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邻苯二酚-2，3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达

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赵亚光, 段魏魏, 徐苗, 吴盼云, 肖璐梅, 马腾飞, 晁群芳. 邻苯二酚-2，3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达[J]. 环境工程学报, 2019, 13(1): 232-237. doi: 10.12030/j.cjee.201807117
引用本文: 赵亚光, 段魏魏, 徐苗, 吴盼云, 肖璐梅, 马腾飞, 晁群芳. 邻苯二酚-2，3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达[J]. 环境工程学报, 2019, 13(1): 232-237. doi: 10.12030/j.cjee.201807117
shu
ZHAO Yaguang, DUAN Weiwei, XU Miao, WU Panyun, XIAO Lumei, MA Tengfei, CHAO Qunfang. Integration and expression of catechol-2,3-dioxygenase gene in pyrene degrading bacteria genome[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(1): 232-237. doi: 10.12030/j.cjee.201807117
Citation: ZHAO Yaguang, DUAN Weiwei, XU Miao, WU Panyun, XIAO Lumei, MA Tengfei, CHAO Qunfang. Integration and expression of catechol-2,3-dioxygenase gene in pyrene degrading bacteria genome[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(1): 232-237. doi: 10.12030/j.cjee.201807117
shu

邻苯二酚-2，3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达

  • 1.

    新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046

  • 基金项目:

    国家自然科学基金资助项目(31460027)

Integration and expression of catechol-2,3-dioxygenase gene in pyrene degrading bacteria genome

  • 1.

    College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

  • Fund Project:

摘要

  • 摘要: 为了构建能够稳定遗传且高效降解多环芳烃的工程菌，利用PCR技术对Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2, 3-双加氧酶(C23O)基因进行克隆，并将其与自杀性载体pUTmini-Tn5连接，得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O。在三亲接合作用下，经mini-Tn5转座子将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株Pseudomonas sp. wp4的染色体DNA中，最终得到基因工程菌wp4-C23O。在不同pH、温度下，菌株wp4和工程菌wp4-C23O对浓度为50 mg?L-1的芘进行降解7 d。2株菌降解最适温度为37 ℃、最适pH为7.5。在此条件下，工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于wp4菌株(P<0.05)，降解率提高11.45%。以PAHs降解优势菌株为受体构建工程菌可以去除石油污染土壤中的PAHs。
    Abstract: This study aims to construct polycyclic aromatic hydrocarbons engineering bacteria with genetic stability and highly efficient degradation. Firstly, the catechol-2,3-dioxygenase (C23O) gene of Pseudomonas songnenensis wp3-1 was cloned by PCR technique, and was linked to suicide vector pUTmini-Tn5, then the recombinant vector pUTmini-Tn5-C23O was obtained. Secondly, the C230 gene of pUTmini-Tn5-C23O was integrated into the chromosomal DNA of Pseudomonas sp. wp4 with the triparental conjugation effect of mini-Tn5 transposition, and finally the gene engineering bacteria wp4-C23O was obtained. The result of contrast experiment to degrade pyrene solution (50 mg?L-1) for 7 days indicated that the optimum environment conditions for strain wp4 and strain wp4-C23O were 37 ℃ and pH 7.5. Under these conditions, the engineering strain wp4-C23O showed significantly higher degradation rate of pyrene than wp4 strain (P<0.05), and it increased by 11.45%. The engineering bacteria taking PAHs degrading dominant strain as acceptor can effectively remove PAHs from petroleum-contaminated soil.

    • 摘要

      为了构建能够稳定遗传且高效降解多环芳烃的工程菌，利用PCR技术对Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2, 3-双加氧酶(C23O)基因进行克隆，并将其与自杀性载体pUTmini-Tn5连接，得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O。在三亲接合作用下，经mini-Tn5转座子将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株Pseudomonas sp. wp4的染色体DNA中，最终得到基因工程菌wp4-C23O。在不同pH、温度下，菌株wp4和工程菌wp4-C23O对浓度为50 mg∙L-1的芘进行降解7 d。2株菌降解最适温度为37 ℃、最适pH为7.5。在此条件下，工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于wp4菌株(P<0.05)，降解率提高11.45%。以PAHs降解优势菌株为受体构建工程菌可以去除石油污染土壤中的PAHs。

      Abstract

      This study aims to construct polycyclic aromatic hydrocarbons engineering bacteria with genetic stability and highly efficient degradation. Firstly, the catechol-2,3-dioxygenase (C23O) gene of Pseudomonas songnenensis wp3-1 was cloned by PCR technique, and was linked to suicide vector pUTmini-Tn5, then the recombinant vector pUTmini-Tn5-C23O was obtained. Secondly, the C230 gene of pUTmini-Tn5-C23O was integrated into the chromosomal DNA of Pseudomonas sp. wp4 with the triparental conjugation effect of mini-Tn5 transposition, and finally the gene engineering bacteria wp4-C23O was obtained. The result of contrast experiment to degrade pyrene solution (50 mg∙L-1) for 7 days indicated that the optimum environment conditions for strain wp4 and strain wp4-C23O were 37 ℃ and pH 7.5. Under these conditions, the engineering strain wp4-C23O showed significantly higher degradation rate of pyrene than wp4 strain (P<0.05), and it increased by 11.45%. The engineering bacteria taking PAHs degrading dominant strain as acceptor can effectively remove PAHs from petroleum-contaminated soil.

