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污水地下渗滤系统(subsurface wastewater infiltration system，SWIS)利用土壤与微生物的联合作用，通过物理、化学、生物反应去除污染物[1]。SWIS具有构造简单、操作维护成本低、污染物去除率高等优点[2]。但是，SWIS长期运行会改变土壤渗透性能，影响出水水质。LI等[3]将长期(7年以上)和短期(1年)运行的SWIS进行比较，结果表明，短期运行SWIS的BOD、COD、SS、
NH+4 -N、TP去除率分别为95.0%、89.1%、98.1%、87.6%和98.4%，长期运行SWIS的BOD、COD、SS、NH+4 -N、TP去除率分别降低至89.6%，87.2%，82.6%，69.1%和74.4%，说明长期运行导致的土壤渗透性、孔隙度及代谢气体积累程度的变化将影响SWIS处理性能。土壤渗透性能降低主要由物理、化学、生物和气体4方面因素造成。粒径较小的悬浮物堆积在基质孔道中，降低渗透性。粒径小于6 μm的颗粒是渗透性降低的主要原因[4]。有机悬浮物不会造成明显的渗透性降低，无机悬浮物更易降低土壤渗透性[5]。悬浮物引起的渗透性降低通常无法得到恢复[6]。污水中的离子与SWIS中原有的离子发生化学反应，可产生不溶性沉淀，其中，碳酸盐和铁化合物是主要的沉淀[7-8]。细菌细胞和生物膜会积累在孔隙空间中，导致孔隙减少和水力传导性降低[9]。影响渗透性能的气体包括进水携带空气和生物代谢气体[10]。进水携带空气是随进水进入系统后截留在系统中的空气，生物代谢气体是微生物呼吸产生的气体。一方面，空气可能积累在孔隙中，另一方面，空气中的氧气会影响生物代谢气体的产生，代谢气体也会积累在孔隙中。进水携带空气和生物代谢气体如果不能及时排出系统，会降低体积含水率，导致渗透性能降低。渗透性能适度降低会增加系统内部非饱和流动区，从而导致污染物处理能力增加；而渗透性能大幅降低会使污水难以通过基质层，污染物处理能力降低[5]。
预处理(过滤沉淀)可以减少进入系统的悬浮物，干湿交替可以恢复孔隙度，酸化可以减少化学沉淀产生[11-12]。然而，研究多集中于防治悬浮物、化学物质和微生物导致的渗透性能降低。由于针对气体对土壤渗透性能的影响的研究鲜有报道，实际工程中也没有针对气体的有效防治方法。因此，本研究对气体导致的SWIS渗透性变化及污染物处理效果进行了初步探究，为气体堵塞及其防治奠定基础。对SWIS进水采用了不同曝气处理(不曝气、微曝气、强曝气)，研究了不同的曝气量对SWIS渗透系数、体积含水率、代谢气体释放量和污染物(COD、
NH+4 -N、NO−3 -N、NO−2 -N和TP)去除率的影响，以期为研究气体堵塞及其预防提供参考。 -
进水为人工配制的生活污水，水质特征如下：COD (330.21±7) mg·L−1，
NO−3 -N (3.12±0.1) mg·L−1，NO−2 -N (0.40±0.004) mg·L−1，NH+4 -N (49.08±0.6) mg·L−1，TP (4.0±0.3) mg·L−1。对进水进行不同程度的曝气处理，形成不曝气水、微曝气水和强曝气水。不曝气水为人工配制的生活污水，不经过任何处理，气体含量为0%。微曝气水使用45 L·min−1的空气泵对污水进行持续曝气，气体含量为3.6%。强曝气水使用70 L·min−1的空气泵对污水进行持续曝气，气体含量为6.3%。气体含量测量方法使用杜磊[13]的方法。
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SWIS模拟装置如图1所示。尺寸为180 cm×29 cm(高×直径)。基质分为2层，底部为5 cm的砾石，砾石上方为145 cm的混合基质。混合基质由沙、炉渣和农田土按1∶2.5∶6.5的比例混合而成，孔隙度为0.55。进水由蠕动泵泵送，通过“十”字布水管(土壤下65 cm处)和不透水皿散水。在土壤下10、40、70、100、130 cm处放置体积含水率传感器和压力传感器，连接电脑读取数据。系统下方的集水装置收集出水。在图1(a)的基础上增加分层气体采样器(图(1b))。将集气管埋设于图1(a)土柱的土壤下方，各层集气管之间相距30 cm，上部取气口位于土壤上方，平时密封，只在采样时短暂开启。用分层气体采样器采集土壤下10、40、70、100、130 cm处的气体。
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分别用SWIS处理不曝气水、微曝气水和强曝气水，进水负荷为14 cm·d−1，持续44 d，用电脑记录体积含水率和压力的数据；用集水装置收集出水，记录出水流量；定期采集气体样品和出水样品。
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气体样品由气相色谱仪(Agilent 7890B)测定。根据文献中的监测分析方法[14]测定水质：化学需氧量(COD)使用重铬酸钾氧化法测定；氨氮(
NH+4 -N)使用纳氏试剂光度法测定；硝态氮(NO−3 -N)使用紫外分光光度法测定；亚硝态氮(NO−2 -N)使用分光光度法测定；总磷(TP)使用钼酸胺分光光度法测定。渗透系数由达西定律[15]计算，计算方法如式(1)所示。
式中：k为渗透系数，cm·s−1；Q为流量，m3·s−1；l为相邻压力计的垂直距离，cm；A为横截面积，m2；h为压头变化，m。
本研究使用SPSS软件进行相关分析，文中所有相关系数均为排除时间变量后的Pearson相关系数。
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不同曝气处理下渗透系数随时间的变化如图2所示。可以看出，由于SWIS运行时间较短，不同曝气处理下的SWIS均没有出现土壤堵塞现象，但是曝气量影响了不同深度处的渗透系数。SWIS的渗透系数为4.167×10−5~1.389×10−3 cm·s−1[16]。渗透系数过高，SWIS持水能力降低，污染物未经有效处理就被排出系统；渗透系数过低，SWIS土壤基质堵塞。PAN等[17]认为，渗透系数低于3.5×10−4 cm·s−1时，SWIS会出现堵塞现象。实验中不同深度处的渗透系数均高于3.5×10−4 cm·s−1，没有发生堵塞现象。在−40~−10 cm处，不同曝气处理的渗透系数均为最低。在−70~−40 cm处，不曝气系统达到稳定的渗透系数高于初始渗透系数，微曝气和强曝气系统达到稳定的渗透系数低于初始渗透系数。在−100~−70 cm处，不曝气系统的渗透系数波动较大，微曝气和强曝气系统的渗透系数几乎没有波动；该深度微曝气和强曝气系统的渗透系数低于不曝气系统。在−130~−100 cm处，不同曝气处理下，系统达到稳定的渗透系数均高于初始渗透系数，渗透系数稳定后，强曝气系统的渗透系数较高。
从图2还可以看出，不曝气、微曝气和强曝气系统渗透系数分别在大约10、14、22 d后达到稳定，这说明曝气量越大，SWIS渗透系数达到稳定所需时间越长。这主要归因于以下2个方面：一方面，曝气量越大，进水携带空气越多；另一方面，曝气为好氧微生物呼吸产生CO2提供了有利条件，导致SWIS内部气体含量增加，从而使得系统达到平衡所需时间更长。
