Mainstream anammox coupled with multiple denitrification paths to treat municipal wastewater

反应器主体由有机玻璃制成，有效体积为50 L，各区域的体积比为1:4:6。厌氧池设置搅拌混合，好氧池通过空气泵可连续曝气，缺氧池则在反应器短程硝化驯化启动后增加束状纤维填料(填充比为25%)，以截留AnAOB，通过控制曝停比来维持填料表面的生物膜厚度及活性污泥混合。反应装置如图1所示。

反应器共运行164 d，分为3个阶段。阶段I(第1~59天)短程硝化驯化阶段；阶段II(第60~90天)AnAOB驯化阶段；阶段III(第91~164天)稳定运行阶段。阶段I采用提高好氧池曝气量(0.3~0.7 mL·min⁻¹)，控制好氧池DO<1.5 mg·L⁻¹，并调节外回流比进行AOB驯化；阶段II通过降低好氧池曝气量(0.7~0.4 mL·min⁻¹)，提高缺氧池曝停比(30 s/50 s~30 s/30 s)的方式使得NH₄⁺-N污染物更多由anammox途径去除，进行AnAOB活性驯化；阶段III则为稳定运行阶段，观察反应器应对进水水质波动的稳定性。运行条件如表1所示。

进水取自北京市通州区某污水处理厂的进水 (生活污水) 。运行期间进水水质指标为：COD 62~250 mg·L⁻¹、NH₄⁺-N 22~54 mg·L⁻¹、NO₂⁻-N 0~0.8 mg·L⁻¹、NO₃⁻-N 0.6~1.8 mg·L⁻¹、pH 7.4~7.8。

实验运行期间共接种2次污泥。第一次为反应器刚启动时，接种水厂好氧池活性污泥，接种后污泥质量浓度为3 260 mg·L⁻¹；第二次是第59天时，在缺氧区增设束状纤维填料的同时接种AnAOB颗粒污泥，接种量为3 L，原种泥污泥质量浓度为5 862 mg·L⁻¹。

常规检测指标(COD、NH₄⁺-N、NO₂⁻-N、NO₃⁻-N、MLSS)均采用国标法。NH₄⁺-N、NO₂⁻-N、NO₃⁻-N的质量浓度总和用总无机氮 (total inorganic nitrogen，TIN) 表示。DO和pH采用Multi 3 630 IDS WTW(德国)测定。每个实验阶段均留存污泥样品，置于-20 ℃环境中冷冻贮存，统一进行高通量测序。AnAOB代谢活性实验方法参考文献[13]进行测定。

在反应器运行过程中，NH₄⁺-N、COD、TIN及好氧池亚硝氮积累率(nitrite accumulation ratio，NAR)的变化情况如图2所示。在短程硝化驯化阶段(第1~59天)，反应器进水COD和NH₄⁺-N质量浓度分别由120 mg·L⁻¹上升至250 mg·L⁻¹、30 mg·L⁻¹上升至45 mg·L⁻¹。为应对进水负荷增大带来的冲击并强化AOB的活性，提高反应器外回流比和好氧池曝气量，好氧池DO由0.2 mg·L⁻¹提升至1.5 mg·L⁻¹。反应器COD降低了70%~80%，NH₄⁺-N去除率由30%增至80%，好氧池NAR为(60±10)%，这说明NOB活性成功被抑制，这与好氧池低DO控制与反应器缺氧/好氧分区有关。