      目前，土壤中的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)治理主要是通过微生物降解。为了提高对PAHs的降解率，国内外学者一直尝试利用PCR等技术将微生物降解PAHs途径中的关键基因克隆到各种质粒中，使其在E.coli细胞内过量表达，从而达到高效降解PAHs目的[1,2,3,4,5,6,7]。但质粒具有易丢失、遗传不稳定等缺点，而且基于E.coli构建出的PAHs降解工程菌对环境适应能力较差，难以直接用于去除土壤中的PAHs[8]。因此，利用基因工程菌高效处理PAHs必须保证其具有高效的降解力及种群优势。在影响基因工程菌稳定性的诸多因素中，宿主细胞的遗传特性、质粒的组成及所处的环境条件等3方面因素受到研究人员的广泛重视[9]。NAGAYAMA等[10]从石油降解菌中克隆出加氧酶基因，连接自杀性载体，通过三亲接合转化将加氧酶基因插入多环芳烃降解优势菌株Pseudomonas putida基因组上，构建出多环芳烃降解工程菌，该菌株对多环芳烃降解率显著增加，且具有较好的遗传稳定性。本研究利用PCR技术克隆出Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2,3-双加氧酶(catechol-2,3-dioxygenase)基因，与自杀性载体pUTmini-Tn5连接重组，形成pUTmini-Tn5-C23O重组质粒，经转化，构建出三亲接合作用的供体菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O，然后通过三亲接合转化将供体菌株重组质粒pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因转座到Pseudomonas sp.wp4基因组上，得到芘降解工程菌wp4-C23O，并且检验工菌株对芘的降解率。该方法不仅有效提高芘降解率，而且解决了遗传不稳定的问题。此外，以PAHs降解优势菌株Pseudomonas sp. wp4构建的工程菌对环境适应能力较强，可以应用于石油污染土壤中的PAHs处理。

    • 1 材料与方法

      1

    • 1.1 试剂、载体与菌株

      1.1

      芘购自Sigma 公司，纯度≥99%，二氯甲烷购自大连宝生物公司，为HPLC 级，所用酶购自Takara公司，其他化学试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。载体与菌株来源见表1。

      表1 载体与菌株特性及来源

      Table 1 Vector and strain characteristics and sources

      菌株和质粒特性来源
      Escherichia coli S17-1(λpir)pUTmini-Tn5宿主菌BioVector，Inc.
      E.coli HB101(RK2013)三亲结合辅助菌，KmrBioVector，Inc.

      Pseudomonas songnenensis wp3-1

      (登录号：KX925840)

      		C23O基因供体菌实验室保存

      Pseudomonas sp.wp4

      (登录号：KX925841)

      三亲结合受体菌，基因组DNA含C23O基因，

      无Kmr，StrRr

      		实验室保存
      载体pUTmini-Tn5带有Tn5的自杀性质粒，Ampr，oriR6K，KmrBioVector，Inc.
      Escherichia coli S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O三亲结合供体菌本研究构建
      表1 载体与菌株特性及来源

    • 1.2 培养基

      1.2

      MS无机盐培养基：MgSO4 0.2 g；KH2PO4 1 g；NH4NO3 1 g；CaCl2 0.02 g；FeCl3·6H2O 微量；H2O 1 000 mL。LB 培养基：酵母膏5 g；蛋白胨10 g；氯化钠5 g；H2O 1 000 mL。