曝气量与SWIS渗透系数的相关性分析如表1所示。将时间变量的影响排除后，分析曝气量与渗透系数的相关关系。P<0.05说明两者有显著的相关关系。相关性强弱用相关系数表示，相关系数的绝对值越大，相关性越强。曝气量与 −70~−40 cm处的渗透系数不存在相关关系，与−130~−100、−100~−70 cm、−40~−10 cm处的渗透系数有显著的相关关系。其中，曝气量与−130~−100、−40~−10 cm处的渗透系数是正相关关系，与−100~−70 cm处的渗透系数是负相关关系。曝气主要降低了−100~−70 cm深度处的渗透系数。进水通过布水管(土壤下65 cm处)进入系统后，少量污水向上流动，大量污水在毛细作用和重力作用下向下流动，首先影响−100~−70 cm处的土壤，导致−100~−70 cm处的渗透系数降低。
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不同曝气处理下体积含水率随时间的变化见图3。从图3可以看出，微曝气和强曝气系统体积含水率变化规律相似，与不曝气系统体积含水率变化规律差异较大。在微曝气和强曝气系统中，−100 cm处的体积含水率较低，−10、−40和−70 cm处的体积含水率较高；曝气量越大，各层体积含水率越低。在不曝气系统中，−100、−40和−10 cm处的体积含水率较高，在0.90以上；在−70 cm处的体积含水率开始缓慢波动下降，35 d后迅速下降至0.80。
由图2和图3可知，在不同曝气处理下，渗透系数在实验中后期达到稳定，体积含水率在整个实验阶段不断变化，这表明体积含水率影响实验前期的渗透系数，与实验中后期的渗透系数之间的关系不明显，这与BECKWITH等[18]的研究结果不同。他们的研究对象是泥炭土，孔隙度为0.96~0.97，体积含水率为0.80~0.85，体积含水率稍微变化可能会引起土壤结构的改变，影响渗透系数，所以体积含水率与渗透系数的相关性很强。而本研究的对象为SWIS，主要基质是农田土、炉渣和沙的混合基质，孔隙度为0.55，体积含水率为0.80~1.00，土壤结构比较稳定，孔隙中气体含量变化与水流移动达到平衡后，渗透系数不再变化。
曝气量与SWIS体积含水率的相关性分析如表2所示。曝气量与−10 cm处的体积含水率不存在相关关系，与−100、−70、−40 cm处的体积含水率有显著的相关关系。其中，曝气量程度与−100、−40 cm处的体积含水率为较强的负相关关系，但与−70 cm处的体积含水率为较强的正相关关系。
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不同曝气处理下代谢气体浓度随时间的变化见图4。可以看出，不曝气和微曝气系统中各深度处的CO2浓度相近，为1 000~12 000 mg·m−3；强曝气系统中，CO2浓度较高，为1 000~35 000 mg·m−3。与不曝气系统相比，微曝气系统降低了CH4的浓度，这是因为曝气增加了氧气浓度，抑制了产甲烷菌的生长繁殖。在强曝气系统中，24 d内CH4浓度很低，24~40 d略有增加，40~44 d迅速增加。尽管曝气抑制了产甲烷菌的生长繁殖，但是CH4积累在系统中，没有及时释放，导致强曝气系统中最终的CH4浓度远高于不曝气和微曝气系统。微曝气系统中N2O浓度略低于不曝气系统，强曝气系统中N2O浓度远高于不曝气和微曝气系统。N2O的产生途径有硝化作用、反硝化作用和共反硝化作用。其中，在共反硝化作用中，N2O的一个N原子来源于
NO−2 -N，另一个N原子来源于其他氮化合物[19]。曝气增加好氧区，促进硝化作用产生N2O，同时硝化作用过程中产生的NO−2 -N为共反硝化作用提供N元素，抑制反硝化作用产生N2O。分析认为，不曝气系统中反硝化是产生N2O的主要途径。在微曝气系统中，较低的曝气量减少了反硝化产生的N2O，但对硝化和共反硝化作用促进作用不强，所以微曝气系统N2O浓度较低。在强曝气系统中，较高的曝气量会促进硝化和共反硝化作用，尽管反硝化产生的N2O减少，硝化和共反硝化作用产生大量N2O，强曝气系统N2O浓度高。从图4还可以看出，在不同曝气处理下，CO2、CH4、N2O在−10 cm和−40 cm处的浓度都较低，在−70、−100和−130 cm处的浓度较高，这说明代谢气体主要影响系统中下部的渗透系数。−10 cm和−40 cm接近土壤表层，气体容易通过基质孔隙释放到大气中。−70、−100和−130 cm位于系统中下部，其中微生物代谢产生的气体一部分沿基质孔道向上移动，释放到大气中，一部分随水流从出水口流出，剩下的积累在基质孔隙中。在−70、−100 cm处，生物代谢气体与进水携带空气共同积累，降低了−100~−70 cm处的渗透系数。在−130 cm处，生物代谢气体浓度较高，但该深度接近出水口，气体易释放，此外，该深度离进水口较远，进水携带空气少，气体对渗透系数影响较小。
曝气量与CO2、CH4、N2O浓度的相关性分析如表3所示。曝气量与各深度处的CH4浓度不存在相关关系，与各深度处的CO2、N2O浓度有显著的相关关系。其中，曝气量与−100、−70、−40 cm处的CO2、N2O浓度相关系数更高，与−130、−10 cm处的CO2、N2O浓度相关系数较低，这说明曝气对接近进水位置的−100、−70、−40 cm处的CO2、N2O浓度影响较大，而对接近土壤表层的−10 cm处和接近出水口的−130 cm处的CO2、N2O浓度影响较小。
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不同曝气处理下出水污染物去除率随时间的变化结果见图5。从图5可以看出，
NH+4 -N，COD和TP的去除效果较好，NO−3 -N，NO−2 -N的去除效果较差。生物硝化-反硝化是SWIS脱氮的主要途径[20]。曝气为好氧硝化作用提供了有利环境，抑制了厌氧反硝化作用，因此，微曝气和强曝气系统的NH+4 -N和NO−2 -N去除率均高于不曝气系统，微曝气和强曝气系统的NO−3 -N去除率均低于不曝气系统。NO−3 -N和NO−2 -N的初始浓度高于进水，这是因为NH+4 -N在亚硝化菌和硝化菌作用下所产生的NO−2 -N和NO−3 -N积累在SWIS中。COD去除的主要途径是有机物降解。好氧异养细菌在有机物好氧降解中起着重要作用，充足的供氧能有效提高好氧微生物降解有机物的效率[21]。曝气提高了SWIS中溶解氧浓度，有利于耗氧的有机物(以COD计)降解，所以微曝气和强曝气系统中的COD去除率高于不曝气系统。TP去除的主要途径是物理化学吸附[22]。TP去除率在89%以上。曝气对物理化学吸附的影响作用较小，因此，不曝气、微曝气和强曝气系统的TP去除率相近。曝气量与污染物去除率的相关性分析如表4所示。曝气量与
NO−3 -N、NO−2 -N、TP去除率不存在相关关系，与NH+4 -N、COD去除率有显著的相关关系。曝气量与NH+4 -N、COD去除率有显著的正相关关系。 -
1)曝气量与−130~−100、−40~−10 cm处的渗透系数有较强的正相关关系，与−100~−70 cm处的渗透系数有较强的负相关关系，与−70~−40 cm处的渗透系数不存在相关关系，这说明曝气主要降低了−100~−70 cm深度处的渗透系数。
2)曝气降低了−100 cm处和−40 cm处的体积含水率，增加了−70 cm处的体积含水率，对−10 cm处的体积含水率几乎没有影响。其中，−100 cm处的体积含水率的减少可能是导致−100~−70 cm处的渗透系数下降的原因。
