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好氧反硝化菌BN5脱氮降苯特性

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赵晓蕾, 王国英, 李媛. 好氧反硝化菌BN5脱氮降苯特性[J]. 环境工程学报, 2019, 13(4): 850-855. doi: 10.12030/j.cjee.201807123
引用本文: 赵晓蕾, 王国英, 李媛. 好氧反硝化菌BN5脱氮降苯特性[J]. 环境工程学报, 2019, 13(4): 850-855. doi: 10.12030/j.cjee.201807123
shu
ZHAO Xiaolei, WANG Guoying, LI Yuan. Characteristics of simultaneous removal of nitrate and benzene by an aerobic denitrifying bacterium BN5[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(4): 850-855. doi: 10.12030/j.cjee.201807123
Citation: ZHAO Xiaolei, WANG Guoying, LI Yuan. Characteristics of simultaneous removal of nitrate and benzene by an aerobic denitrifying bacterium BN5[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(4): 850-855. doi: 10.12030/j.cjee.201807123
shu

好氧反硝化菌BN5脱氮降苯特性

  • 1.

    太原理工大学环境科学与工程学院，太原 030024

  • 基金项目:

    国家自然科学基金资助项目51408396

    山西省高等学校科技创新项目2016146

    山西省回国留学人员科研资助项目2016-034

    山西省研究生联合培养基地人才培养项目2018JD18国家自然科学基金资助项目(51408396)

    山西省高等学校科技创新项目(2016146)

    山西省回国留学人员科研资助项目(2016-034)

    山西省研究生联合培养基地人才培养项目(2018JD18)

Characteristics of simultaneous removal of nitrate and benzene by an aerobic denitrifying bacterium BN5

  • 1.

    College of Environmental Science and Engineering, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China

  • Fund Project:

摘要

  • 摘要: 以好氧反硝化菌Pseudomonas sp.BN5开展去除硝态氮实验，同时研究其降解苯的特性。结果表明，在最佳转速180 r·min-1条件下，菌株在72 h内可完全降解80 mg·L-1苯；同时，硝态氮的去除率为93.2%。氮平衡分析表明：57.1%的硝态氮转化为胞内氮，32.7%以含氮气体形式被去除；细胞主要通过好氧反硝化和细胞同化作用脱氮。高浓度的苯对细胞生长和硝态氮的去除均有抑制作用，可通过固定化细胞提高降解性能。固定化菌在批式反应器中能高效降苯脱氮，且能够保证反应器的稳定。菌株Pseudomonas sp.BN5可以有效的去除苯和硝酸盐，为该菌的实际应用奠定了基础。
    Abstract: The simultaneous removal of nitrate and benzene by an aerobic denitrifying bacterium Pseudomonas sp. BN5 was investigated in this study. The results showed that 80 mg·L-1 benzene could be completely degraded by BN5 within 72 h at the optimal rotation speed of 180 r·min-1, and NO3--N removal rate could reach 93.2% at initial concentration of 10.49 mg·L-1. The nitrogen balance analysis indicated that 57.1% NO3--N transformed to intracellular nitrogen and 32.7% NO3--N was removed as nitrogenous gas. Nitrate removal was mainly realized by aerobic denitrification and cell assimilation. Benzene with high concentration inhibited the cell growth and nitrate removal, and the degradation performance could be improved by cell immobilization. The immobilized bacteria could efficiently degrade benzene and nitrate in a batch reactor, and maintain the stability of this reactor. This study indicated that the strain Pseudomonas sp. BN5 could effectively remove benzene and nitrate, which laid a foundation for its practical application.

    • 摘要

      以好氧反硝化菌Pseudomonas sp.BN5开展去除硝态氮实验，同时研究其降解苯的特性。结果表明，在最佳转速180 r·min-1条件下，菌株在72 h内可完全降解80 mg·L-1苯；同时，硝态氮的去除率为93.2%。氮平衡分析表明：57.1%的硝态氮转化为胞内氮，32.7%以含氮气体形式被去除；细胞主要通过好氧反硝化和细胞同化作用脱氮。高浓度的苯对细胞生长和硝态氮的去除均有抑制作用，可通过固定化细胞提高降解性能。固定化菌在批式反应器中能高效降苯脱氮，且能够保证反应器的稳定。菌株Pseudomonas sp.BN5可以有效的去除苯和硝酸盐，为该菌的实际应用奠定了基础。

