Operation characteristics and microbial community of modified UNITANK process in winter

苏州某城市污水处理厂主要接纳生活污水，设计规模1.2×10⁵ t·d⁻¹，采用4组改良型UNITANK工艺。改良型UNITANK出水依次进入高效沉淀池、气水反冲洗滤池、紫外线消毒池，出水执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A标准。改良型UNITANK工艺冬季进、出水水质如表1所示，冬季出水水质波动较大，运行稳定性仍有待进一步提高。

每组改良型UNITANK工艺分隔成5格顺序连通的矩形反应池，分别为1个厌氧池F，1个缺氧池E、1个连续好氧池A、2个边池B和C(图1)。每组平面尺寸为89.85 m×44.85 m，有效水深7.50 m。平均水力停留时间23.72 h，厌氧、缺氧、好氧、边池停留时间分别为1.32、5.63、3.36、13.41 h。厌氧池F与缺氧池E、连续好氧池A与边池之间通过隔墙底部开孔水力连通；缺氧池E至连续好氧池A、缺氧池E到厌氧池F通过泵强制实现混合液流动；边池到缺氧池E通过边池末端底部闸阀控制；剩余污泥由边池两侧的剩余污泥泵定期排放。

改良型UNITANK工艺运行周期为 8 h。上半周期(0~3 h)：污水依次进入厌氧池F、缺氧池E、连续好氧池A和边池B(边池B作为曝气池)，边池C作为沉淀池(不曝气)，出水从边池C通过空气堰排出，剩余污泥从边池C通过泵排放。过渡周期(3~4 h)：边池B停止曝气，转换为沉淀模式。污水仍依次进入F、E、A、B，出水从边池C流出。下半周期与上半周期的运行完全一致，通过过渡周期进行衔接。下半周期(4~7 h)： B池和C池功能互相转换，边池B作为沉淀池，出水从边池B通过空气堰排出，边池C作为曝气池。过渡周期(7~8 h)：边池C停止曝气，转换为沉淀模式。

2020年2月中旬取自改良型UNITANK工艺曝气池末端活性污泥，取3个平行样(标记为M1、M2、M3)，以代表系统经过冬季低温后微生物群落的分布特征。样品经过30 min静置并离心(4 ℃、8 000 r·min⁻¹、5 min)后保存于−20 ℃冰箱内，用于后续的分子生物学测定。

DNA提取采用PowerSoil® DNA Isolation Kit试剂盒，提取后经1%琼脂糖凝胶电泳检测条带完整性。PCR扩增所用引物为338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。反应体系为20 μL，PCR扩增管中添加DNA模板10 ng，正反向引物各0.8 μL，灭菌水20 μL，d NTP 2 μL，缓冲液4 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL。PCR反应程序：首先95 ℃预变性3 min，然后进行27个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸10 min。扩增结束后，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果表明，PCR产物条带大小正确，浓度合适，可进行后续实验，委托美吉生物进行Illumina MiSeq高通量测序。

高通量测序获得的原始序列数据经过质控过滤后得到高质量数据，采用USEARCH进行OTU聚类分析，通过贝叶斯算法在97%相似水平对OTU进行物种分类学注释。基于OTU数据，对反映微生物群落丰富度(Sobs, Chao, ACE指数)和多样性(Simpson, Shannon指数)的参数进行统计。

氨氮采用纳氏试剂分光光度法测定；${\rm{NO}}_3^ -$-N采用麝香草酚分光光度法测定；TN采用TOC-VCPN总氮测定仪测定；${\rm{PO}}_4^{3 - }$-P采用钼锑抗分光光度计法测定；TP采用钼酸铵分光光度法测定；SS采用重量法测定；COD采用重铬酸钾法测定；DO和温度由德国WTW multi3420测定仪在线监测。

以BioWIN软件为平台，选择ASM2D模型为核心机理描述生物碳、氮、磷的去除过程。采用1个非曝气完全混合反应池(CSTR)模拟厌氧池F，4个非曝气CSTR(缺氧池E-1、E-2、E-3、E-4)串联模拟缺氧池E，3个曝气CSTR的串、并联模拟连续好氧池A，5个等体积SBR(边池B-1、B-2、B-3、B-4、B-5/边池C-1、C-2、C-3、C-4、C-5)串联模拟边池B/C的运行，通过分离器的控制实现2组边池的交替运行。