3)曝气量与各深度处的CH4释放浓度不存在相关关系，与各深度处的CO2、N2O释放浓度为正相关关系；生物代谢气体在系统中下部(−130、−100和−70 cm处)的浓度高于系统上部(−40 cm和−10 cm)。生物代谢气体主要影响系统中下部的渗透系数。
4)曝气增加了SWIS对
NH+4 -N、COD的去除率，与NO−3 -N、NO−2 -N、TP去除率不存在相关关系。曝气会增加短期运行的SWIS整体污染物处理效果，但对长期运行的SWIS处理效果的影响还需要进一步的研究。
曝气对污水地下渗滤系统渗透性及处理性能的影响
Effects of aeration on permeability and treatment performance of subsurface wastewater infiltration system
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摘要: 针对气体影响地下渗滤系统的渗透性及污水处理效果的问题，用地下渗滤系统处理不同曝气程度的生活污水，研究曝气对不同深度基质理化性质(渗透系数、体积含水率、气体类型及浓度)和出水水质的影响。结果表明，曝气增加了−130~−100、−40~−10 cm处的渗透系数，降低了−100~−70 cm处的渗透系数，与−70~−40 cm处的渗透系数不存在相关关系；曝气增加了−70 cm处的体积含水率，降低了−100 cm和−40 cm处的体积含水率，对−10 cm处的体积含水率几乎没有影响；曝气增加了各深度处的CO2、N2O释放浓度，与各深处的CH4释放浓度不存在相关关系；曝气增加了
NH+4 -N和COD去除率，与NO−3 -N、NO−2 -N和TP去除率不存在相关关系。探明了气体对地下渗滤系统处理性能的影响，为气体堵塞及其预防提供了参考。Abstract: In order to identify the effects of gas on the soil permeability and sewage treatment of subsurface wastewater treatment system (SWIS), domestic wastewater with different aeration treatment was introduced into a set of SWIS to study the effect of aeration on the physicochemical properties (permeability coefficient, volumetric water content, gas types and concentrations) of the matrix at different depths and effluent quality. The results indicated that aeration improved the permeability coefficients at −130~−100 cm and −40~−10 cm, reduced the permeability coefficient at −100~−70 cm, had an insignificant correlation with the permeability coefficient at −70~−40 cm. Meanwhile, the aeration elevated the volumetric water content at −70 cm, reduced the volumetric water content at −100 cm and −40 cm, had slight influence on the volumetric water content at −10 cm. Aeration improved the releasing concentrations of CO2 and N2O at different depths, and had an insignificant correlation with CH4 releasing concentrations. Aeration treatment of raw water improved the removal rates ofNH+4 -N, COD and TP, reducedNO−3 -N removal rate, and had no correlation withNO−2 -N removal. The effects of gas on SWIS were preliminarily identified, which provided references for further research on gas clogging and its prevention. -
农村污水的分质收集处理是农村污水资源化的重要方式。农村生活污水按照其污水来源和水质特征的不同，可以大致分为灰水和黑水2大类。其中，灰水是指不包括冲厕污水(黑水)在内的生活杂排水，主要包括餐厨污水、洗涤污水和洗浴污水等[1-2]。灰水由于基本不含肠道病原微生物、污染物浓度较低且易于自然生物处理的特点，具有很高的直接回用价值[1]。为缓解水资源压力，灰水单独采用管道收集并直接用于灌溉的回用方式已经得到了一定的应用[3]。而农村污水治理工程设施投资中的管道敷设成本占所有建设投资的70%以上，管道敷设成本过高直接限制了农村地区污水收集治理工作的有效开展[4-5]。小管径重力流排水系统具有管道成本低、施工开挖土方量少、建设迅速等诸多优点，非常适用于经济条件相对落后的农村地区[6-7]。基于此，小管径重力流灰水管道系统具有明显的经济优势和生态环境效益，具有较大的推广潜力和应用前景。
排水管道生物膜具有一定的污水预处理功能，并且可能产生CH4、H2S等具有环境和健康风险的气体，对于市政排水管道生物膜的微生物群落特征已经有了相对广泛的研究[8-10]。然而，农村污水特征与市政排水相比，其水质水量具有明显的随时间变化规律，即每天在用餐时段污水水量较大，而夜间基本没有污水排放[11]。具体到管道容量较小的小管径系统中，在早中晚时段，污水排放高峰期，管道经常临近满管流状态；而在夜间，基本处于断流状态。不同的流态决定了不能直接套用市政污水管道生物膜数据来解析农村污水管道生物膜，当前对于农村污水管道生物膜的认识仍处于起步阶段，更是罕有针对农村灰水管道生物膜的研究。
本研究采用实验室规模的小管径重力流灰水管道系统，研究了小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落、氮硫循环管道功能菌特征以及氮循环功能基因分布情况，重点探讨了管道敷设坡度对于小管径重力流灰水管道生物膜细菌群落的影响。本研究丰富了排水管道生物膜认知体系，为小管径重力流灰水管道的优化设计和应用提供了参考。
1. 材料与方法
1.1 实验装置
