无机碳在厌氧氨氧化系统中的迁移转化

韦愿; 王华琴; 王敦球

doi:10.12030/j.cjee.201809020

无机碳在厌氧氨氧化系统中的迁移转化

1.
桂林理工大学，广西环境污染控制理论与技术重点实验室，桂林 541004
2.
桂林理工大学，广西岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，桂林 541004
基金项目:
国家自然科学基金资助项目51668013，51638006

广西科技计划项目资助桂科AD18126018

桂林市科学研究与技术开发计划项目2016012303

广西矿冶与环境科学实验中心KH2012ZD004

广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划项目002401013001国家自然科学基金资助项目(51668013，51638006)

“八桂学者”建设工程专项经费

广西科技计划项目资助(桂科AD18126018)

桂林市科学研究与技术开发计划项目(2016012303)

广西矿冶与环境科学实验中心(KH2012ZD004)

广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划项目(002401013001)

Migration and transformation of inorganic carbon in the Anammox system

1.
Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theory and Technology, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China
2.
Guangxi Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China
Fund Project:

摘要: 基于厌氧氨氧化(Anammox)反应，采用13C同位素示踪法分析无机碳(IC)在工艺中的迁移转化路径，考查厌氧氨氧化工艺的固碳潜力及厌氧氨氧化菌相关的固碳机理；同时，结合微生物分子学等方法，通过比较反应前后NH4+-N、NO2--N、TN及IC的变化，分析推导出工艺的固碳机理。结果表明，在进水IC为10.70 mg左右时，系统平均固碳率在12.05%以上；经13C标记处理后的Anammox污泥中13C丰度值由1.07%增加至1.17%以上；Anammox污泥中cbbLR1基因拷贝数经氮素和IC影响后分别为5.79×108 copies·g-1和5.56×108 copies·g-1，较处理前均有所增加，但变化不明显。进水中投加的IC参与了微生物体内的碳代谢；厌氧氨氧化菌存在遵循卡尔文循环固碳途径的功能基因。cbbLR1基因丰度与氮素浓度之间呈显著相关，与IC浓度之间的相关性不明显，说明该基因丰度对氮素的响应度比IC大。
- 厌氧氨氧化 /
- 碳迁移 /
- 13C同位素丰度 /
- 基因丰度检测
Abstract: In this study, the migration and transformation path of inorganic carbon (IC) in Anammox process was identified using the 13C isotope tracer method, and the carbon sequestration potential of Anammox process and the carbon sequestration mechanism of Anammox bacteria were discussed. At the same time, in combination with the microbial molecular methods, the carbon sequestration mechanism of the process was disclosed through comparison of the changes of NH4+-N, NO2--N, TN and IC before and after the reaction. The experimental results showed that the average carbon sequestration rate of the system was above 12.05% when the influent IC was about 10.70 mg. The 13C abundance value of the anaerobic ammonium oxide sludge after 13C labeling treatment increased from 1.07% to over 1.17%. Under the influence of nitrogen and IC, the copy numbers of cbbLR1 gene in Anammox sludge were 5.79×108 copies·g-1 and 5.56×108 copies·g-1 dry sludge, respectively, both of them increased than before treatment, while this change was insignificant. IC added to the influent water participates in the carbon metabolism in the microorganism. Anammox bacteria have some functional genes that follow the Calvin cycle carbon sequestration pathway. The abundance of cbbLR1 gene showed a significant correlation with nitrogen concentration, while an insignificant correlation with IC concentration, indicating that the gene abundance was more responsive to nitrogen than to IC.