      Abstract

      The simultaneous removal of nitrate and benzene by an aerobic denitrifying bacterium Pseudomonas sp. BN5 was investigated in this study. The results showed that 80 mg·L-1 benzene could be completely degraded by BN5 within 72 h at the optimal rotation speed of 180 r·min-1, and NO3--N removal rate could reach 93.2% at initial concentration of 10.49 mg·L-1. The nitrogen balance analysis indicated that 57.1% NO3--N transformed to intracellular nitrogen and 32.7% NO3--N was removed as nitrogenous gas. Nitrate removal was mainly realized by aerobic denitrification and cell assimilation. Benzene with high concentration inhibited the cell growth and nitrate removal, and the degradation performance could be improved by cell immobilization. The immobilized bacteria could efficiently degrade benzene and nitrate in a batch reactor, and maintain the stability of this reactor. This study indicated that the strain Pseudomonas sp. BN5 could effectively remove benzene and nitrate, which laid a foundation for its practical application.

      苯是焦化、化工、石油炼制等工业排放废水中主要污染物之一，可由皮肤和呼吸道进入体内，对人体神经系统和造血系统造成严重损害[1]。苯的去除包括物理法(物理吸附、膜分离技术等)、化学法(焚烧法、高级氧化法等)和生物降解法等。其中，生物降解法具有处理成本低、去除低浓度苯效果好等优点。含苯废水往往同时含有硝酸盐，其会导致水体富营养化，同时会威胁水体中动植物及人类健康。因此，废水生物处理需要同时去除苯和硝酸盐。反硝化作用是解决苯污染的一种有效方法[2]。传统反硝化作用是在缺氧或厌氧条件下开展的[3]。吴玉成[4]发现，在厌氧反硝化条件下，微生物可利用NO3-作为电子受体降解苯；孔惠等[5]以活性污泥进行微环境实验，发现在厌氧反硝化条件下，苯的平均降解速率为4.51 mg·(L·d)-1。近年来，好氧反硝化作用受到广泛关注，此类研究多以柠檬酸、琥珀酸为底物[6,7,8]，鲜有以有毒物质为研究对象。

      本研究采用假单胞菌属菌株Pseudomonas sp.BN5[9]对菌种进行脱氮，同时对其苯降解特性进行探究，并建立动力学模型；分析脱氮产物和菌体中反硝化酶的活性，并研究固定化细胞对脱氮效果的影响；最后将该菌应用于生物反应器中。

    • 1 实验材料和方法

    • 1.1 菌种和培养基

      菌种为一株假单胞菌属细菌Pseudomonas sp.BN5[9]。LB培养基[10]；无机盐培养基；微量元素溶液，以上培养基于121 ℃高压蒸汽灭菌器中灭菌20 min，固体平板和斜面培养基均另加入18 g·L-1琼脂粉。

    • 1.2 实验方法

      1) 摇床转速影响实验。将菌株Pseudomonas sp.BN5活化至对数生长期，接种至含有80 mg·L-1苯的无机盐培养基中，控制摇床温度30 ℃，考察不同转速(100、140、180、220 r·min-1)对苯和硝态氮降解率的影响。

      2) 细胞生长及苯降解动力学实验。将菌株接种至含有0、5、7、9、11、15、35、70、130、190 mg·L-1苯的无机盐培养基中，在30 ℃、180 r·min-1条件下振荡培养，定时检测培养液中菌体含量(OD600)和残余苯含量。

      3) 氮平衡分析。将菌株接种至100 mL含苯的无机盐培养基中培养72 h，培养液在4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液测量苯、TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N，取沉淀测量胞内氮。

      4) 细胞粗酶液的提取。菌株接种至含苯的无机盐培养基中培养，取对数生长后期的培养液在4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心5 min，取沉淀，用磷酸盐缓冲液清洗3次，重悬细胞后置于冰水混合物中，用细胞破碎仪破碎细胞；再次离心20 min，取上清液即为粗酶液。

      5) 固定化细胞的制备。将对数生长后期的培养液于8 000 r·min-1、4 ℃离心5 min，收集菌体，用生理盐水洗涤3次。质量分数2%的海藻酸钠溶液中加入菌体，制成4 mL菌液，充分搅拌混合，用滴管将菌胶混合液滴入CaCl2溶液中，凝结成光滑微球，硬化24 h后，用生理盐水洗涤后备用。

    • 1.3 测试与分析方法

      菌体浓度测定：在600 nm下用分光光度计测定菌液的OD600值，绘制细胞干重标准曲线，换算得到细胞干重；苯浓度采用气相色谱法；TN用TOC/TN分析仪(TOC-VCPH/TNM-1，日本岛津)测量；NO3--N采用酚二磺酸分光光度法；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法；有机氮为TN减去NO3--N、NO2--N、NH4+-N之和；胞内氮含量用元素分析仪(EA3000，意大利欧维特)测量；酶活分析参照ZHAO等[11]的方法；总蛋白含量用Bradford法[12]测定。