首先通过控制低DO(0.2 mg·L⁻¹)条件，使得NOB活性受到抑制，NAR较高为65%。然而，同时NH₄⁺-N去除量仅为(3±1) mg·L⁻¹，AOB活性亦受到抑制，在进水负荷不断提高的条件下，短程硝化反应会成为anammox反应的限速步骤^[14]，需要提高AOB活性。在AOB、NOB活性均受抑制及进水负荷不断升高的条件下，提高污泥回流比有助于增强活性污泥抗冲击负荷能力。同时，基于低DO条件下AOB相较于NOB表现出更佳的氧亲和能力^[15]，逐步提高好氧池曝气量并维持低DO条件，可有利于AOB优先利用溶解氧，而比NOB增长优势更明显。随着曝气量逐步提高至0.7 mL·min⁻¹，污泥回流比升高至150%，好氧池DO上升至1.5 mg·L⁻¹, NH₄⁺-N去除量上升至(12±1) mg·L⁻¹，AOB活性亦升高。同时，NAR能稳定维持在50%，NOB活性仍受到抑制。本研究将好氧池DO控制为1.5 mg·L⁻¹，这明显高于短程硝化控制DO阈值(0.5~1 mg·L⁻¹)，但仍能维持较高NAR。这可能是由于本研究采取厌氧-好氧-缺氧推流式反应器，在后端设置缺氧区能提供瞬时缺氧环境，从而有助于抑制NOB酶活性而对AOB影响不大。同时，在缺氧环境进入好氧环境后，AOB能优于NOB优势增长^[16-17]。这与文献[18-19] 报道的较高缺氧时间/好氧时间(T_缺氧/T_好氧)可促进亚硝酸盐累积一致。因此，本研究中反应器缺氧区与好氧分区体积比为7:4及低DO条件有助于NOB的抑制。在驯化阶段末期，出水COD和NH₄⁺-N质量浓度分别为(38±2) mg·L⁻¹和8 mg·L⁻¹，且AOB有较好的活性，能满足后端AnAOB启动条件。

第II阶段(第60~90天)，在缺氧区投加填料并接种AnAOB种泥，通过降低好氧池曝气量，提高缺氧池曝停比进行anammox启动驯化。该阶段反应器进水C/N与上一阶段相同，驯化期间COD稳定降低了80%，NH₄⁺-N去除率则上升至90%，同时TIN去除率上升至70%~80%，出水TIN为(11±2) mg·L⁻¹ ，低于上一阶段出水TIN(17±3) mg·L⁻¹。这可能是反应器接种了AnAOB之后，发生了部分anammox反应，使得在与上一阶段相同C/N条件下，NH₄⁺-N及TIN去除率均上升。然而，驯化期间NAR下降至20%~40%，这可能是由于通过降低好氧池曝气量，提高缺氧池曝停比，维持缺氧池DO为0.3~0.5 mg·L⁻¹，可为缺氧池提供了合适anammox驯化启动条件。在缺氧池中，NH₄⁺-N可被AOB及AnAOB去除，从而提高了NH₄⁺-N去除率，使得缺氧池出水剩余NH₄⁺-N质量浓度小于5 mg·L⁻¹。低剩余NH₄⁺-N质量浓度会减弱AOB与NOB对O₂的竞争，以及AnAOB与NOB对NO₂⁻-N的竞争，从而有助于NOB活性的表达^[20]。文献[21-22]表明在剩余NH₄⁺-N质量浓度小于5 mg·L⁻¹时，出现了NOB的增长，使得推流式反应器中NAR下降。

第III阶段(第91~164天)，为减少好氧池NAR下降带来的不利影响，该阶段通过降低好氧池曝气量，来增加缺氧池中进水NH₄⁺-N质量浓度。结果表明：该阶段好氧池NAR维持在20%~40%，进水C/N由4.5:1降至2:1，NH₄⁺-N去除率>95%，TIN去除率维持在80%~85%，出水TIN小于6 mg·L⁻¹。在传统硝化反硝化脱氮工艺中，该C/N条件下较难实现出水TN达标(一般C/N大于5时，反硝化作用发挥比较明显)^[23]。这表明该反应体系的AnAOB在总氮脱除中发挥了重要作用，使得出水TIN较低。这也说明本反应器在应对低C/N废水及NAR下降的情况下，对TIN仍有较稳定地去除，可实现出水TIN小于6 mg·L⁻¹。