- Anammox /
- carbon migration /
- 13C isotopic abundance /
- gene abundance detection
- 1 材料与方法
- 1.1 实验装置
  本实验采用的反应装置类似于序批式反应器，反应装置如图1所示。反应器由有机玻璃制作而成，容积为0.5 L，顶部设有进水口、集气口、pH在线检测口和pH调节口，侧面设有具塞出水口。
  图1 厌氧氨氧化反应装置图
  Fig.1 Schematic diagram of Anammox reaction device
- 1.2 实验条件及运行方法
  实验进水为人工模拟废水，各组分的设计浓度分别为NH4+-N 100 mg·L^-1、 NO2--N 125 mg·L^-1、HCO3- 0.25 g·L^-1、CaCl₂·2H₂O 113.5 mg·L^-1、MgSO₄·7H₂O 100 mg·L^-1、微生物促进剂 1 mL·L^-1、NaS₂O₃ 0.02 g·L^-1。其中，NH4+-N、NO2--N和HCO₃^-分别由(NH₄)₂SO₄、NaNO₂和NaHCO₃提供。进水pH采用0.5 mol·L^-1 NaOH溶液和0.4 mol·L^-1 H₂SO₄酸液来调节。实验测定的NH4+-N、NO2--N、TN和IC参考文献中的方法^[19]、N-(1-奈基)-乙二胺光度法、碱性过硫酸钾消解及紫外光度法和总有机碳分析法；pH和温度采用PHS-3C酸度计测定；DO采用JENCCO MODEL 6010 DO仪测定。
  本实验接种污泥取自实验室已培养1年^[20]的污泥，如图2所示，其主要功能菌为Kuenenia stuttgartiensis、uncultured bacterium clone KIST-JJY001等。接种污泥接种体积约为反应装置有效容积的20%。反应装置经水浴加热将温度维持在(32±1) ℃、pH在7.4~7.7之间、DO≤0.1 mg·L^-1、HRT为1.5 d，避光运行，防止光线对细菌的不利影响^[21]。
  图2 接种污泥
  Fig. 2 Inoculated sludge
  实验装置采用BLK、A、B、C等4组。其中，A、B、C为采用¹³C同位素标记的NaHCO₃，作为进水IC源的3组平行反应装置；BLK为采用普通NaHCO₃作为进水IC源的反应装置。实验每个周期重新更换进水且密封收集气体。在每次换水时取进出水样和收集气体样品，并测定其NH4+-N、NO2--N、TN、IC和气体中的CO₂。
- 1.3 CO₂气体分析
  CO₂气体采用气相色谱仪(上海精科GC112A型)测定，使用的是N(VI)2000色谱数据工作站(浙江大学智能信息研究所研发)，CO₂标准气体(上海神开气体有限公司生产)的浓度为4.92%，平衡气体为氩气。
  仪器完成启动进入测试阶段后，分别抽取1 mL的CO₂标准气体和1 mL的气体样品测定CO₂的峰面积。通过式(1)计算样品中CO₂的含量。每个气体样品至少测3次，取平均值。
  Cy=Cb·AyAb
  (1)
  式中：C_y为气体样品CO₂的含量，mL；A_y为气体样品CO₂的峰面积，μV·s^-1；C_b为标准气体CO₂的含量，mL；A_b为标准气体CO₂的峰面积，μV·s^-1。
- 1.4 ¹³C丰度检测
  反应器稳定运行3个周期后进行C的同位素标定实验。A、B、C 3组污泥样品的¹³C同位素丰度采用稳定性同位素质谱仪(stable isotope mass spectrometer)分析测定；测得污泥样品的C同位素值¹³C(Vienna PDB, VPDB)根据式(2)计算得到样品¹³C丰度。
  F=(δC·R+1000R)/(δC·R+1000R+1000)×100%
  (2)
  式中：F表示¹³C同位素丰度，%；R表示VPDB标样中¹³C/¹²C，取值0.011 237 2；δC为测定的碳同位素值(VPDB)。
- 1.5 DNA提取与荧光定量PCR检测
  取初始污泥及每种基质反应结束时的污泥样品，采用MOBIO公司的DNA快速提取试剂盒(PowerSoil DNA isolation kit)，按照操作步骤提取污泥中微生物的总DNA；采用微量紫外分光光度计(型号Q5000)对提取的DNA浓度和纯度进行检测。
- 2 结果与讨论
- 2.1 脱氮性能、CO₂释放量和平均固碳率表现
  图3显示了BLK、A、B、C共4组实验进出水中的NO2--N、NH4+-N和TN的浓度和去除率。由于厌氧氨氧化细菌是从实验室反应器取出来加入4组实验装置的，属于直接接种污泥，其活性较高，NO2--N、NH4+-N及TN的去除效果都比较好。其中，NO2--N的进水浓度为125 mg·L^-1左右，去除率为98%以上；NH4+-N进水浓度为100 mg·L^-1左右，去除率为97%以上；TN进水浓度为226 mg·L^-1左右，去除率为86%以上。实验中参与反应的NH4+-N和NO2--N的物质的量之比为1∶1.27左右，说明厌氧氨氧化细菌接种到新的实验装置中后依然保持着较高的活性，实验装置运行稳定，这为研究IC在Anammox系统中的迁移转化提供了实验基础。
  图3 进出水NO2--N、NH4+-N和TN的浓度和去除率
  Fig. 3 Concentration of NH4+-N，NO2--N and TN in influent and effluent and their removal rates
  图4表示4组实验装置中进出水IC量与CO₂产生量及平均固碳率的关系。其中进水IC量为10.70 mg左右，CO₂产生量为0.53~0.60 mL，平均固碳率在12.05%~12.43%，CO₂产生量和平均固碳率都非常接近，无明显波动。实验装置进水中投加的IC很小部分分解为CO₂逸出，使装置中气相和液相中的CO₂浓度保持相对平衡；一部分IC作为碳源参与Anammox反应被厌氧氨氧化菌消耗；大部分在水中保持IC的形式。进水中的IC为Anammox反应提供碳源并调节水中的pH，适量浓度的IC可以促进Anammox反应进行，但当IC浓度过高时Anammox反应反而会被抑制^[9,22]。