    • 1.3 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O构建与鉴定

      1.3

      以Pseudomonas songnenensis wp3-1基因组为模板，正向引物5'-ATTTGCGGCCGCAGGTGWCGTSATGAAMAAAGG-3'和反向引物5'-ATTTGCGGCCGCTYAGGTSAKMACGGTCAKGAA-3'对C23O基因进行PCR扩增。每个引物含NotI酶切位点GCGGCCGC。PCR条件按文献中的方法[11]进行。将PCR产物和自杀性载体pUTmini-Tn5分别在37 ℃条件下经NotI酶消化4 h，分别电泳，切胶回收。之后将回收的C23O基因和pUTmini-Tn5载体片段在16 ℃条件下经T4酶连过夜(构建过程如图1所示)。然后将连接液用热激转化到感受态细胞大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir)。用涂布棒将转化菌悬液涂布于包含邻苯二酚(100 mg∙L-1)、卡那霉素(50 mg∙L-1)以及链霉素(50 mg∙L-1)的LB固体培养基上。在37 ℃条件下培养过夜，然后挑取淡黄色菌落即为阳性克隆大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O。将其扩大培养提取质粒，用C23O基因特异性引物进行PCR扩增，并测序检验目的基因存在，正向引物为5'-AGGTGWCGTSATGAAMA-AAGG-3'和反向引物为5'-TYAGGTSAKMACGGTCAKGAA-3'，PCR条件按文献中的方法[11]进行。

      图 1 重组载体pUTmini-Tn5-C23O构建过程

      图 1 重组载体pUTmini-Tn5-C23O构建过程

      Fig. 1 Construction process of recombinant vector pUTmini-Tn5-C23O

    • 1.4 三亲接合转化

      1.4

      按文献中的方法[12]，将供体菌S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O、辅助菌E .coli HB101(RK2013)、受体菌Pseudomonas sp. wp4在含有相应抗生素的LB液体培养基中培养8 h，然后将供体菌、辅助菌、受体菌按照3∶3∶2的比例混合后，30 ℃下10 000 r∙min-1离心3 min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次除去抗生素，加入200 µL LB液体培养基重悬，然后置于LB固体平板的细菌滤膜上。在30 ℃培养过夜，次日将菌体从平板上洗下，用1 mL生理盐水重悬混合液，然后稀释不同浓度，涂布于含有邻苯二酚100 mg∙L-1、卡那霉素50 mg∙L-1、以及链霉素50 mg∙L-1的LB选择性培养基平板上，筛选阳性克隆，并命名为wp4-C23O。

    • 1.5 工程菌鉴定

      1.5

      提取菌株wp4和工程菌基因组DNA，根据重组载体pUTmini-Tn5-C23O的km基因和C23O基因序列分别设计上游引物F：5'-GGCAGCGCAACGGAACATTCA-3'和下游引物R：5'-GACGAACCTGGTATGGATTT-3'，进行PCR扩增，产物预期长度为1 900 bp左右，检验2株菌基因组是否同时含有km基因和C23O基因，以此确定C23O基因是否插入受体菌Pseudomonas stutzeri wp4。PCR 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，60 ℃ 60 s， 72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 7 min。

    • 1.6 菌悬液配制

      1.6

      将LB培养基中菌株wp-4和工程菌的对数期菌液于2 mL无菌离心管中，在4 ℃下，10 000 r∙min-1离心1 min，弃上清液，用无机盐培养基洗涤3次，再用无机盐培养基制成OD600= 0.1菌悬液备用。

    • 1.7 芘降解率单因素实验

      1.7

      温度对芘降解率的影响。将二氯甲烷配置的芘标准液加入到pH为7.0的50 mL 无机盐培养基中，使其最终浓度均为50 mg∙L-1。在34 ℃下，140 r∙min-1摇床振荡24 h，待二氯甲烷挥发完全，然后在培养基中加入500 μL菌株wp4和工程菌株菌悬液，分别在28、31、34、37和40 ℃温度条件下，140 r∙min-1摇床振荡培养7 d，分别测定菌株芘降解率，实验重复3次。

      pH对芘降解率的影响。将二氯甲烷配置的芘标准液加入pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的50 mL无机盐培养基中，使其最终浓度均为50 mg∙ L-1。在34 ℃下，140 r∙min-1摇床振荡24 h，待二氯甲烷挥发完全，然后在培养基中加入500 μL菌株wp4和工程菌株菌悬液，在37 ℃下，140 r∙min-1摇床振荡培养7 d，分别测定菌株芘降解率，实验重复3次。

      菌株芘降解率测定按文献中的方法[13,14]进行，用紫外分光光度计测定242 nm波长下的吸光度值。芘标准曲线方程：y=0.172 72x+0.058 19(R2=0.999 32)。配制芘浓度为 50 mg∙L-1的无机盐液体培养基。将上述培养7 d的培养液，整瓶提取，用有机溶剂二氯甲烷振荡离心萃取 3 次，萃取液经无水硫酸钠过滤定容后，用紫外分光光度计分析。检测波长242 nm下吸光度值，根据标准曲线计算其降解率。