    • 2 结果与讨论

    • 2.1 摇床转速对苯降解和硝态氮去除的影响

      通过控制摇床转速改变培养体系中溶解氧(DO)含量，摇床转速100、140、180、220 r·min-1下实验初期(1 h)培养液中的溶解氧分别为(5.72±0.02)、(6.34±0.03)、(6.72±0.04)、(6.94±0.04) mg·L-1。如图1所示，摇床转速由 100 r·min-1升至180 r·min-1时，菌株BN5降苯除氮的能力迅速增长；到180 r·min-1时，苯和硝态氮的降解率分别为100%、93.2%；但增加到220 r·min-1时，两者降解率均降低。这是因为，在低转速条件下溶解氧含量低，微生物得不到足够的氧进行生物代谢；而180 r·min-1时，溶解氧已不是菌BN5降苯的限制因素；但溶解氧过高，氧气作为电子受体同硝态氮竞争电子使得降解率下降。因此，选择180 r·min-1为最佳摇床转速。

      图1 摇床转速对苯降解和硝态氮去除能力的影响

      图1 摇床转速对苯降解和硝态氮去除能力的影响

      Fig. 1 Effect of shaking speed on benzene degradation and nitrate removal

    • 2.2 菌株的硝态氮去除及苯降解特性研究

      如图2所示，初始苯为80 mg·L-1时，菌株BN5的生长曲线及硝态氮降解表明菌株BN5生长良好，且能同时降解苯和硝态氮。20~56 h为对数生长期，细胞生长繁殖旺盛，苯从76.54 mg·L-1降至15.97 mg·L-1，最大降解速率为2.33 mg·(L·h)-1，最终于72 h完全降解。细菌进入对数期前，硝态氮浓度略降低，其原因是，细菌在生长过程中需要不断地消耗硝态氮。硝态氮浓度降低主要发生在对数生长期，72 h去除率为93.2%。在对数生长期NO2--N明显积累，36 h达到最大(1.28 mg·L-1)，随后逐渐下降；至72 h为0.41 mg·L-1。WU等[13]在研究好氧反硝化菌Pseudomonas aeruginosa CP1去除硝态氮时，也发现了类似的亚硝态氮的生成与消耗规律。

      图2 硝态氮降解，菌体浓度及苯降解曲线

      图2 硝态氮降解，菌体浓度及苯降解曲线

      Fig. 2 Curves of nitrate removal, growth of strain and benzene degradation

    • 2.3 细胞生长动力学

      用Andrews方程描述苯降解动力学：

      μ=μmaxSKs+S+S2/Ki
      (1)

      式中：μ为细胞比生长速率；μmax为细胞最大比生长速率，h-1；S为底物浓度，mg·L-1；Ks为饱和常数，mg·L-1；Ki为抑制常数，mg·L-1。

      图3为典型的抑制生长模式，随着苯浓度的增加，菌体的比生长速率μ呈现先增大后减小的趋势；高浓度时，μ值降低，底物抑制为主导作用。这是因为，苯浓度小于12 mg·L-1时，由于培养基中缺乏碳源，打破了微生物生存的营养平衡，细胞比生长速率陡降，此时底物限制起主导作用。

      图3 实验数据与Andrews模型回归曲线

      图3 实验数据与Andrews模型回归曲线

      Fig. 3 Measured value and regression curve of Andrews model

      对细胞的比生长速率与底物浓度做非线性最小二乘拟合，得到方程动力学参数为：μmax=0.61 h-1，Ks=1.73 mg·L-1，Ki=180 mg·L-1(R2=0.943)。与相关报道的动力学参数值比较(表1)，Pseudomonas sp. BN5细菌动力学参数的μmax值较大，表明该菌株降解苯的能力较强。

      表1 苯降解动力学Andrews方程参数

      Table 1 Andrews equation parameters of benzene degradation dynamics

      菌种μmax/h-1Ks/(mg·L-1)最大苯浓度/(mg·L-1)温度/℃pH
      Pseudomonas sp.BN50.611.7380307
      P.fragiB1[14]0.3353.1710246.5
      P. putidaO1[15]0.443.367030—
      P.putidaF1[16]0.5010.1190307