  图4 进出水无机碳量、CO₂产生量和平均固碳率
  Fig. 4 Inorganic carbon, CO₂ production and average carbon sequestration rate of influent and effluent
- 2.2 ¹³C丰度测定结果
  如表1所示，采用¹³C同位素标记的NaHCO₃作为进水IC源的3组污泥平行样品(A、B、C)，做¹³C丰度检测。与空白样(BLK)对比，¹³C(VPDB)值都有明显增加，¹³C丰度由1.071%增加至1.176%以上；且3组污泥平行样¹³C丰度测定结果重现性较好。这说明投加的IC源在Anammox污泥的微生物体内被有效代谢；同时说明Anammox污泥中存在某种固碳途径的基因。
  表1 样品¹³C同位素值及丰度
  Table 1 ¹³C isotope value and abundance of samples
  样品编号 C丰度/% δ_C/‰ ¹³C丰度/%
  BLK 32.53 -36.86 1.071
  A 36.81 65.35 1.183
  B 37.49 74.66 1.193
  C 36.47 58.77 1.176
- 2.3 DNA检测与荧光定量PCR检测
  实验DNA浓度和纯度的检测结果见表2。表2中Y₀为厌氧氨氧化初始污泥样品；Y₁、Y₂分别为Anammox污泥在氮素和IC影响后的样品；A₂₆₀和A₂₈₀分别代表核酸、蛋白质和酚类物质的最高吸收峰的吸光度。如表2所示，所有的A₂₆₀/A₂₈₀比值均在1.7左右，这说明提取的样品DNA纯度良好，能够满足后续PCR实验要求。
  表2 部分样品核酸检测结果
  Table 2 Nucleic acid test results of partial samples
  样品编号 A₂₆₀ A₂₈₀ A₂₆₀/A₂₈₀ 核酸浓度/(ng·μL^-1)
  Y₀ 0.303 0.163 1.86 15.1
  Y₁ 0.244 0.141 1.73 12.2
  Y₂ 0.392 0.237 1.65 19.6
  本实验采用实时荧光定量检测cbbLR1功能基因的拷贝数，采用25 μL反应体系。实验中首先进行普通PCR扩增实验，经过普通琼脂糖凝胶电泳鉴定普通PCR扩增产物，确定最佳退火温度，最后进行荧光定量PCR检测。
  cbbLR1基因的琼脂糖检测结果如图5所示，图5中Y₁~Y₈为Anammox污泥样品，MK为标准参照条带位置，CK为阴性对照。图5中阴性对照CK泳道未出现条带和拖带现象；Y₄~Y₈泳道中在750~1 000 bp之间出现亮带，推测该亮带即长度为820 bp的目的条带，这说明Anammox污泥样品中存在固碳功能基因cbbLR1。这是因为，该基因所含的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)和5-磷酸核酮糖激酶是微生物固碳途径中卡尔文循环途径的2个关键酶，这说明厌氧氨氧化菌在生长过程中存在卡尔文循环固碳途径。
  图5 cbbLR1基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
  Fig. 5 Agarose gel electrophoresis map of PCR product of cbbLR1
  图5中Y₁~Y₃泳道中未出现条带，可能是由于3个泳道对应的退火温度过高，导致PCR扩增失败；Y₇~Y₈泳道中拖带现象较严重，Y₄~Y₅泳道中条带稍淡。因此，相比之下，Y₆泳道中的条带明亮且拖带现象较微弱，这说明该泳道对应的退火温度较为适宜，即最佳退火温度为56.9 ℃。
  表3为cbbLR1基因的平均丰度值。由于Anammox污泥样品的cbbLR1功能基因拷贝数的检测结果比较稳定，故采用均值法对检测结果进行描述性统计。在氮素和IC的影响下，与对照组相比，cbbLR1基因拷贝数均有所增加，且污泥中基因拷贝数在氮素影响下的变化范围比在IC影响下的变化范围要大，这或许与厌氧氨氧化菌在生命代谢过程中对氮素的需求大于对IC的需求有关。
  表3 不同基质反应后cbbLR1基因定量分析
  Table 3 Quantitative analysis of cbbLR1 by matrix reactions
  基质种类基因拷贝数/(copies·g^-1)
  处理前污泥 5.49×10⁸
  氮素 5.79×10⁸
  IC 5.56×10⁸
  表4为cbbLR1基因丰度与基质因子之间的线性关系，显著性水平设置为0.05。从表4可以看出，Anammox污泥中cbbLR1基因丰度与氮素浓度之间呈显著相关，与IC浓度之间的相关性不明显，说明cbbLR1基因丰度对氮素的响应度比IC大。尽管cbbLR1基因丰度对IC的响应度低于氮素，但cbbLR1基因丰度与IC浓存在相关性，说明IC对于Anammox系统的脱氮效果和对厌氧氨氧化菌的生长和繁殖有着重要的影响。
  表4 cbbLR1基因丰度与基质因子之间的线性关系
  Table 4 Linear relationship between cbbLR1 abundance and matrix factors
  基因氮素 IC
  cbbLR1
  0.966
  0.034
  0.732
  0.268
  cbbLR1
- 3 结论
  1) 在反应器稳定运行情况下，当进水IC为10.70 mg左右时，系统平均固碳率在12.05%以上，IC在系统中被部分消耗。经¹³C标记处理后的Anammox污泥中，¹³C丰度值由1.07%增加至1.17%以上，说明Anammox污泥中存在某种固碳途径的基因。经普通琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定该基因为cbbLR1基因，说明厌氧氨氧化菌存在卡尔文循环固碳途径。
  2) Anammox污泥中cbbLR1基因拷贝数经氮素和IC影响后分别为5.79×10⁸ copies·g^-1和5.56×10⁸ copies·g^-1，较处理前均有所增加。厌氧氨氧化菌中cbbLR1基因丰度对氮素的响应度比对IC的响应度要大，且与氮素浓度之间呈现显著相关性，与IC之间的相关性不显著。
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摘要