    • 1.8 数据处理

      1.8

      数据采用 Excel 2003 和 OriginLab OriginPro 8.6 进行处理和制图，运用SPSS 18.0 软件进行方差分析。

    • 2 结果与分析

      2

    • 2.1 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的筛选

      2.1

      将从含有邻苯二酚100 mg∙L-1、卡那霉素50 mg∙L-1以及链霉素50 mg∙L-1的LB选择性培养基筛选出的阳性克隆重复划线，观察生长状况，结果如图2所示。菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O生长良好，且出现淡黄色。这表明菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O初步构建成功。

      图 2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O筛选结果

      图 2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O筛选结果

      Fig. 2 Screening results of strain S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O

    • 2.2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的PCR鉴定

      2.2

      提取菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的质粒作为模板，用C23O特异性引物进行PCR扩增，验证阳性克隆大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O，结果如图3所示。PCR条带大小为900 bp左右，经测序与目的基因C23O序列一致，表明S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O构建成功。

      图3 pUTmini-Tn5-C23O构建过程的电泳验证

      图3 pUTmini-Tn5-C23O构建过程的电泳验证

      Fig. 3 Electrophoresis map of construction process of pUTmini-Tn5-C23O

    • 2.3 工程菌构建验证

      2.3

      将受体菌Pseudomonas stutzeri wp4、供体菌大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O以及E .coli HB101(RK2013)进行三亲和转化，然后在选择培养基上筛选得到阳性克隆子，即工程菌wp4-C23O。用特异性引物对菌株wp4和工程菌DNA基因组进行PCR扩增km基因和C23O基因，结果如图4所示。菌株wp4基因组同时不含km基因和C23O基因，工程菌基因组同时含km基因和C23O基因，且PCR产物大小为1 900 bp左右，与预期大小一致。这表明C23O基因经过转座子Tn5共同插入到受体菌Pseudomonas stutzeri wp4 DNA基因组上。

      图 4 km基因和C23O基因PCR 检测结果

      图 4 km基因和C23O基因PCR 检测结果

      Fig. 4 PCR results of km and C23O gene

    • 2.4 单因素实验

      2.4

    • 2.4.1 温度对芘降解率的影响

      2.4.1

      如图5所示，菌株wp4和工程菌wp4-C23O经过7 d培养，在一定范围内，随温度提高芘降解率增加，但在37 ℃以后，芘降解率下降，在37 ℃时，降解率达到最大。此温度下，菌株wp4和工程菌wp4-C23O芘降解率分别为71.75%、82.20%。在28、31、34、37和40 ℃时，工程菌比菌株wp4芘降解率有显著增加(P<0.05)。以上结果表明，在不同温度下，工程菌芘降解率显著高于菌株wp4(P<0.05)，降解率提高10.45%。

      图5 温度对芘降解率的影响

      图5 温度对芘降解率的影响

      Fig. 5 Effect of temperature on pyrene degradation rate

    • 2.4.2 pH对芘降解率的影响

      2.4.2

      如图6所示，菌株wp4和工程菌wp4-C23O经过7 d培养，在一定pH内，随pH升高，芘降解率增加，pH大于7.5之后，2株菌株芘降解率减小，最适pH为7.5，在此pH下，菌株wp4和工程菌芘降解率分别为71.42%、82.87%。当pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时，工程菌比菌株wp4芘降解率有显著增加(P<0.05)。在不同pH下，工程菌芘降解率显著高于菌株wp4(P<0.05)，降解率提高11.45%。

      图6 pH对芘降解率的影响

      图6 pH对芘降解率的影响

      Fig.6 Effect of pH on pyrene degradation rate

      目前，多数研究者通过选用合适的表达质粒将邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因与其连接，目的主要是提高该基因表达量。但是，质粒具有遗传不稳定的缺点，导致重组质粒可能丢失。而通过转座子将邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因插入到微生物基因组上，这在一定程度上提高了该基因遗传稳定性。谢云[12]通过转座子将具有PAHs降解特性的恶臭假单胞菌中邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因插入到烷烃降解菌BS3的DNA组上，构建出工程菌，验证了该菌株具有较高的遗传稳定性。本研究选用从克拉玛依石油污染土壤分离出的菌株Pseudomonas sp.wp4作为受体菌，该菌株对石油污染土壤中的PAHs具有较好的降解性，且普遍存在，甚至可以形成优势菌株。运用菌株Pseudomonas sp.wp4构建出的工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于菌株Pseudomonas sp.wp4，且高于其他芘降解菌[15,16,17,18,19]。菌株wp4、工程菌的最适pH、温度分别为7.5、37 ℃，表明工程菌经过基因组整合后的基本生长特性没有变化。因而，可以去除石油污染土壤中的PAHs。