本研究采用的实验装置为实验室规模的小管径重力流管道模拟系统。整个系统由3套不同敷设坡度(5‰，10‰，15‰)的透明UPVC排水管道系统(φ50 mm×3.5 mm，单组管道总长5 m，溢彩，中国)、PVC阀门(百盛，中国)、高位水箱(PVC板自制)、循环水箱(PVC板自制)、潜水泵(HQB-5000，森森，中国)、恒温器(300 W，YEE，中国)等组成(图1)。灰水由潜水泵经循环水箱提升至高位水箱，沿排水管道依靠重力作用流下，最终回到循环水箱。灰水在整套系统中循环流动，模拟小管径重力流灰水管道的生物膜生境，同时保证了3套管道中的灰水水质相同，有效避免了水质差异造成的生物膜群落结构差异。为进行生物膜取样，在距直管道起点1 m处设置30 cm长的取样管道，两侧采用50 mm PVC活接头(联塑，中国)连接，确保取样管道的轴线与直管道重合。
图 1 小管径重力流模拟装置示意图Figure 1. Schematic diagram of simulated small diameter gravity sewers1.2 水质特征及分析测试方法
为模拟实际农村灰水在小管径重力流管道中的真实流态，本研究利用调节潜水泵功率和阀门开闭的方式保持管道内的充满度随时间有规律的变化，管道实际充满度和平均灰水流速如图2所示。整个实验设备的运行水温维持在20 ℃并保持避光运行，以模拟真实的灰水管道运行状态。本研究进水采用人工配制的灰水，配制方法见表1。每2 d换水一次，运行水质条件见表2。整套设备连续运行60 d，形成成熟的管道生物膜。
表 1 配制灰水组分浓度Table 1. Composition of synthetic gray water常量物质 浓度/(mg·L−1) 微量物质 浓度/(μg·L−1) 葡萄糖 80 CaCl2·2H2O 73.50 蛋白胨 80 MgSO4·7H2O 51.25 CH3COONa 54 Na2SiO3·9H2O 30.43 NaHCO3 91 Al2(SO4)3·16H2O 11.78 KCl 57 FeCl3·6H2O 4.83 KNO3 7 ZnSO4·7H2O 0.88 NH4Cl 19 H3BO3 0.58 NaH2PO4·2H2O 15 CuSO4·5H2O 0.39 食用油 30 MnCl2·4H2O 0.27 十二烷基苯磺酸钠 5 KI 0.03 EDTA 20.00 注：pH=7。 | Show Table
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图 2 管道充满度及流速随时间的变化Figure 2. Variation of relative depth and flow velocity with time in sewers表 2 实验灰水水质特征Table 2. Characteristics of gray water in the experiment测试结果 pH DO/(mg·L−1) COD/(mg·L−1) 
-N/(mg·L−1)TN/(mg·L−1) TP/(mg·L−1) 
/(mg·L−1)LAS/(mg·L−1) 平均值 7.07 4.26 121.56 4.90 14.33 3.83 18.07 2.69 标准差 0.13 0.57 85.88 0.63 1.22 0.94 7.33 1.60 注：LAS为阴离子表面活性剂。 | Show TableDownLoad:
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相关研究[12-13]表明，经过60 d的连续运行，排水管道生物膜可以发育成熟。连续运行后，在第60天拆卸取样管道，用经过灭菌处理的药匙刮下少量位于管道内表面底部的生物膜样品，置于无菌离心管中，迅速置于4 ℃冰箱中保存，用于生物膜样品的形貌观测。另取3份平行样品，迅速置于4 ℃便携式恒温箱(FYL-12MC-B4,福意联，中国)中临时暂存，在0.5 h内，转移至−80 ℃冰箱中保存，用于生物膜细菌的群落分析，取3份平行样品群落分析结果的算术平均值。
将生物膜样品浸没于2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃避光静置24 h。然后依次利用25%、50%、75%、95%和100%的乙醇溶液进行梯度脱水，最后于−50 ℃中冷冻干燥，制得扫描电镜样品。将样品喷碳后，置于JSM-5610LV型扫描电镜(JEOL，日本)下，分析生物膜样品的形貌特征。
采用PowerSoil® DNA Isolation Kit (MoBio，美国)试剂盒提取生物膜样品的DNA，并利用细菌16S rRNA通用引物338F和806R进行PCR扩增。总PCR反应体系的体积为20 μL，包括超纯水13.25 μL，10×PCR ExTaq Buffer 2.0 μL，DNA模板(100 ng·mL−1)0.5 μL，引物338F和806R (10 mmol·L−1)各1.0 μL，dNTP 2.0 μL, ExTaq (5 U·mL−1) 0.25 μL；在95 ℃中维持5 min，继而进行30个扩增循环，每个循环包括95 ℃孵育30 s，58 ℃孵育20 s，72 ℃孵育6 s；最后在72 ℃维持7 min，得到扩增产物。扩增产物经纯化定量回收后，采用Illumina HiSeq 2500 (Illumina，美国)高通量测序平台进行测序分析。细菌高通量测序结果以97%的相似度划分为分类操作单元(OTU)，获得的OTU与细菌Silva分类学数据库比对，得到细菌群落组成信息。DNA提取和高通量测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成，高通量测序数据通过百迈客云计算平台进行处理和分析(
www.biocloud.net )。将细菌16S rRNA测序结果与Greengenes分类学数据库比对后形成的OTU文件(97%相似度)上传至PICRUSt在线分析网站(
http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/ )，运算形成按拷贝数标准化处理的OTU文件，进而依据网页内置程序进行PICRUSt宏基因组预测[14], 预测得到的KEGG分类数据(ko)通过与KEGG数据库进行比对，获得相关功能基因丰度。2. 结果和讨论
2.1 灰水管道内胶状生物膜的形貌结构
经过60 d的连续运行，小管径重力流灰水管道内壁形成了厚度相对均匀的淡黄色的胶状生物膜。生物膜的扫描电镜结果如图3所示。可以看出，脱水后的灰水管道生物膜呈粗糙的表面结构，生物膜中分布着大量的不同种类的细菌、真菌、原生动物和胞外聚合物(EPS)，灰水管道生物膜中的微生物以细菌为主，细菌种类多样，杆菌球菌密布，覆盖了整个生物膜表面。真菌数量相对较少，但仍广泛分布在灰水管道生物膜中。观察到的原生动物体表有六边形鳞片构成的外壳，从形貌特征上分析可能为网足属原生动物。原生动物的大量出现表明经过60 d的连续运行，灰水管道生物膜已经形成了复杂的微型生态系统，确认了此时生物膜已经成熟。
2.2 灰水管道胶状生物膜的细菌群落结构
通过对9个样品(每组管道各3个平行样品)的高通量测序，共获得443 338条有效序列，共划分为230个OTU。其中181个OTU为3个坡度共有(图4)，说明不同坡度下小管径重力流灰水管道生物膜细菌中绝大部分物种是共有的，坡度变化对于灰水管道生物膜中主要的细菌种类影响不大。根据香农指数曲线(图5)所示，随着取样序列数的增加，3个坡度下的平均Shannon指数逐渐趋于平缓，这说明本研究中的高通量测序深度满足进一步分析的要求，测序结果能够充分反映细菌的群落结构。