基于厌氧氨氧化(Anammox)反应，采用¹³C同位素示踪法分析无机碳(IC)在工艺中的迁移转化路径，考查厌氧氨氧化工艺的固碳潜力及厌氧氨氧化菌相关的固碳机理；同时，结合微生物分子学等方法，通过比较反应前后NH₄⁺-N、NO2--N、TN及IC的变化，分析推导出工艺的固碳机理。结果表明，在进水IC为10.70 mg左右时，系统平均固碳率在12.05%以上；经¹³C标记处理后的Anammox污泥中¹³C丰度值由1.07%增加至1.17%以上；Anammox污泥中cbbLR1基因拷贝数经氮素和IC影响后分别为5.79×10⁸ copies·g^-1和5.56×10⁸ copies·g^-1，较处理前均有所增加，但变化不明显。进水中投加的IC参与了微生物体内的碳代谢；厌氧氨氧化菌存在遵循卡尔文循环固碳途径的功能基因。cbbLR1基因丰度与氮素浓度之间呈显著相关，与IC浓度之间的相关性不明显，说明该基因丰度对氮素的响应度比IC大。

Abstract

In this study, the migration and transformation path of inorganic carbon (IC) in Anammox process was identified using the ¹³C isotope tracer method, and the carbon sequestration potential of Anammox process and the carbon sequestration mechanism of Anammox bacteria were discussed. At the same time, in combination with the microbial molecular methods, the carbon sequestration mechanism of the process was disclosed through comparison of the changes of NH4+-N, NO2--N, TN and IC before and after the reaction. The experimental results showed that the average carbon sequestration rate of the system was above 12.05% when the influent IC was about 10.70 mg. The ¹³C abundance value of the anaerobic ammonium oxide sludge after ¹³C labeling treatment increased from 1.07% to over 1.17%. Under the influence of nitrogen and IC, the copy numbers of cbbLR1 gene in Anammox sludge were 5.79×10⁸ copies·g^-1 and 5.56×10⁸ copies·g^-1 dry sludge, respectively, both of them increased than before treatment, while this change was insignificant. IC added to the influent water participates in the carbon metabolism in the microorganism. Anammox bacteria have some functional genes that follow the Calvin cycle carbon sequestration pathway. The abundance of cbbLR1 gene showed a significant correlation with nitrogen concentration, while an insignificant correlation with IC concentration, indicating that the gene abundance was more responsive to nitrogen than to IC.

关键词

厌氧氨氧化；碳迁移；¹³C同位素丰度；基因丰度检测

Keywords

Anammox; carbon migration; ¹³C isotopic abundance; gene abundance detection

厌氧氨氧化(Anammox)是指在厌氧或缺氧条件下，微生物直接以亚硝酸盐为电子受体，将氨和亚硝酸盐转化成氮气的生物氧化过程^[1,2]。相比传统的脱氮工艺，厌氧氨氧化具有需氧量少、无须添加外加有机碳源以及运行费用低等优点^[3,4,5]。厌氧氨氧化菌为化能自养型细菌，主要以CO₂和HCO3-等无机碳(IC)作为新陈代谢的碳源，并从氮素的生物反应中获得能量。丁敏等^[6]研究发现，HCO3-浓度对Anammox反应的脱氮效率存在影响，其表现为提供充足碳源和调节反应器pH的综合作用。朱彤等^[7]研究发现，当进水中不投加IC时，Anammox反应脱氮效能明显下降，当进水IC和总无机氮(TIN)的比值在0.2~0.4时，脱氮效能得到恢复并明显提高，表明厌氧氨氧化过程中，IC主要提供碳源并充当反应催化剂。因此，IC对厌氧氨氧化菌的生长和活性维持有重要的影响^[6]。另外，Anammox工艺的低碳排放特征有助于污水处理厂实现“碳中和”^[8,9,10]，如能够充分利用该工艺的固碳能力，污水处理厂将有望成为“固碳工厂”。

随着微生物分子学技术的快速发展和固碳功能基因数据库的不断完备，国内外学者开始对不同生态系统中的固碳微生物群落多样性和数量特征运用分子生物学技术进行相关的研究^[11,12,13]。迄今为止，已发现了5条CO₂固定途径，即Calvin循环、还原性三羧酸循环途径、厌氧乙酰辅酶A途径、3-羟基丙酸途径和琥珀酰辅酶A途径^{[14,15,16,17,18]}。

本研究对Anammox污泥进行模拟实验研究，采用¹³C同位素示踪法对进水中IC进行标记，利用稳定同位素质谱仪检测污泥中¹³C同位素丰度；并结合微生物分子学技术，以cbbLR1编码基为指示基因，采用普通PCR和实时荧光定量PCR技术对厌氧氨氧化菌的DNA进行分子学分析，从而探究Anammox反应的固碳路径。本研究可为开发高固碳能力的厌氧氨氧化工艺的实践提供借鉴。