反应器于第59天接种了AnAOB种泥。由于填料具有良好的吸附作用使得AnAOB在缺氧区富集和停留。为降低NAR下降带来的不利影响，增加AnAOB富集区的进水基质，通过降低好氧池的曝气量、提高缺氧池曝停比的方式进行好氧池/缺氧池NH₄⁺-N去除负荷分配，结果使得缺氧池NH₄⁺-N去除量与好氧池NH₄⁺-N去除绝对量比值由0.5提高至3，结果如图3所示。图2(c)表明，驯化期间(第60~90天)至稳定运行期间(第91~164天)工艺进水C/N不断下降，但出水TIN却由(11±2) mg·L⁻¹降至小于6 mg·L⁻¹，并能维持稳定运行。这可能是由于缺氧池束状纤维填料富集并停留AnAOB，通过增加缺氧池NH₄⁺-N负荷，让更多进水NH₄⁺-N经由anammox途径去除，从而获得在较低C/N的进水基质条件下的高效脱氮。

在该反应体系中，NH₄⁺-N主要由好氧池及缺氧池去除。好氧池与缺氧池NH₄⁺-N去除量、NO₃⁻-N生成量及COD降低量如图4所示。

图4(a)表明，好氧池COD去除量维持在(15±5) mg·L⁻¹，可生化性有机物在好氧池中进一步去除，可减弱缺氧池中有机物对AnAOB的影响。在驯化期间不断降低好氧池曝气量，使得好氧池NH₄⁺-N去除量由(12±1) mg·L⁻¹降至(5±1) mg·L⁻¹。同时，NO₃⁻-N生成量由(5±2) mg·L⁻¹降至(2±1) mg·L⁻¹，通过降低好氧池的NH₄⁺-N去除量减弱了NAR下降带来体系中NO₃⁻-N质量浓度升高的影响，使更多的NH₄⁺-N进入缺氧池。实验期间通过调节曝停比将体系中DO维持在0.3~0.5 mg·L⁻¹，缺氧池的NH₄⁺-N去除量由驯化期间(6±2) mg·L⁻¹上升至稳定运行期(13±1) mg·L⁻¹，而缺氧池NO₃⁻-N生成量始终低于0.5 mg·L⁻¹，低于anammox反应生成NO₃⁻-N的理论生成量0.6~1.5 mg·L^−1[24]。这说明体系中存在一定反硝化反应^[25]，但是该反应区∆COD<5 mg·L⁻¹，远低于传统反硝化脱氮所需碳源理论值^[23]。因此，在缺氧池中可能存在anammox和反硝化2种脱氮途径。因此，通过优化NH₄⁺-N负荷分配，可提高缺氧池NH₄⁺-N去除量，让更多的NH₄⁺-N经由anammox途径去除，可在更低C/N条件下，减少NO₃⁻-N生成量，从而形成低TIN出水。

为分析缺氧池污泥中anammox代谢活性，在稳定运行期取缺氧池污泥进行批次实验，同时取2份等量缺氧池污泥做空白实验。空白实验即分别观察NH₄⁺-N与NO₂⁻-N随时间的变化情况，方法与anammox代谢活性实验相同^[13] 。 NH₄⁺-N和NO₂⁻-N随时间变化情况如图5所示。

图5(a)表明NH₄⁺-N与NO₂⁻-N质量浓度在240 min时分别下降了3.2 mg·L⁻¹和4.9 mg·L⁻¹，这可能是由于污泥自身吸附作用导致的。而图5(b)表明NH₄⁺-N与NO₂⁻-N质量浓度均随时间以更快速率下降，在240 min时分别下降14 mg·L⁻¹和28 mg·L⁻¹，其中ΔNO₂⁻-N/ΔNH₄⁺-N=2，高于anammox反应的理论值1.32。这说明体系中anammox具有较高的代谢活性，且同时存在反硝化反应，较直接地证明主流程中anammox在氮去除中发挥的重要作用。