小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落结构如图6和图7所示。细菌主要以Proteobacteria (变形菌门) (57.76%±5.76%)、Actinobacteria (放线菌门) (38.46%±5.50%)、Bacteroidetes (拟杆菌门) (2.18%±0.73%)和Acidobacteria (酸杆菌门) (0.79%±0.25%)为主，其中以变形菌门和放线菌门为优势菌门。在15‰的坡度下，放线菌门的丰度显著减小，高流速条件下不利于生物膜上放线菌的生存。另外，生物膜中存在一定丰度的Nitrospirae (硝化螺旋菌门) (0.12%±0.01%)，这证明生物膜中存在硝化过程。Paenarthrobacte (38.35%±5.50%)、Ensifer (剑菌属) (17.11%±1.50%)和Spingopyxis (11.73%±4.32%)是生物膜中的优势细菌属。Paenarthrobacte是一种好氧生长的球形放线菌，可以利用多种碳源，并且可以水解淀粉类物质[15]。剑菌属是一种好氧生长的杆状变形菌，能够利用包括葡萄糖、半乳糖在内的多种碳源，不能水解淀粉，具有硝酸盐和亚硝酸盐还原能力，能够附着在其他细菌表面并使其裂解，是一种非专性捕食性细菌[16]。Spingopyxis是一种好氧生长的呈黄色外观的杆状变形菌，可以利用多种碳源，没有发酵功能，不能水解淀粉，部分种有硝酸盐还原能力[17]，它的存在解释了灰水管道生物膜淡黄色外观的成因。优势细菌属都能利用多种碳源，说明小管径重力流灰水管道生物膜对于多种有机物都有一定的生物降解能力。坡度对细菌优势属的相对丰度有显著的影响：5‰和10‰坡度下细菌丰度差异不明显，而15‰坡度下的细菌丰度与前2个坡度有显著差异。主要表现在15‰坡度下，Paenarthrobacte、Hydrogenophaga(噬氢菌属)和Haliangium丰度降低，而Ensifer (剑菌属)、Spingopyxis、Sphingobium (鞘脂菌属)和Pseudomonas (假单胞菌属) 丰度升高。
为深入分析管道坡度对细菌群落结构的影响，在属水平下进行LEfSe分析(图8)。图8只显示满足线性判别分析LDA值大于3.5的差异指示物种。LEfSe分析表明，在本研究中的3个管道坡度下，管道生物膜的细菌中共有24个差异指示物种，其中5‰坡度下含有10个，10‰坡度下含有5个，15‰坡度下含有9个，差异指示物种的丰度在相应的坡度下的丰度显著高于另外2个坡度的丰度。5‰坡度下的差异指示物种包括Rhodobacteraceae (红杆菌科)、Rhodobacterales (红杆菌目)、Flavihumibacter、Bacteroidetes (拟杆菌门)、Sphingobacteriaceae (鞘脂杆菌科)、Sphingobacteriia (鞘脂杆菌纲)、Flavobacteriales、Chitinophagaceae、Sphingobacteriales (鞘脂杆菌目)、Flavobacteriia。10‰坡度下的差异指示物种包括Actinobacteria (放线菌门)、Paenarthrobacter、Micrococcales (微球菌目)、Micrococcaceae (微球菌科)、Actinobacteria (放线菌门)。15‰坡度下的差异指示物种包括Alphaproteobacteria (α变形菌纲)、Proteobacteria (变形菌门)、Terrimonas、Thiotrichaceae (硫发菌科)、Thiotrichales (硫发菌目)、Blastomonas (芽单胞菌属)、Beggiatoa (贝日阿托菌属)、Obscuribacterales、Desulfurellales (硫还原菌目)。5‰、10‰、15‰ 3个坡度下差异贡献最大的指示物种分别是Rhodobacteraceae (红杆菌科)、Actinobacteria (放线菌门)和Alphaproteobacteria (α变形菌纲)。管道敷设坡度的变化可显著影响小管径重力流灰水管道生物膜的细菌群落结构。
2.3 氮循环和硫循环功能细菌分布特征
排水管道生物膜中的功能细菌主要由氮循环细菌和硫循环细菌组成，一般可以将其分为反硝化细菌、亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫酸盐还原细菌和硫氧化细菌5类[18-20]。本研究利用基于通用引物的高通量测序技术，研究了小管径重力流灰水管道生物膜中功能细菌(属水平)的分布特征(表3)。在本研究中，灰水管道生物膜中存在大量的以Pseudomonas (假单胞菌属) (2.78%±0.56%)和Rhodobacter (红杆菌属) (2.05%±0.94%)为主体的含有反硝化细菌的属，其中，假单胞菌属下的部分种属于好氧反硝化细菌[21]，含有反硝化细菌的属总丰度随着管道坡度的增大而逐渐降低。Nitrospira (硝化螺菌属) (0.13%±0.01%)是本研究中唯一检出的一种硝酸细菌属，以Acidiphilium (嗜酸菌属) (0.04%±0.02%)为主要代表的硫氧化菌属也有检出。在0.01%的检出限下，没有检出属水平的亚硝酸细菌和硫酸盐还原细菌。在排水系统中，亚硝酸细菌的丰度比硝酸细菌的丰度大约低一个数量级[22]，而本研究中灰水管道生物膜的硝酸细菌丰度仅为0.1%左右，因此，亚硝酸细菌在基于通用引物的高通量测序中难以检出。
表 3 灰水管道生物膜功能细菌相对丰度(属水平)Table 3. Relative abundance of functional bacteria in gray water sewer biofilms at genus level功能菌 属名 相对丰度/% 坡度5‰ 坡度10‰ 坡度15‰ 含有反硝化细菌的属 Rhodobacter 2.745 2.423 0.986 Pseudomonas 2.121 1.990 3.024 Paracoccus 0.735 0.681 0.273 Aeromonas 0.491 0.594 0.828 Xanthomonas 0.296 0.258 0.139 Acinetobacter 0.262 0.214 0.277 Microbacterium 0.093 0.065 0.058 Vibrio 0.086 0.081 0.130 Bacillus 0.081 0.083 0.082 Rhizobium 0.064 0.065 0.171 Comamonas 0.045 0.044 0.028 Erythrobacter 0.019 0.022 0.050 硝酸细菌 Nitrospira 0.126 0.132 0.118 硫氧化细菌 Acidiphilium 0.059 0.049 0.017 Sphingomonas 0.004 0.006 0.011 Beggiatoa 0.001 0.008 0.029 | Show TableDownLoad:
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在本研究中，基于通用引物未能检出硫酸盐还原菌，说明硫酸盐还原菌在管道生物膜内丰度很低，这可能是由于2个原因：其一，灰水中不含人类粪便，生活污水中的硫酸盐还原菌主要源自人类粪便[23]，本研究采用的灰水引入的硫酸盐还原菌数量较少；其二，在硫酸盐还原菌适宜生长在厌氧环境中，而本研究是好氧管道系统，环境条件不利于硫酸盐还原菌的生长。小管径重力流灰水管道生物膜中存在大量的反硝化菌和一定量的硝化细菌，而在生物膜中的硫酸盐还原菌没有达到检出水平，表明小管径重力流灰水管道具有一定的生物脱氮功能并且H2S积累的风险很低。输送生活污水的小管径重力流管道普遍存在的H2S积累问题，在小管径重力流灰水管道中可以忽略，这一现象有利于小管径灰水管道的安全应用和大范围推广。
2.4 氮循环功能基因分布特征
基于2.3节中功能细菌的分析结果，小管径重力流灰水管道生物膜中S循环过程(特别是H2S产生过程)基本可以忽略，而反硝化菌广泛存在于自然界中，其属水平的分类尚不完全，并且已确认的反硝化菌属中并非所有的菌种都具备反硝化功能[24]，须从功能基因的角度进行深入分析，因此，本章节探讨氮循环功能基因在不同坡度管道下的分布特征。硝化功能基因的PICRUSt预测丰度如图9所示。由于灰水管道生物膜中基本不含亚硝化细菌，因此，氨单加氧酶基因amoABC以及羟胺氧化酶基因hao基本没有预测丰度，而灰水管道生物膜中一定丰度的硝化细菌携带的亚硝酸盐氧化酶基因nxrA和nxrB预测丰度很高，这明确了灰水管道生物膜中硝化作用的存在。随着管道坡度的增大，亚硝酸盐氧化酶基因nxrA和nxrB的丰度均显著增大，管道生物膜的硝化作用增强，说明大坡度的管道有利于灰水氨氮的去除。反硝化功能基因的PICRUSt预测丰度如图10所示。硝酸盐还原酶基因narGHI和napAB、亚硝酸盐还原酶基因nirK、一氧化氮还原酶基因norBC以及氧化亚氮还原酶基因nosZ在生物膜中均能大量预测到，这说明虽然本研究的灰水管道处于好氧运行状态，但其管道生物膜上仍然可以发生完整的反硝化过程。另外，nosZ的丰度显著小于其他反硝化基因，说明在灰水管道生物膜上发生的反硝化过程主要的终产物是N2O，这与好氧反硝化的终产物相吻合，同时结合管道的好氧状态，可以确定小管径灰水管道生物膜主要发生好氧反硝化过程。在15‰坡度下，灰水管道生物膜的反硝化功能基因总数显著高于另外2个坡度，表明大坡度的管道敷设方案可以加强灰水在管道内的反硝化过程，有利于灰水的生物脱氮过程。综合硝化功能基因和反硝化功能基因的预测结果，采用大坡度(15‰)的灰水管道敷设方案有利于促进灰水在管道输送过程中的生物脱氮作用。根据农村地区的污水管网敷设工程经验，15‰的管道敷设坡度在很多农村地区都具有实际应用的可行性，因此，对于小管径重力流灰水管道，在地质条件和经济条件允许的情况下，应尽量采用大坡度(15‰)的管道敷设方案。
3. 结论
1)小管径重力流灰水管道生物膜中存在大量的细菌、真菌乃至原生动物。其中细菌主要以Proteobacteria (变形菌门)、Actinobacteria (放线菌门)和Bacteroidetes (拟杆菌门)为主，优势菌属为Paenarthrobacte、Ensifer (剑菌属)和Spingopyxis。管道坡度的变化会显著影响灰水管道生物膜细菌群落组成。
2)管道功能菌主要以反硝化细菌、硝酸细菌和硫氧化细菌为主。基于通用引物的Illumina HiSeq高通量测序没有检出属水平的亚硝酸细菌和硫酸盐还原细菌。小管径重力流灰水管道具有生物脱氮潜力，H2S积累风险低，有利于其推广应用。
3)灰水管道生物膜中具有完整的反硝化过程功能基因，反硝化过程以好氧过程为主。亚硝化过程功能基因缺失，硝化过程功能基因丰富。大坡度(15‰)的灰水管道敷设方案可以提高氮循环相关功能基因丰度，有利于促进灰水在管道输送过程中的生物脱氮作用，在条件允许的地区，应优先采用大坡度(15‰)的灰水管道设计方案。
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图 1 地下渗滤系统模拟装置和分层气体采样器
Figure 1. Simulator of subsurface wastewater infiltration system and gas sample collector
图 2 不同曝气处理下渗透系数随时间的变化
Figure 2. Change of permeability coefficient with time at different aeration
图 3 不同曝气处理下体积含水率随时间的变化
Figure 3. Change of volumetric water content with time at different aeration
图 4 不同曝气处理下CO2、CH4和N2O浓度随时间的变化
Figure 4. Change of CO2, CH4 and N2O concentrations with time at different aeration
图 5 不同曝气处理下出水
NH+4-N 、NO−3-N 、NO−2-N 、COD和TP去除率随时间的变化Figure 5. Change in
NH+4-N ,NO−3-N ,NO−2-N , COD and TP removal with time at different aeration表 1 曝气量与渗透系数的相关分析
Table 1. Correlation analysis of aeration andpermeability coefficient
深度/cm 相关系数 P −130~−100 0.536 0 −100~−70 −0.887 0 −70~−40 0.071 0.413 −40~−10 0.951 0
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表 2 曝气量与体积含水率的相关分析
Table 2. Correlation analysis of aeration andvolume water content
深度/cm 相关系数 P −100 −0.745 0 −70 0.629 0 −40 −0.747 0 −10 0.082 0.347
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表 3 曝气量与气体浓度的相关分析
Table 3. Correlation analysis of aerationand gas concentrations
深度/cm CO2浓度 CH4浓度 N2O浓度 相关系数 P 相关系数 P 相关系数 P −130 0.572 0 −0.235 0.174 0.489 0.003 −100 0.578 0 0.12 0.492 0.511 0.002 −70 0.624 0 0.261 0.131 0.555 0.001 −40 0.628 0 0.185 0.287 0.572 0 −10 0.576 0 0.171 0.327 0.473 0.004
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表 4 曝气量与污染物去除率的相关分析
Table 4. Correlation analysis of aeration andpollutants removal
