要作用。综上所述，Tw、DO、pH是影响MBBR细菌群落更替的重要环境因子，对MBBR处理生物实验室污水产生较大影响。

3.   结论

  • 1)随着秋冬季节Tw从26 ℃下降到10 ℃，MBBR能稳定达标地处理实验室污水。当进水COD、NH+4-N分别为200 mg·L−1和6 mg·L−1时，MBBR出水COD、NH+4-N去除率仍然保持在75%和80%左右。

    2)通过RDA分析发现，DO与短波单胞菌属、pH与脱氯单胞菌、固氮弧菌属具有显著正相关性，Tw与假单胞菌属、黄杆菌属具有显著负相关性，环境因子Tw、pH、DO显著影响生物膜细菌群落的变化。

    3)高通量测序表明，MBBR样品中变形菌门、拟杆菌门和浮霉菌门是生物膜主要优势菌门，Tw的下降引起拟杆菌门的相对丰度显著增加，假单胞菌属和黄杆菌属的相对丰度随Tw的降低而极大地升高，动胶菌属相对丰度保持稳定，说明细菌群落动态更替是MBBR出水水质保持稳定达标的重要原因。

参考文献 (25)

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