    • 2.4 苯浓度对脱氮作用的影响

      前述动力学研究表明，苯对细胞有抑制作用。如图4(a)所示，随着苯浓度升高，硝态氮去除耗时增长。苯可使酶蛋白变性，其毒性随着浓度增高而增强，致使好氧反硝化作用减弱。本研究在不同苯浓度下测定菌株BN5硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NIR)的比活力(以蛋白质计)。如图4(b)所示，NIR比活力低于NR，因此在脱氮过程中检测到NO2--N的积累。随着苯浓度的升高，苯的抑制作用增强，NR和NIR的活性不断降低，从而抑制了反硝化脱氮的活性。

      图4 不同苯初始浓度对硝态氮去除和反硝化酶活性的影响

      图4 不同苯初始浓度对硝态氮去除和反硝化酶活性的影响

      Fig. 4 Effect of initial benzene concentration on nitrate removal and denitrification activity

    • 2.5 氮平衡分析

      菌株BN5好氧反硝化过程中各物质的氮含量如表2所示。实验初期，硝态氮为唯一氮源，质量为1.05 mg(以N计)。在好氧反硝化和菌株BN5同化作用下，检测到少量NH4--N、NO3--N及NO2--N；实验末期，有有机氮残留，可能是细胞裂解造成的。胞内氮由0.36 mg增长到0.92 mg，增长量占硝态氮去除量的57.1%；有32.7%的氮损失，这部分氮以含氮气体形式被去除[17]。胞内氮和含氮气体总计占硝态氮去除量的89.8%，可见菌株BN5主要是通过好氧反硝化和细胞同化作用脱氮，这与其他好氧反硝化菌研究[18,19]结果一致。

      表2 菌株BN5好氧反硝化过程中氮平衡分析

      Table 2 Analysis of nitrogen balance during aerobic denitrification process by strain BN5

      检测项目初始N质量/mg最终N质量/mg
      NO3--N1.05±0.130.07±0.01
      NO2--N—0.04±0.02
      NH4+-N—0.04±0.03
      有机氮—0.02±0.01
      胞内氮0.36±0.030.92±0.11

    • 2.6 游离细菌与固定化活细胞降解性能比较

      图5为游离细菌与固定化活细胞降苯脱氮性能的对比。实验对照组中苯的降解率和硝态氮的去除率分别为2.1%、1.5%。这表明可忽略苯的挥发和海藻酸钙凝胶小球(未包埋细菌)吸附作用的影响。固定化细胞降苯脱氮速率高于游离细菌。这是因为，载体为其内部细菌提供了一定的保护作用，而细菌所需营养物质可通过载体的孔隙传递。因此，处于载体内部的细菌具有很强的活性，代谢作用旺盛，可以更快地降解苯；同时，固定化活细胞苯降解速率增快，硝态氮作为好氧反硝化的电子受体，其去除速率相应增大。WU等[20]同样发现了固定化菌株Yarrowia lipolytica W29降解废水中COD速率比游离细菌快。

      图5 固定化细胞与游离细菌对苯和硝态氮的降解

      图5 固定化细胞与游离细菌对苯和硝态氮的降解

      Fig. 5 Degradation of benzene and nitrate byimmobilized cells and free bacterium

    • 2.7 固定化细菌在批式反应器中对苯的生物降解

      第1批与第2批固定化活细胞对苯和硝态氮的降解如图6所示。经海藻酸钙固定的第1批菌BN5对苯和硝态氮的降解规律如图6(a)所示，经过58 h苯完全降解，硝态氮的降解趋势与苯相似，最终降解率为93.2%；在随后的第2批降解实验中(图6(b))，苯与硝态氮降解速率明显提高，且硝态氮降解率达到95.1%。

      图6 不同批次固定化细胞对苯和硝态氮的降解

      图6 不同批次固定化细胞对苯和硝态氮的降解

      Fig. 6 Degradation of benzene and nitrate nitrogen by different batches of immobilized cells

    • 3 结论

      1) 摇床转速180 r·min-1时，菌株Pseudomonas sp. BN5降苯能力达到80 mg·L-1，对硝态氮的降解率为93.2%，表明该菌株有较好的降苯脱氮性能。

      2) 菌株Pseudomonas sp. BN5细胞生长动力学符合Andrews模型且拟合良好(R2=0.943)，这表明高浓度苯对BN5的生长有一定抑制作用。苯对硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性均有抑制作用，且随苯浓度的增加而增加。

      3) 氮平衡分析表明，胞内氮增长量占硝态氮去除量的57.1%，32.7%的氮以含氮气体形式被去除；胞内氮和含氮气体总计占硝态氮去除量的89.8%，菌株BN5主要通过好氧反硝化和细胞同化作用脱氮。

      4) 与游离细菌相比，采用包埋法制备的固定化菌BN5对苯毒性的耐受性能以及脱氮性能均有较大提高；固定化菌BN5在批式反应器中可以更好的降苯脱氮，且能够保证反应器的稳定。

    • 参 考 文 献

      • 1

        裴炳安. 苯的危害及检测[J]. 炼油技术与工程, 2012, 42(11): 62-64.