1 材料与方法
1.1 实验装置
本实验采用的反应装置类似于序批式反应器，反应装置如图1所示。反应器由有机玻璃制作而成，容积为0.5 L，顶部设有进水口、集气口、pH在线检测口和pH调节口，侧面设有具塞出水口。
图1 厌氧氨氧化反应装置图
Fig.1 Schematic diagram of Anammox reaction device
1.2 实验条件及运行方法
实验进水为人工模拟废水，各组分的设计浓度分别为NH4+-N 100 mg·L^-1、 NO2--N 125 mg·L^-1、HCO3- 0.25 g·L^-1、CaCl₂·2H₂O 113.5 mg·L^-1、MgSO₄·7H₂O 100 mg·L^-1、微生物促进剂 1 mL·L^-1、NaS₂O₃ 0.02 g·L^-1。其中，NH4+-N、NO2--N和HCO₃^-分别由(NH₄)₂SO₄、NaNO₂和NaHCO₃提供。进水pH采用0.5 mol·L^-1 NaOH溶液和0.4 mol·L^-1 H₂SO₄酸液来调节。实验测定的NH4+-N、NO2--N、TN和IC参考文献中的方法^[19]、N-(1-奈基)-乙二胺光度法、碱性过硫酸钾消解及紫外光度法和总有机碳分析法；pH和温度采用PHS-3C酸度计测定；DO采用JENCCO MODEL 6010 DO仪测定。
本实验接种污泥取自实验室已培养1年^[20]的污泥，如图2所示，其主要功能菌为Kuenenia stuttgartiensis、uncultured bacterium clone KIST-JJY001等。接种污泥接种体积约为反应装置有效容积的20%。反应装置经水浴加热将温度维持在(32±1) ℃、pH在7.4~7.7之间、DO≤0.1 mg·L^-1、HRT为1.5 d，避光运行，防止光线对细菌的不利影响^[21]。
图2 接种污泥
Fig. 2 Inoculated sludge
实验装置采用BLK、A、B、C等4组。其中，A、B、C为采用¹³C同位素标记的NaHCO₃，作为进水IC源的3组平行反应装置；BLK为采用普通NaHCO₃作为进水IC源的反应装置。实验每个周期重新更换进水且密封收集气体。在每次换水时取进出水样和收集气体样品，并测定其NH4+-N、NO2--N、TN、IC和气体中的CO₂。
1.3 CO₂气体分析
CO₂气体采用气相色谱仪(上海精科GC112A型)测定，使用的是N(VI)2000色谱数据工作站(浙江大学智能信息研究所研发)，CO₂标准气体(上海神开气体有限公司生产)的浓度为4.92%，平衡气体为氩气。
仪器完成启动进入测试阶段后，分别抽取1 mL的CO₂标准气体和1 mL的气体样品测定CO₂的峰面积。通过式(1)计算样品中CO₂的含量。每个气体样品至少测3次，取平均值。
Cy=Cb·AyAb
(1)
式中：C_y为气体样品CO₂的含量，mL；A_y为气体样品CO₂的峰面积，μV·s^-1；C_b为标准气体CO₂的含量，mL；A_b为标准气体CO₂的峰面积，μV·s^-1。
1.4 ¹³C丰度检测
反应器稳定运行3个周期后进行C的同位素标定实验。A、B、C 3组污泥样品的¹³C同位素丰度采用稳定性同位素质谱仪(stable isotope mass spectrometer)分析测定；测得污泥样品的C同位素值¹³C(Vienna PDB, VPDB)根据式(2)计算得到样品¹³C丰度。
F=(δC·R+1000R)/(δC·R+1000R+1000)×100%
(2)
式中：F表示¹³C同位素丰度，%；R表示VPDB标样中¹³C/¹²C，取值0.011 237 2；δC为测定的碳同位素值(VPDB)。
1.5 DNA提取与荧光定量PCR检测
取初始污泥及每种基质反应结束时的污泥样品，采用MOBIO公司的DNA快速提取试剂盒(PowerSoil DNA isolation kit)，按照操作步骤提取污泥中微生物的总DNA；采用微量紫外分光光度计(型号Q5000)对提取的DNA浓度和纯度进行检测。
2 结果与讨论