污染物 相关系数 P NH+4 -N![](data:image/svg+xml,<svg xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' width='350' height='600'><foreignObject width='2000' height='100%'><div xmlns='http://www.w3.org/1999/xhtml' style='font-size:16px;'><table>
<thead> <tr> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle">污染物</td> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle">相关系数</td> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle"><i>P</i></td> </tr></thead>
<tbody> <tr> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}$<img class="inline-formula" src="data:image/svg+xml,<svg xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' width='350' height='600'><foreignObject width='2000' height='100%'><div xmlns='http://www.w3.org/1999/xhtml' style='font-size:16px;'><table>
<thead> <tr> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle">污染物</td> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle">相关系数</td> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle"><i>P</i></td> </tr></thead>
<tbody> <tr> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M41.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M41.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">0.854</td> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">0</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M42.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M42.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td align="center" valign="middle">−0.384</td> <td align="center" valign="middle">0.094</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M43.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M43.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td align="center" valign="middle">0.095</td> <td align="center" valign="middle">0.689</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle">COD</td> <td align="center" valign="middle">0.88</td> <td align="center" valign="middle">0</td> </tr> <tr> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">TP</td> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">0.414</td> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">0.07</td> </tr></tbody>
</table></div></foreignObject></svg>"></inline-formula>-N</td> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">0.854</td> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">0</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$<img class="inline-formula" src="data:image/svg+xml,<svg xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' width='350' height='600'><foreignObject width='2000' height='100%'><div xmlns='http://www.w3.org/1999/xhtml' style='font-size:16px;'><table>
<thead> <tr> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle">污染物</td> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle">相关系数</td> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle"><i>P</i></td> </tr></thead>