      • 2

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      • 3

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      • 4

        吴玉成. 反硝化条件下微生物降解地下水中的苯和甲苯[J]. 中国环境科学, 1999, 19(6): 505-509.

      • 5

        孔惠, 李东艳, 钟佐燊. 反硝化苯降解的微环境研究[J]. 环境科学与技术, 2006, 29(8): 12-14.

      • 6

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出版历程
  • 刊出日期:  2019-04-15
赵晓蕾, 王国英, 李媛. 好氧反硝化菌BN5脱氮降苯特性[J]. 环境工程学报, 2019, 13(4): 850-855. doi: 10.12030/j.cjee.201807123
引用本文: 赵晓蕾, 王国英, 李媛. 好氧反硝化菌BN5脱氮降苯特性[J]. 环境工程学报, 2019, 13(4): 850-855. doi: 10.12030/j.cjee.201807123
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ZHAO Xiaolei, WANG Guoying, LI Yuan. Characteristics of simultaneous removal of nitrate and benzene by an aerobic denitrifying bacterium BN5[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(4): 850-855. doi: 10.12030/j.cjee.201807123
Citation: ZHAO Xiaolei, WANG Guoying, LI Yuan. Characteristics of simultaneous removal of nitrate and benzene by an aerobic denitrifying bacterium BN5[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(4): 850-855. doi: 10.12030/j.cjee.201807123
shu

好氧反硝化菌BN5脱氮降苯特性

  • 1. 太原理工大学环境科学与工程学院，太原 030024
基金项目:

国家自然科学基金资助项目51408396

山西省高等学校科技创新项目2016146

山西省回国留学人员科研资助项目2016-034

山西省研究生联合培养基地人才培养项目2018JD18国家自然科学基金资助项目(51408396)

山西省高等学校科技创新项目(2016146)

山西省回国留学人员科研资助项目(2016-034)

山西省研究生联合培养基地人才培养项目(2018JD18)

摘要: 以好氧反硝化菌Pseudomonas sp.BN5开展去除硝态氮实验，同时研究其降解苯的特性。结果表明，在最佳转速180 r·min-1条件下，菌株在72 h内可完全降解80 mg·L-1苯；同时，硝态氮的去除率为93.2%。氮平衡分析表明：57.1%的硝态氮转化为胞内氮，32.7%以含氮气体形式被去除；细胞主要通过好氧反硝化和细胞同化作用脱氮。高浓度的苯对细胞生长和硝态氮的去除均有抑制作用，可通过固定化细胞提高降解性能。固定化菌在批式反应器中能高效降苯脱氮，且能够保证反应器的稳定。菌株Pseudomonas sp.BN5可以有效的去除苯和硝酸盐，为该菌的实际应用奠定了基础。

English Abstract

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      摘要

      以好氧反硝化菌Pseudomonas sp.BN5开展去除硝态氮实验，同时研究其降解苯的特性。结果表明，在最佳转速180 r·min-1条件下，菌株在72 h内可完全降解80 mg·L-1苯；同时，硝态氮的去除率为93.2%。氮平衡分析表明：57.1%的硝态氮转化为胞内氮，32.7%以含氮气体形式被去除；细胞主要通过好氧反硝化和细胞同化作用脱氮。高浓度的苯对细胞生长和硝态氮的去除均有抑制作用，可通过固定化细胞提高降解性能。固定化菌在批式反应器中能高效降苯脱氮，且能够保证反应器的稳定。菌株Pseudomonas sp.BN5可以有效的去除苯和硝酸盐，为该菌的实际应用奠定了基础。

      Abstract

      The simultaneous removal of nitrate and benzene by an aerobic denitrifying bacterium Pseudomonas sp. BN5 was investigated in this study. The results showed that 80 mg·L-1 benzene could be completely degraded by BN5 within 72 h at the optimal rotation speed of 180 r·min-1, and NO3--N removal rate could reach 93.2% at initial concentration of 10.49 mg·L-1. The nitrogen balance analysis indicated that 57.1% NO3--N transformed to intracellular nitrogen and 32.7% NO3--N was removed as nitrogenous gas. Nitrate removal was mainly realized by aerobic denitrification and cell assimilation. Benzene with high concentration inhibited the cell growth and nitrate removal, and the degradation performance could be improved by cell immobilization. The immobilized bacteria could efficiently degrade benzene and nitrate in a batch reactor, and maintain the stability of this reactor. This study indicated that the strain Pseudomonas sp. BN5 could effectively remove benzene and nitrate, which laid a foundation for its practical application.