    • 3 结论

      3

      1)通过三亲接合转化将C23O基因插入到降解多环芳烃优势菌株wp4基因组上，成功构建降解了多环芳烃的工程菌wp4-C23O。该工程菌具有实际应用的潜力。

      2)选择pH、温度为影响因素，对浓度为50 mg∙L-1的芘无机盐培养基进行了菌株wp4和工程菌wp4-C23O降解实验，结果表明：2株菌最适降解pH为7.5、最适温度为37 ℃。在此条件下，工程菌wp4-C23O対芘降解率显著高于wp4菌株，降解率提高11.45%。

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出版历程
  • 刊出日期:  2019-01-08
赵亚光, 段魏魏, 徐苗, 吴盼云, 肖璐梅, 马腾飞, 晁群芳. 邻苯二酚-2，3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达[J]. 环境工程学报, 2019, 13(1): 232-237. doi: 10.12030/j.cjee.201807117
引用本文: 赵亚光, 段魏魏, 徐苗, 吴盼云, 肖璐梅, 马腾飞, 晁群芳. 邻苯二酚-2，3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达[J]. 环境工程学报, 2019, 13(1): 232-237. doi: 10.12030/j.cjee.201807117
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ZHAO Yaguang, DUAN Weiwei, XU Miao, WU Panyun, XIAO Lumei, MA Tengfei, CHAO Qunfang. Integration and expression of catechol-2,3-dioxygenase gene in pyrene degrading bacteria genome[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(1): 232-237. doi: 10.12030/j.cjee.201807117
Citation: ZHAO Yaguang, DUAN Weiwei, XU Miao, WU Panyun, XIAO Lumei, MA Tengfei, CHAO Qunfang. Integration and expression of catechol-2,3-dioxygenase gene in pyrene degrading bacteria genome[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2019, 13(1): 232-237. doi: 10.12030/j.cjee.201807117
shu

邻苯二酚-2，3-双加氧酶基因在芘降解菌基因组的整合与表达

  • 1. 新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046
基金项目:

国家自然科学基金资助项目(31460027)

摘要: 为了构建能够稳定遗传且高效降解多环芳烃的工程菌，利用PCR技术对Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2, 3-双加氧酶(C23O)基因进行克隆，并将其与自杀性载体pUTmini-Tn5连接，得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O。在三亲接合作用下，经mini-Tn5转座子将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株Pseudomonas sp. wp4的染色体DNA中，最终得到基因工程菌wp4-C23O。在不同pH、温度下，菌株wp4和工程菌wp4-C23O对浓度为50 mg?L-1的芘进行降解7 d。2株菌降解最适温度为37 ℃、最适pH为7.5。在此条件下，工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于wp4菌株(P<0.05)，降解率提高11.45%。以PAHs降解优势菌株为受体构建工程菌可以去除石油污染土壤中的PAHs。

English Abstract

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      摘要

      为了构建能够稳定遗传且高效降解多环芳烃的工程菌，利用PCR技术对Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2, 3-双加氧酶(C23O)基因进行克隆，并将其与自杀性载体pUTmini-Tn5连接，得到重组载体pUTmini-Tn5-C23O。在三亲接合作用下，经mini-Tn5转座子将重组载体pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因整合到菌株Pseudomonas sp. wp4的染色体DNA中，最终得到基因工程菌wp4-C23O。在不同pH、温度下，菌株wp4和工程菌wp4-C23O对浓度为50 mg∙L-1的芘进行降解7 d。2株菌降解最适温度为37 ℃、最适pH为7.5。在此条件下，工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于wp4菌株(P<0.05)，降解率提高11.45%。以PAHs降解优势菌株为受体构建工程菌可以去除石油污染土壤中的PAHs。

      Abstract

      This study aims to construct polycyclic aromatic hydrocarbons engineering bacteria with genetic stability and highly efficient degradation. Firstly, the catechol-2,3-dioxygenase (C23O) gene of Pseudomonas songnenensis wp3-1 was cloned by PCR technique, and was linked to suicide vector pUTmini-Tn5, then the recombinant vector pUTmini-Tn5-C23O was obtained. Secondly, the C230 gene of pUTmini-Tn5-C23O was integrated into the chromosomal DNA of Pseudomonas sp. wp4 with the triparental conjugation effect of mini-Tn5 transposition, and finally the gene engineering bacteria wp4-C23O was obtained. The result of contrast experiment to degrade pyrene solution (50 mg∙L-1) for 7 days indicated that the optimum environment conditions for strain wp4 and strain wp4-C23O were 37 ℃ and pH 7.5. Under these conditions, the engineering strain wp4-C23O showed significantly higher degradation rate of pyrene than wp4 strain (P<0.05), and it increased by 11.45%. The engineering bacteria taking PAHs degrading dominant strain as acceptor can effectively remove PAHs from petroleum-contaminated soil.