采用该厂改良型UNITANK工艺中2组冬季历史数据进行模型校准和验证，通过调整进水有机物组分(表2)和氨氧化菌最大比生长速率(由默认值0.9 d⁻¹校准为0.7 d⁻¹)，改良型UNITANK出水中COD、氨氮、TN、TP、SS模拟值和实测值的绝对误差分别为4.7、1.1、1.6、0.3、2.1 mg·L⁻¹；同时，改良型UNITANK工艺沿程氨氮、${\rm{NO}}_3^ -$-N、溶解性磷酸盐(${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P)模拟值与实测值的变化趋势拟合基本一致(图2(b))，因此，经校准后的模型可以反映该厂改良型UNITANK工艺生物碳、氮、磷的去除过程。

采用经校准和验证后的模型为工具，模拟冬季低温(12 ℃)条件下，在1个运行周期内，改良型UNITANK沿程氨氮、${\rm{NO}}_3^ -$-N、${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P的变化如图2所示。当边池B处于曝气第2 h时，分别采集改良型UNITANK工艺中厌氧池F、缺氧池E沿程、连续好氧池、边池B首端、中端和末端的水样，以确定工艺沿程氨氮、${\rm{NO}}_3^ -$-N、${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P实测值的变化。

由图2(a)可知，在上半周期边池B曝气第1 h，污水首先流入厌氧池F，并与从缺氧池E首端回流的混合液混合，在厌氧池F内利用搅拌形成局部污泥负荷较高的区域，促进磷的释放，因此，厌氧池F内${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P升高至13.4 mg·L⁻¹。受边池B到缺氧池E混合液回流的稀释作用影响，氨氮和${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P在缺氧池首端(缺氧池E-1)迅速下降到8.9 mg·L⁻¹和5.4 mg·L⁻¹。整个缺氧池E内的水流呈推流状态，在水流的推动作用下，缺氧池沿程氨氮和${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P逐渐升高至9.6 mg·L⁻¹和15.6 mg·L⁻¹，而沿程${\rm{NO}}_3^ -$-N基本维持在0.2 mg·L⁻¹以下。模拟结果表明，改良型UNITANK工艺冬季反硝化彻底。该工艺沿程实测结果(图2(b)) 验证了这一结论。由于反硝化充分，聚磷菌在缺氧池内进行了有效释磷，同时部分有机氮发生了水解，导致${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P、氨氮在缺氧池E沿程升高。在上半运行周期，连续好氧池A和边池B均为曝气池，因此，A、B曝气池沿程氨氮逐渐降低至3.3 mg·L⁻¹，相应${\rm{NO}}_3^ -$-N升高至1.9 mg·L⁻¹，${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P降低到0.3 mg·L⁻¹，曝气池内发生了硝化和吸磷过程。

当边池B处于曝气第2、3 h及沉淀阶段，沿程氨氮、${\rm{NO}}_3^ -$-N和${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P变化趋势(图2(b)~(d))与曝气第1 h相同，但随着曝气时间的延长，沿程氨氮、${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P逐渐下降。在曝气第3 h，边池B末端(B-5)氨氮接近0 mg·L⁻¹，表明此区域氨氮已彻底转化为${\rm{NO}}_3^ -$-N；但此时，边池B前端(B-1)和中段(B-3)氨氮仍高于5 mg·L⁻¹。改良型UNITANK工艺边池沿程均匀曝气，沿程DO分布是曝气量、污染物浓度共同作用的结果。在边池的推流作用下，边池B首端和中段污染物浓度较高，在整个曝气过程中，边池B首端和中段的DO始终保持在0.9~1.5 mg·L⁻¹，末端DO达到1.5~3.5 mg·L⁻¹，因此，均匀曝气导致了边池前端及中段DO偏低，边池末端DO偏高，从而导致上半周期内边池首端和中段的硝化不充分。

当工艺进入下半周期，边池B切换为沉淀池，边池B末端通过空气堰出水，改良型UNITANK出水氨氮、${\rm{NO}}_3^ -$-N、${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P变化规律如图3所示。在4 h的出水周期内，出水氨氮、${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P逐时升高，出水${\rm{NO}}_3^ -$-N逐渐降低。出水水质的波动特征主要受上半周期边池B沿程污染物分布影响，在边池水流推动作用下，在接下来的出水周期(4 h)内，出水氨氮由3.0 mg·L⁻¹逐渐升高到5.6 mg·L⁻¹，出水${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P升高到0.6 mg·L⁻¹。因此，边池均匀曝气是导致改良型UNITANK工艺冬季出水水质波动大的主要原因。针对推流式边池，加大边池前端的曝气量，同时适当削弱后端曝气量可作为改进措施以解决这一问题。