除上述对缺氧池中anammox代谢活性分析外，本实验也对缺氧池中微生物群落结构进行解析。图6为驯化阶段(第78天)和稳定运行阶段(第132天)基于属水平的高通量测序结果。

高通量测序结果表明，被检测到的AnAOB菌属主要为Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia，这与文献[26]所报道的市政污水主流程工艺中所发现的AnAOB菌属相一致。在驯化阶段及稳定运行阶段中AnAOB菌属的相对丰度分别为1.6%和1.8%，稳定运行阶段该菌属的相对丰度有所上升，这主要得益于增大缺氧池进水NH₄⁺-N负荷的调控手段，使AnAOB可利用的基质增加，从而提高该菌属的相对丰度。这说明在稳定运行阶段，该系统在低C/N条件下仍能实现稳定低TIN出水的主要原因是大部分NH₄⁺-N经由anammox反应去除。

然而，体系中主要的反硝化菌属Denitratisoma的相对丰度由驯化期间的15%下降至稳定运行期间7.7%。这可能是由于缺氧池中COD变化量小于5 mg·L⁻¹(如图4(b))，无法满足反硝化的需求，使得Denitratisoma相对丰度降低。根据Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia相对丰度升高，Denitratisoma相对丰度降低。这说明AnAOB相对于反硝化菌能优势竞争NO₂⁻-N^[27]。而低COD去除量易使反硝化菌还原NO₃⁻-N至NO₂⁻-N阶段，减弱NO₂⁻-N进一步还原^[25]。这说明在缺氧池有短程反硝化反应发生^[28-29]，通过短程反硝化反应产生NO₂⁻-N，被AnAOB优势竞争，最终使得NO₃⁻-N生成量低于PN-A反应的理论值。

另外，Nitrosomonas是被检测到的AOB菌属，Nitrospira是被检测到的NOB菌属。在这2个阶段中，Nitrosomonas相对分度分别为0.67%和0.61%，Nitrospira的相对丰度则分别为0.1%与0.14%，Nitrosomonas相对丰度有所降低，Nitrospira的相对丰度有所升高，这易导致NAR下降。但总体而言，Nitrospira的相对丰度始终低于Nitrosomonas相对丰度，NOB活性仍然受到抑制。这说明体系中可能发生短程硝化作用从而产生NO₂⁻-N。反应体系中缺氧池DO较低(0.3~0.5 mg·L⁻¹)，使AOB能优势竞争DO而抑制NOB，为厌氧氨氧化反应提供NO₂⁻-N。

上述结果说明，在缺氧池的DO为0.3~0.5 mg·L⁻¹条件下，Nitrosomonas、Denitratisoma、Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia等优势菌属得以共存，缺氧池存在anammox以及反硝化等多种脱氮途径，使得NO₃⁻-N生成量较低。

1) 反应器中缺氧区和好氧区的体积比为7:4，好氧池DO约1.5 mg·L⁻¹，能实现短程硝化(NAR为50%)，同时通过调控缺氧池NH₄⁺-N负荷和低溶解氧条件，DO为0.3~0.5 mg·L⁻¹，可使该工艺在低C/N进水条件下，实现TIN去除率为80%~85%。

2) 在稳定运行阶段，缺氧池∆NH₄⁺-N为(13±1) mg·L⁻¹，∆COD<5 mg·L⁻¹，∆NO₃⁻-N<0.5 mg·L⁻¹。这表明缺氧池存在anammox及反硝化反应，且anammox在主流程工艺中发挥了重要作用。

3) 在缺氧段检测到AnAOB菌属Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia作为优势种群存在，从微观角度可以证明主流程anammox反应的宏观效能。同时，检测到的反硝化菌属Denitratisoma等进一步表明该工艺中可能存在anammox、短程硝化和反硝化等多种脱氮途径，有利于在低碳氮比条件下实现TIN的深度脱除。