      目前，土壤中的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)治理主要是通过微生物降解。为了提高对PAHs的降解率，国内外学者一直尝试利用PCR等技术将微生物降解PAHs途径中的关键基因克隆到各种质粒中，使其在E.coli细胞内过量表达，从而达到高效降解PAHs目的[1,2,3,4,5,6,7]。但质粒具有易丢失、遗传不稳定等缺点，而且基于E.coli构建出的PAHs降解工程菌对环境适应能力较差，难以直接用于去除土壤中的PAHs[8]。因此，利用基因工程菌高效处理PAHs必须保证其具有高效的降解力及种群优势。在影响基因工程菌稳定性的诸多因素中，宿主细胞的遗传特性、质粒的组成及所处的环境条件等3方面因素受到研究人员的广泛重视[9]。NAGAYAMA等[10]从石油降解菌中克隆出加氧酶基因，连接自杀性载体，通过三亲接合转化将加氧酶基因插入多环芳烃降解优势菌株Pseudomonas putida基因组上，构建出多环芳烃降解工程菌，该菌株对多环芳烃降解率显著增加，且具有较好的遗传稳定性。本研究利用PCR技术克隆出Pseudomonas songnenensis wp3-1的邻苯二酚-2,3-双加氧酶(catechol-2,3-dioxygenase)基因，与自杀性载体pUTmini-Tn5连接重组，形成pUTmini-Tn5-C23O重组质粒，经转化，构建出三亲接合作用的供体菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O，然后通过三亲接合转化将供体菌株重组质粒pUTmini-Tn5-C23O中的C23O基因转座到Pseudomonas sp.wp4基因组上，得到芘降解工程菌wp4-C23O，并且检验工菌株对芘的降解率。该方法不仅有效提高芘降解率，而且解决了遗传不稳定的问题。此外，以PAHs降解优势菌株Pseudomonas sp. wp4构建的工程菌对环境适应能力较强，可以应用于石油污染土壤中的PAHs处理。

    • 1 材料与方法

      1

    • 1.1 试剂、载体与菌株

      1.1

      芘购自Sigma 公司，纯度≥99%，二氯甲烷购自大连宝生物公司，为HPLC 级，所用酶购自Takara公司，其他化学试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。载体与菌株来源见表1。

      表1 载体与菌株特性及来源

      Table 1 Vector and strain characteristics and sources

      菌株和质粒特性来源
      Escherichia coli S17-1(λpir)pUTmini-Tn5宿主菌BioVector，Inc.
      E.coli HB101(RK2013)三亲结合辅助菌，KmrBioVector，Inc.

      Pseudomonas songnenensis wp3-1

      (登录号：KX925840)

      		C23O基因供体菌实验室保存

      Pseudomonas sp.wp4

      (登录号：KX925841)

      三亲结合受体菌，基因组DNA含C23O基因，

      无Kmr，StrRr

      		实验室保存
      载体pUTmini-Tn5带有Tn5的自杀性质粒，Ampr，oriR6K，KmrBioVector，Inc.
      Escherichia coli S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O三亲结合供体菌本研究构建
      表1 载体与菌株特性及来源

    • 1.2 培养基

      1.2

      MS无机盐培养基：MgSO4 0.2 g；KH2PO4 1 g；NH4NO3 1 g；CaCl2 0.02 g；FeCl3·6H2O 微量；H2O 1 000 mL。LB 培养基：酵母膏5 g；蛋白胨10 g；氯化钠5 g；H2O 1 000 mL。

    • 1.3 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O构建与鉴定

      1.3

      以Pseudomonas songnenensis wp3-1基因组为模板，正向引物5'-ATTTGCGGCCGCAGGTGWCGTSATGAAMAAAGG-3'和反向引物5'-ATTTGCGGCCGCTYAGGTSAKMACGGTCAKGAA-3'对C23O基因进行PCR扩增。每个引物含NotI酶切位点GCGGCCGC。PCR条件按文献中的方法[11]进行。将PCR产物和自杀性载体pUTmini-Tn5分别在37 ℃条件下经NotI酶消化4 h，分别电泳，切胶回收。之后将回收的C23O基因和pUTmini-Tn5载体片段在16 ℃条件下经T4酶连过夜(构建过程如图1所示)。然后将连接液用热激转化到感受态细胞大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir)。用涂布棒将转化菌悬液涂布于包含邻苯二酚(100 mg∙L-1)、卡那霉素(50 mg∙L-1)以及链霉素(50 mg∙L-1)的LB固体培养基上。在37 ℃条件下培养过夜，然后挑取淡黄色菌落即为阳性克隆大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O。将其扩大培养提取质粒，用C23O基因特异性引物进行PCR扩增，并测序检验目的基因存在，正向引物为5'-AGGTGWCGTSATGAAMA-AAGG-3'和反向引物为5'-TYAGGTSAKMACGGTCAKGAA-3'，PCR条件按文献中的方法[11]进行。