      苯是焦化、化工、石油炼制等工业排放废水中主要污染物之一，可由皮肤和呼吸道进入体内，对人体神经系统和造血系统造成严重损害[1]。苯的去除包括物理法(物理吸附、膜分离技术等)、化学法(焚烧法、高级氧化法等)和生物降解法等。其中，生物降解法具有处理成本低、去除低浓度苯效果好等优点。含苯废水往往同时含有硝酸盐，其会导致水体富营养化，同时会威胁水体中动植物及人类健康。因此，废水生物处理需要同时去除苯和硝酸盐。反硝化作用是解决苯污染的一种有效方法[2]。传统反硝化作用是在缺氧或厌氧条件下开展的[3]。吴玉成[4]发现，在厌氧反硝化条件下，微生物可利用NO3-作为电子受体降解苯；孔惠等[5]以活性污泥进行微环境实验，发现在厌氧反硝化条件下，苯的平均降解速率为4.51 mg·(L·d)-1。近年来，好氧反硝化作用受到广泛关注，此类研究多以柠檬酸、琥珀酸为底物[6,7,8]，鲜有以有毒物质为研究对象。

      本研究采用假单胞菌属菌株Pseudomonas sp.BN5[9]对菌种进行脱氮，同时对其苯降解特性进行探究，并建立动力学模型；分析脱氮产物和菌体中反硝化酶的活性，并研究固定化细胞对脱氮效果的影响；最后将该菌应用于生物反应器中。

    • 1 实验材料和方法

    • 1.1 菌种和培养基

      菌种为一株假单胞菌属细菌Pseudomonas sp.BN5[9]。LB培养基[10]；无机盐培养基；微量元素溶液，以上培养基于121 ℃高压蒸汽灭菌器中灭菌20 min，固体平板和斜面培养基均另加入18 g·L-1琼脂粉。

    • 1.2 实验方法

      1) 摇床转速影响实验。将菌株Pseudomonas sp.BN5活化至对数生长期，接种至含有80 mg·L-1苯的无机盐培养基中，控制摇床温度30 ℃，考察不同转速(100、140、180、220 r·min-1)对苯和硝态氮降解率的影响。

      2) 细胞生长及苯降解动力学实验。将菌株接种至含有0、5、7、9、11、15、35、70、130、190 mg·L-1苯的无机盐培养基中，在30 ℃、180 r·min-1条件下振荡培养，定时检测培养液中菌体含量(OD600)和残余苯含量。

      3) 氮平衡分析。将菌株接种至100 mL含苯的无机盐培养基中培养72 h，培养液在4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液测量苯、TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N，取沉淀测量胞内氮。

      4) 细胞粗酶液的提取。菌株接种至含苯的无机盐培养基中培养，取对数生长后期的培养液在4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心5 min，取沉淀，用磷酸盐缓冲液清洗3次，重悬细胞后置于冰水混合物中，用细胞破碎仪破碎细胞；再次离心20 min，取上清液即为粗酶液。

      5) 固定化细胞的制备。将对数生长后期的培养液于8 000 r·min-1、4 ℃离心5 min，收集菌体，用生理盐水洗涤3次。质量分数2%的海藻酸钠溶液中加入菌体，制成4 mL菌液，充分搅拌混合，用滴管将菌胶混合液滴入CaCl2溶液中，凝结成光滑微球，硬化24 h后，用生理盐水洗涤后备用。

    • 1.3 测试与分析方法

      菌体浓度测定：在600 nm下用分光光度计测定菌液的OD600值，绘制细胞干重标准曲线，换算得到细胞干重；苯浓度采用气相色谱法；TN用TOC/TN分析仪(TOC-VCPH/TNM-1，日本岛津)测量；NO3--N采用酚二磺酸分光光度法；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法；有机氮为TN减去NO3--N、NO2--N、NH4+-N之和；胞内氮含量用元素分析仪(EA3000，意大利欧维特)测量；酶活分析参照ZHAO等[11]的方法；总蛋白含量用Bradford法[12]测定。