<tbody> <tr> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M41.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M41.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">0.854</td> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">0</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M42.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M42.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td align="center" valign="middle">−0.384</td> <td align="center" valign="middle">0.094</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M43.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M43.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td align="center" valign="middle">0.095</td> <td align="center" valign="middle">0.689</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle">COD</td> <td align="center" valign="middle">0.88</td> <td align="center" valign="middle">0</td> </tr> <tr> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">TP</td> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">0.414</td> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">0.07</td> </tr></tbody>
</table></div></foreignObject></svg>"></inline-formula>-N</td> <td align="center" valign="middle">−0.384</td> <td align="center" valign="middle">0.094</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$<img class="inline-formula" src="data:image/svg+xml,<svg xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' width='350' height='600'><foreignObject width='2000' height='100%'><div xmlns='http://www.w3.org/1999/xhtml' style='font-size:16px;'><table>
<thead> <tr> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle">污染物</td> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle">相关系数</td> <td class="table_top_border" align="center" valign="middle"><i>P</i></td> </tr></thead>
<tbody> <tr> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NH}}_{\rm{4}}^{\rm{ + }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M41.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M41.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">0.854</td> <td class="table_top_border2" align="center" valign="middle">0</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NO}}_{\rm{3}}^{\rm{ - }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M42.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M42.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td align="center" valign="middle">−0.384</td> <td align="center" valign="middle">0.094</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle"><inline-formula>$ {\rm{NO}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$<alternatives><img class="graphic" src="201811115_M43.jpg"><img class="graphic" src="201811115_M43.png"></alternatives></inline-formula>-N</td> <td align="center" valign="middle">0.095</td> <td align="center" valign="middle">0.689</td> </tr> <tr> <td align="center" valign="middle">COD</td> <td align="center" valign="middle">0.88</td> <td align="center" valign="middle">0</td> </tr> <tr> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">TP</td> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">0.414</td> <td class="table_bottom_border" align="center" valign="middle">0.07</td> </tr></tbody>
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0.854 0 NO−3 -N−0.384 0.094 NO−2 -N0.095 0.689 COD 0.88 0 TP 0.414 0.07
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