      图 1 重组载体pUTmini-Tn5-C23O构建过程

      图 1 重组载体pUTmini-Tn5-C23O构建过程

      Fig. 1 Construction process of recombinant vector pUTmini-Tn5-C23O

    • 1.4 三亲接合转化

      1.4

      按文献中的方法[12]，将供体菌S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O、辅助菌E .coli HB101(RK2013)、受体菌Pseudomonas sp. wp4在含有相应抗生素的LB液体培养基中培养8 h，然后将供体菌、辅助菌、受体菌按照3∶3∶2的比例混合后，30 ℃下10 000 r∙min-1离心3 min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次除去抗生素，加入200 µL LB液体培养基重悬，然后置于LB固体平板的细菌滤膜上。在30 ℃培养过夜，次日将菌体从平板上洗下，用1 mL生理盐水重悬混合液，然后稀释不同浓度，涂布于含有邻苯二酚100 mg∙L-1、卡那霉素50 mg∙L-1、以及链霉素50 mg∙L-1的LB选择性培养基平板上，筛选阳性克隆，并命名为wp4-C23O。

    • 1.5 工程菌鉴定

      1.5

      提取菌株wp4和工程菌基因组DNA，根据重组载体pUTmini-Tn5-C23O的km基因和C23O基因序列分别设计上游引物F：5'-GGCAGCGCAACGGAACATTCA-3'和下游引物R：5'-GACGAACCTGGTATGGATTT-3'，进行PCR扩增，产物预期长度为1 900 bp左右，检验2株菌基因组是否同时含有km基因和C23O基因，以此确定C23O基因是否插入受体菌Pseudomonas stutzeri wp4。PCR 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，60 ℃ 60 s， 72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 7 min。

    • 1.6 菌悬液配制

      1.6

      将LB培养基中菌株wp-4和工程菌的对数期菌液于2 mL无菌离心管中，在4 ℃下，10 000 r∙min-1离心1 min，弃上清液，用无机盐培养基洗涤3次，再用无机盐培养基制成OD600= 0.1菌悬液备用。

    • 1.7 芘降解率单因素实验

      1.7

      温度对芘降解率的影响。将二氯甲烷配置的芘标准液加入到pH为7.0的50 mL 无机盐培养基中，使其最终浓度均为50 mg∙L-1。在34 ℃下，140 r∙min-1摇床振荡24 h，待二氯甲烷挥发完全，然后在培养基中加入500 μL菌株wp4和工程菌株菌悬液，分别在28、31、34、37和40 ℃温度条件下，140 r∙min-1摇床振荡培养7 d，分别测定菌株芘降解率，实验重复3次。

      pH对芘降解率的影响。将二氯甲烷配置的芘标准液加入pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的50 mL无机盐培养基中，使其最终浓度均为50 mg∙ L-1。在34 ℃下，140 r∙min-1摇床振荡24 h，待二氯甲烷挥发完全，然后在培养基中加入500 μL菌株wp4和工程菌株菌悬液，在37 ℃下，140 r∙min-1摇床振荡培养7 d，分别测定菌株芘降解率，实验重复3次。

      菌株芘降解率测定按文献中的方法[13,14]进行，用紫外分光光度计测定242 nm波长下的吸光度值。芘标准曲线方程：y=0.172 72x+0.058 19(R2=0.999 32)。配制芘浓度为 50 mg∙L-1的无机盐液体培养基。将上述培养7 d的培养液，整瓶提取，用有机溶剂二氯甲烷振荡离心萃取 3 次，萃取液经无水硫酸钠过滤定容后，用紫外分光光度计分析。检测波长242 nm下吸光度值，根据标准曲线计算其降解率。

    • 1.8 数据处理

      1.8

      数据采用 Excel 2003 和 OriginLab OriginPro 8.6 进行处理和制图，运用SPSS 18.0 软件进行方差分析。

    • 2 结果与分析

      2

    • 2.1 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的筛选

      2.1

      将从含有邻苯二酚100 mg∙L-1、卡那霉素50 mg∙L-1以及链霉素50 mg∙L-1的LB选择性培养基筛选出的阳性克隆重复划线，观察生长状况，结果如图2所示。菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O生长良好，且出现淡黄色。这表明菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O初步构建成功。

      图 2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O筛选结果

      图 2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O筛选结果

      Fig. 2 Screening results of strain S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O