    • 2 结果与讨论

    • 2.1 摇床转速对苯降解和硝态氮去除的影响

      通过控制摇床转速改变培养体系中溶解氧(DO)含量，摇床转速100、140、180、220 r·min-1下实验初期(1 h)培养液中的溶解氧分别为(5.72±0.02)、(6.34±0.03)、(6.72±0.04)、(6.94±0.04) mg·L-1。如图1所示，摇床转速由 100 r·min-1升至180 r·min-1时，菌株BN5降苯除氮的能力迅速增长；到180 r·min-1时，苯和硝态氮的降解率分别为100%、93.2%；但增加到220 r·min-1时，两者降解率均降低。这是因为，在低转速条件下溶解氧含量低，微生物得不到足够的氧进行生物代谢；而180 r·min-1时，溶解氧已不是菌BN5降苯的限制因素；但溶解氧过高，氧气作为电子受体同硝态氮竞争电子使得降解率下降。因此，选择180 r·min-1为最佳摇床转速。

      图1 摇床转速对苯降解和硝态氮去除能力的影响

      图1 摇床转速对苯降解和硝态氮去除能力的影响

      Fig. 1 Effect of shaking speed on benzene degradation and nitrate removal

    • 2.2 菌株的硝态氮去除及苯降解特性研究

      如图2所示，初始苯为80 mg·L-1时，菌株BN5的生长曲线及硝态氮降解表明菌株BN5生长良好，且能同时降解苯和硝态氮。20~56 h为对数生长期，细胞生长繁殖旺盛，苯从76.54 mg·L-1降至15.97 mg·L-1，最大降解速率为2.33 mg·(L·h)-1，最终于72 h完全降解。细菌进入对数期前，硝态氮浓度略降低，其原因是，细菌在生长过程中需要不断地消耗硝态氮。硝态氮浓度降低主要发生在对数生长期，72 h去除率为93.2%。在对数生长期NO2--N明显积累，36 h达到最大(1.28 mg·L-1)，随后逐渐下降；至72 h为0.41 mg·L-1。WU等[13]在研究好氧反硝化菌Pseudomonas aeruginosa CP1去除硝态氮时，也发现了类似的亚硝态氮的生成与消耗规律。

      图2 硝态氮降解，菌体浓度及苯降解曲线

      图2 硝态氮降解，菌体浓度及苯降解曲线

      Fig. 2 Curves of nitrate removal, growth of strain and benzene degradation

    • 2.3 细胞生长动力学

      用Andrews方程描述苯降解动力学：

      μ=μmaxSKs+S+S2/Ki
      (1)

      式中：μ为细胞比生长速率；μmax为细胞最大比生长速率，h-1；S为底物浓度，mg·L-1；Ks为饱和常数，mg·L-1；Ki为抑制常数，mg·L-1。

      图3为典型的抑制生长模式，随着苯浓度的增加，菌体的比生长速率μ呈现先增大后减小的趋势；高浓度时，μ值降低，底物抑制为主导作用。这是因为，苯浓度小于12 mg·L-1时，由于培养基中缺乏碳源，打破了微生物生存的营养平衡，细胞比生长速率陡降，此时底物限制起主导作用。

      图3 实验数据与Andrews模型回归曲线

      图3 实验数据与Andrews模型回归曲线

      Fig. 3 Measured value and regression curve of Andrews model

      对细胞的比生长速率与底物浓度做非线性最小二乘拟合，得到方程动力学参数为：μmax=0.61 h-1，Ks=1.73 mg·L-1，Ki=180 mg·L-1(R2=0.943)。与相关报道的动力学参数值比较(表1)，Pseudomonas sp. BN5细菌动力学参数的μmax值较大，表明该菌株降解苯的能力较强。

      表1 苯降解动力学Andrews方程参数

      Table 1 Andrews equation parameters of benzene degradation dynamics

      菌种μmax/h-1Ks/(mg·L-1)最大苯浓度/(mg·L-1)温度/℃pH
      Pseudomonas sp.BN50.611.7380307
      P.fragiB1[14]0.3353.1710246.5
      P. putidaO1[15]0.443.367030—
      P.putidaF1[16]0.5010.1190307

    • 2.4 苯浓度对脱氮作用的影响

      前述动力学研究表明，苯对细胞有抑制作用。如图4(a)所示，随着苯浓度升高，硝态氮去除耗时增长。苯可使酶蛋白变性，其毒性随着浓度增高而增强，致使好氧反硝化作用减弱。本研究在不同苯浓度下测定菌株BN5硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NIR)的比活力(以蛋白质计)。如图4(b)所示，NIR比活力低于NR，因此在脱氮过程中检测到NO2--N的积累。随着苯浓度的升高，苯的抑制作用增强，NR和NIR的活性不断降低，从而抑制了反硝化脱氮的活性。