2.1 脱氮性能、CO₂释放量和平均固碳率表现
图3显示了BLK、A、B、C共4组实验进出水中的NO2--N、NH4+-N和TN的浓度和去除率。由于厌氧氨氧化细菌是从实验室反应器取出来加入4组实验装置的，属于直接接种污泥，其活性较高，NO2--N、NH4+-N及TN的去除效果都比较好。其中，NO2--N的进水浓度为125 mg·L^-1左右，去除率为98%以上；NH4+-N进水浓度为100 mg·L^-1左右，去除率为97%以上；TN进水浓度为226 mg·L^-1左右，去除率为86%以上。实验中参与反应的NH4+-N和NO2--N的物质的量之比为1∶1.27左右，说明厌氧氨氧化细菌接种到新的实验装置中后依然保持着较高的活性，实验装置运行稳定，这为研究IC在Anammox系统中的迁移转化提供了实验基础。
图3 进出水NO2--N、NH4+-N和TN的浓度和去除率
Fig. 3 Concentration of NH4+-N，NO2--N and TN in influent and effluent and their removal rates
图4表示4组实验装置中进出水IC量与CO₂产生量及平均固碳率的关系。其中进水IC量为10.70 mg左右，CO₂产生量为0.53~0.60 mL，平均固碳率在12.05%~12.43%，CO₂产生量和平均固碳率都非常接近，无明显波动。实验装置进水中投加的IC很小部分分解为CO₂逸出，使装置中气相和液相中的CO₂浓度保持相对平衡；一部分IC作为碳源参与Anammox反应被厌氧氨氧化菌消耗；大部分在水中保持IC的形式。进水中的IC为Anammox反应提供碳源并调节水中的pH，适量浓度的IC可以促进Anammox反应进行，但当IC浓度过高时Anammox反应反而会被抑制^[9,22]。
图4 进出水无机碳量、CO₂产生量和平均固碳率
Fig. 4 Inorganic carbon, CO₂ production and average carbon sequestration rate of influent and effluent
2.2 ¹³C丰度测定结果
如表1所示，采用¹³C同位素标记的NaHCO₃作为进水IC源的3组污泥平行样品(A、B、C)，做¹³C丰度检测。与空白样(BLK)对比，¹³C(VPDB)值都有明显增加，¹³C丰度由1.071%增加至1.176%以上；且3组污泥平行样¹³C丰度测定结果重现性较好。这说明投加的IC源在Anammox污泥的微生物体内被有效代谢；同时说明Anammox污泥中存在某种固碳途径的基因。
表1 样品¹³C同位素值及丰度
Table 1 ¹³C isotope value and abundance of samples
样品编号 C丰度/% δ_C/‰ ¹³C丰度/%
BLK 32.53 -36.86 1.071
A 36.81 65.35 1.183
B 37.49 74.66 1.193
C 36.47 58.77 1.176
2.3 DNA检测与荧光定量PCR检测
实验DNA浓度和纯度的检测结果见表2。表2中Y₀为厌氧氨氧化初始污泥样品；Y₁、Y₂分别为Anammox污泥在氮素和IC影响后的样品；A₂₆₀和A₂₈₀分别代表核酸、蛋白质和酚类物质的最高吸收峰的吸光度。如表2所示，所有的A₂₆₀/A₂₈₀比值均在1.7左右，这说明提取的样品DNA纯度良好，能够满足后续PCR实验要求。
表2 部分样品核酸检测结果
Table 2 Nucleic acid test results of partial samples
样品编号 A₂₆₀ A₂₈₀ A₂₆₀/A₂₈₀ 核酸浓度/(ng·μL^-1)
Y₀ 0.303 0.163 1.86 15.1
Y₁ 0.244 0.141 1.73 12.2
Y₂ 0.392 0.237 1.65 19.6
本实验采用实时荧光定量检测cbbLR1功能基因的拷贝数，采用25 μL反应体系。实验中首先进行普通PCR扩增实验，经过普通琼脂糖凝胶电泳鉴定普通PCR扩增产物，确定最佳退火温度，最后进行荧光定量PCR检测。