    • 2.2 菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的PCR鉴定

      2.2

      提取菌株S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O的质粒作为模板，用C23O特异性引物进行PCR扩增，验证阳性克隆大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O，结果如图3所示。PCR条带大小为900 bp左右，经测序与目的基因C23O序列一致，表明S17-1(λpir)-pUTmini-Tn5-C23O构建成功。

      图3 pUTmini-Tn5-C23O构建过程的电泳验证

      图3 pUTmini-Tn5-C23O构建过程的电泳验证

      Fig. 3 Electrophoresis map of construction process of pUTmini-Tn5-C23O

    • 2.3 工程菌构建验证

      2.3

      将受体菌Pseudomonas stutzeri wp4、供体菌大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1(λpir) pUTmini-Tn5-C23O以及E .coli HB101(RK2013)进行三亲和转化，然后在选择培养基上筛选得到阳性克隆子，即工程菌wp4-C23O。用特异性引物对菌株wp4和工程菌DNA基因组进行PCR扩增km基因和C23O基因，结果如图4所示。菌株wp4基因组同时不含km基因和C23O基因，工程菌基因组同时含km基因和C23O基因，且PCR产物大小为1 900 bp左右，与预期大小一致。这表明C23O基因经过转座子Tn5共同插入到受体菌Pseudomonas stutzeri wp4 DNA基因组上。

      图 4 km基因和C23O基因PCR 检测结果

      图 4 km基因和C23O基因PCR 检测结果

      Fig. 4 PCR results of km and C23O gene

    • 2.4 单因素实验

      2.4

    • 2.4.1 温度对芘降解率的影响

      2.4.1

      如图5所示，菌株wp4和工程菌wp4-C23O经过7 d培养，在一定范围内，随温度提高芘降解率增加，但在37 ℃以后，芘降解率下降，在37 ℃时，降解率达到最大。此温度下，菌株wp4和工程菌wp4-C23O芘降解率分别为71.75%、82.20%。在28、31、34、37和40 ℃时，工程菌比菌株wp4芘降解率有显著增加(P<0.05)。以上结果表明，在不同温度下，工程菌芘降解率显著高于菌株wp4(P<0.05)，降解率提高10.45%。

      图5 温度对芘降解率的影响

      图5 温度对芘降解率的影响

      Fig. 5 Effect of temperature on pyrene degradation rate

    • 2.4.2 pH对芘降解率的影响

      2.4.2

      如图6所示，菌株wp4和工程菌wp4-C23O经过7 d培养，在一定pH内，随pH升高，芘降解率增加，pH大于7.5之后，2株菌株芘降解率减小，最适pH为7.5，在此pH下，菌株wp4和工程菌芘降解率分别为71.42%、82.87%。当pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时，工程菌比菌株wp4芘降解率有显著增加(P<0.05)。在不同pH下，工程菌芘降解率显著高于菌株wp4(P<0.05)，降解率提高11.45%。

      图6 pH对芘降解率的影响

      图6 pH对芘降解率的影响

      Fig.6 Effect of pH on pyrene degradation rate

      目前，多数研究者通过选用合适的表达质粒将邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因与其连接，目的主要是提高该基因表达量。但是，质粒具有遗传不稳定的缺点，导致重组质粒可能丢失。而通过转座子将邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因插入到微生物基因组上，这在一定程度上提高了该基因遗传稳定性。谢云[12]通过转座子将具有PAHs降解特性的恶臭假单胞菌中邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因插入到烷烃降解菌BS3的DNA组上，构建出工程菌，验证了该菌株具有较高的遗传稳定性。本研究选用从克拉玛依石油污染土壤分离出的菌株Pseudomonas sp.wp4作为受体菌，该菌株对石油污染土壤中的PAHs具有较好的降解性，且普遍存在，甚至可以形成优势菌株。运用菌株Pseudomonas sp.wp4构建出的工程菌wp4-C23O对芘降解率显著高于菌株Pseudomonas sp.wp4，且高于其他芘降解菌[15,16,17,18,19]。菌株wp4、工程菌的最适pH、温度分别为7.5、37 ℃，表明工程菌经过基因组整合后的基本生长特性没有变化。因而，可以去除石油污染土壤中的PAHs。

    • 3 结论

      3

      1)通过三亲接合转化将C23O基因插入到降解多环芳烃优势菌株wp4基因组上，成功构建降解了多环芳烃的工程菌wp4-C23O。该工程菌具有实际应用的潜力。

      2)选择pH、温度为影响因素，对浓度为50 mg∙L-1的芘无机盐培养基进行了菌株wp4和工程菌wp4-C23O降解实验，结果表明：2株菌最适降解pH为7.5、最适温度为37 ℃。在此条件下，工程菌wp4-C23O対芘降解率显著高于wp4菌株，降解率提高11.45%。

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参考文献 (19)

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