      图4 不同苯初始浓度对硝态氮去除和反硝化酶活性的影响

      图4 不同苯初始浓度对硝态氮去除和反硝化酶活性的影响

      Fig. 4 Effect of initial benzene concentration on nitrate removal and denitrification activity

    • 2.5 氮平衡分析

      菌株BN5好氧反硝化过程中各物质的氮含量如表2所示。实验初期，硝态氮为唯一氮源，质量为1.05 mg(以N计)。在好氧反硝化和菌株BN5同化作用下，检测到少量NH4--N、NO3--N及NO2--N；实验末期，有有机氮残留，可能是细胞裂解造成的。胞内氮由0.36 mg增长到0.92 mg，增长量占硝态氮去除量的57.1%；有32.7%的氮损失，这部分氮以含氮气体形式被去除[17]。胞内氮和含氮气体总计占硝态氮去除量的89.8%，可见菌株BN5主要是通过好氧反硝化和细胞同化作用脱氮，这与其他好氧反硝化菌研究[18,19]结果一致。

      表2 菌株BN5好氧反硝化过程中氮平衡分析

      Table 2 Analysis of nitrogen balance during aerobic denitrification process by strain BN5

      检测项目初始N质量/mg最终N质量/mg
      NO3--N1.05±0.130.07±0.01
      NO2--N—0.04±0.02
      NH4+-N—0.04±0.03
      有机氮—0.02±0.01
      胞内氮0.36±0.030.92±0.11

    • 2.6 游离细菌与固定化活细胞降解性能比较

      图5为游离细菌与固定化活细胞降苯脱氮性能的对比。实验对照组中苯的降解率和硝态氮的去除率分别为2.1%、1.5%。这表明可忽略苯的挥发和海藻酸钙凝胶小球(未包埋细菌)吸附作用的影响。固定化细胞降苯脱氮速率高于游离细菌。这是因为，载体为其内部细菌提供了一定的保护作用，而细菌所需营养物质可通过载体的孔隙传递。因此，处于载体内部的细菌具有很强的活性，代谢作用旺盛，可以更快地降解苯；同时，固定化活细胞苯降解速率增快，硝态氮作为好氧反硝化的电子受体，其去除速率相应增大。WU等[20]同样发现了固定化菌株Yarrowia lipolytica W29降解废水中COD速率比游离细菌快。

      图5 固定化细胞与游离细菌对苯和硝态氮的降解

      图5 固定化细胞与游离细菌对苯和硝态氮的降解

      Fig. 5 Degradation of benzene and nitrate byimmobilized cells and free bacterium

    • 2.7 固定化细菌在批式反应器中对苯的生物降解

      第1批与第2批固定化活细胞对苯和硝态氮的降解如图6所示。经海藻酸钙固定的第1批菌BN5对苯和硝态氮的降解规律如图6(a)所示，经过58 h苯完全降解，硝态氮的降解趋势与苯相似，最终降解率为93.2%；在随后的第2批降解实验中(图6(b))，苯与硝态氮降解速率明显提高，且硝态氮降解率达到95.1%。

      图6 不同批次固定化细胞对苯和硝态氮的降解

      图6 不同批次固定化细胞对苯和硝态氮的降解

      Fig. 6 Degradation of benzene and nitrate nitrogen by different batches of immobilized cells

    • 3 结论

      1) 摇床转速180 r·min-1时，菌株Pseudomonas sp. BN5降苯能力达到80 mg·L-1，对硝态氮的降解率为93.2%，表明该菌株有较好的降苯脱氮性能。

      2) 菌株Pseudomonas sp. BN5细胞生长动力学符合Andrews模型且拟合良好(R2=0.943)，这表明高浓度苯对BN5的生长有一定抑制作用。苯对硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性均有抑制作用，且随苯浓度的增加而增加。

      3) 氮平衡分析表明，胞内氮增长量占硝态氮去除量的57.1%，32.7%的氮以含氮气体形式被去除；胞内氮和含氮气体总计占硝态氮去除量的89.8%，菌株BN5主要通过好氧反硝化和细胞同化作用脱氮。

      4) 与游离细菌相比，采用包埋法制备的固定化菌BN5对苯毒性的耐受性能以及脱氮性能均有较大提高；固定化菌BN5在批式反应器中可以更好的降苯脱氮，且能够保证反应器的稳定。

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参考文献 (20)

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