cbbLR1基因的琼脂糖检测结果如图5所示，图5中Y₁~Y₈为Anammox污泥样品，MK为标准参照条带位置，CK为阴性对照。图5中阴性对照CK泳道未出现条带和拖带现象；Y₄~Y₈泳道中在750~1 000 bp之间出现亮带，推测该亮带即长度为820 bp的目的条带，这说明Anammox污泥样品中存在固碳功能基因cbbLR1。这是因为，该基因所含的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)和5-磷酸核酮糖激酶是微生物固碳途径中卡尔文循环途径的2个关键酶，这说明厌氧氨氧化菌在生长过程中存在卡尔文循环固碳途径。
图5 cbbLR1基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 5 Agarose gel electrophoresis map of PCR product of cbbLR1
图5中Y₁~Y₃泳道中未出现条带，可能是由于3个泳道对应的退火温度过高，导致PCR扩增失败；Y₇~Y₈泳道中拖带现象较严重，Y₄~Y₅泳道中条带稍淡。因此，相比之下，Y₆泳道中的条带明亮且拖带现象较微弱，这说明该泳道对应的退火温度较为适宜，即最佳退火温度为56.9 ℃。
表3为cbbLR1基因的平均丰度值。由于Anammox污泥样品的cbbLR1功能基因拷贝数的检测结果比较稳定，故采用均值法对检测结果进行描述性统计。在氮素和IC的影响下，与对照组相比，cbbLR1基因拷贝数均有所增加，且污泥中基因拷贝数在氮素影响下的变化范围比在IC影响下的变化范围要大，这或许与厌氧氨氧化菌在生命代谢过程中对氮素的需求大于对IC的需求有关。
表3 不同基质反应后cbbLR1基因定量分析
Table 3 Quantitative analysis of cbbLR1 by matrix reactions
基质种类基因拷贝数/(copies·g^-1)
处理前污泥 5.49×10⁸
氮素 5.79×10⁸
IC 5.56×10⁸
表4为cbbLR1基因丰度与基质因子之间的线性关系，显著性水平设置为0.05。从表4可以看出，Anammox污泥中cbbLR1基因丰度与氮素浓度之间呈显著相关，与IC浓度之间的相关性不明显，说明cbbLR1基因丰度对氮素的响应度比IC大。尽管cbbLR1基因丰度对IC的响应度低于氮素，但cbbLR1基因丰度与IC浓存在相关性，说明IC对于Anammox系统的脱氮效果和对厌氧氨氧化菌的生长和繁殖有着重要的影响。
表4 cbbLR1基因丰度与基质因子之间的线性关系
Table 4 Linear relationship between cbbLR1 abundance and matrix factors
基因氮素 IC
cbbLR1
0.966
0.034
0.732
0.268
cbbLR1
3 结论
1) 在反应器稳定运行情况下，当进水IC为10.70 mg左右时，系统平均固碳率在12.05%以上，IC在系统中被部分消耗。经¹³C标记处理后的Anammox污泥中，¹³C丰度值由1.07%增加至1.17%以上，说明Anammox污泥中存在某种固碳途径的基因。经普通琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定该基因为cbbLR1基因，说明厌氧氨氧化菌存在卡尔文循环固碳途径。
2) Anammox污泥中cbbLR1基因拷贝数经氮素和IC影响后分别为5.79×10⁸ copies·g^-1和5.56×10⁸ copies·g^-1，较处理前均有所增加。厌氧氨氧化菌中cbbLR1基因丰度对氮素的响应度比对IC的响应度要大，且与氮素浓度之间呈现显著相关性，与IC之间的相关性不显著。
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参考文献 (22)

样品编号	C丰度/%	δ_C/‰	¹³C丰度/%
BLK	32.53	-36.86	1.071
A	36.81	65.35	1.183
B	37.49	74.66	1.193
C	36.47	58.77	1.176

样品编号	A₂₆₀	A₂₈₀	A₂₆₀/A₂₈₀	核酸浓度/(ng·μL^-1)
Y₀	0.303	0.163	1.86	15.1
Y₁	0.244	0.141	1.73	12.2
Y₂	0.392	0.237	1.65	19.6

基质种类	基因拷贝数/(copies·g^-1)
处理前污泥	5.49×10⁸
氮素	5.79×10⁸
IC	5.56×10⁸

基质种类	基因拷贝数/(copies·g^-1)
处理前污泥	5.49×10⁸
氮素	5.79×10⁸
IC	5.56×10⁸

无机碳在厌氧氨氧化系统中的迁移转化

Migration and transformation of inorganic carbon in the Anammox system

摘要

Abstract

关键词

Keywords

1 材料与方法

1.1 实验装置

1.2 实验条件及运行方法

1.3 CO2气体分析

(1)

1.4 13C丰度检测

(2)

1.5 DNA提取与荧光定量PCR检测

2 结果与讨论

2.1 脱氮性能、CO2释放量和平均固碳率表现

2.2 13C丰度测定结果

2.3 DNA检测与荧光定量PCR检测

3 结论

参 考 文 献

计量

出版历程

无机碳在厌氧氨氧化系统中的迁移转化

English Abstract

Migration and transformation of inorganic carbon in the Anammox system

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摘要

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关键词

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1 材料与方法

1.1 实验装置

1.2 实验条件及运行方法

1.3 CO2气体分析

(1)

1.4 13C丰度检测

(2)

1.5 DNA提取与荧光定量PCR检测

2 结果与讨论

2.1 脱氮性能、CO2释放量和平均固碳率表现

2.2 13C丰度测定结果

2.3 DNA检测与荧光定量PCR检测

3 结论

参 考 文 献

目录

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1.3 CO₂气体分析

1.4 ¹³C丰度检测

2.1 脱氮性能、CO₂释放量和平均固碳率表现

2.2 ¹³C丰度测定结果

参考文献

1.3 CO₂气体分析

1.4 ¹³C丰度检测

2.1 脱氮性能、CO₂释放量和平均固碳率表现

2.2 ¹³C丰度测定结果

参考文献