1)多样性分析。污水厂改良型UNITANK工艺冬季活性污泥微生物群落的多样性指数见表3所示。3组污泥样品的有效序列为43 774~43 967，经抽平处理后，3组样品的有效序列标准化至43 774。在97%的相似水平上，覆盖率均高于98%，表明本次测序相对于整体样本的覆盖程度极高，测序结果能够较准确地反映改良型UNITANK内冬季的生物特性。3组污泥样品中的Sobs指数为2 017~2 106，略高于张晓红等^[14]和韩文杰等^[15]的研究结果。张晓红等^[14]针对京津冀地区市政污水厂活性污泥种群结构研究发现，5个污水厂AO或AAO工艺中的Sobs指数在1 006~1 965。韩文杰等^[15]在长三角地区污水厂低温季节微生物多样性分析中指出，5个污水厂AAO及其变形工艺中Sobs指数为1 014~1 782。因此，该污水厂改良型UNITANK的微生物多样性较高。与张晓红等^[14]和韩文杰等^[15]对国内其他污水厂的研究结果相比，该厂3组样品的Shannon指数、ACE指数和Chao指数属于较高水平，Simpson指数显著低于文献报道^[14-15]的平均水平，证实了生物多样性在改良型UNITANK工艺中较高。ZHANG等^[16]提出，进水水质差异是导致系统内微生物多样性的关键因素。而SEIB等^[17]发现，除了进水水质，反应器结构也会对污泥群落结构产生影响。本研究中的污水厂进水水质为典型的城市污水，与张晓红等、韩文杰等^[14-15]研究的污水厂进水水质处于类似水平。因此，导致该系统生物多样性较高的原因可能与改良型UNITANK独特的工艺运行方式有关，边池交替式的运行控制模式导致微生物多样性较高。郑向阳等^[18]发现，微生物多样性与运行条件有关，同一进水条件下，缺氧段多样性明显高于好氧段。彭永臻等^[19]在对城市污水处理厂生物脱氮污泥菌群结构分析中发现，更为复杂的运行方式会导致污水处理系统中生物多样性更高。

2)物种组成分析。在门水平上，3组污泥样品共检测到48个门，其中，有9种物种的丰度高于1%。由图4可以看出，Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes、Firmicutes是3组污泥样品中的主要优势菌群，其总相对丰度达到82.73%~84.76%，与文献报道^[14-15]的城市污水厂活性污泥系统中门水平上的微生物组成结论一致。其中，Proteobacteria是样品中丰度最高的菌门，其相对丰度达到25.40%~29.65%；Actinobacteria、Chloroflexi相对丰度分别为15.89%~17.04%、10.31%~14.50%。Proteobacteria和Actinobacteria是生物脱氮除磷和异养生物降解的主要微生物，而Chloroflexi在功能上多与生物除磷有关。王思佳等^[20]的研究表明，以乙酸钠为碳源时，会促进Bacteroidetes含量上升。因此，3组污泥样品中门水平上的优势菌群均与生物脱氮除磷功能有关。

在属水平上丰度高于2%的微生物的分析表明，Caldilineaceae、Saprospiraceae、Trichococcus是优势菌属，其相对丰度分别可达3.41%~4.87%、4.83%~5.40%、4.55%~5.52%。 张朝升等^[21]的研究表明，Saprospiraceae是以亚硝酸盐为电子受体的反硝化除磷系统中的优势菌种。徐伟峰等^[22]的研究表明，延长泥龄，反硝化除磷对系统除磷所起的作用增强。该厂改良型UNITANK工艺冬季的泥龄控制在20 d左右，为Saprospiraceae的生长提供了良好的条件。因此，改良型UNITANK可能存在反硝化除磷现象。有研究^[14-15]表明，除了Saprospiraceae，Pseudomonas和Candidatus_Accumulibacter也是污水处理系统中常见的聚磷菌。本研究中，Pseudomonas和Candidatus_Accumulibacter在3组污泥样品中的丰度分别为0.03%~0.05%和0.03%~0.04%，显著低于Saprospiraceae的丰度。Defluviicoccus、Micropruina属于常见的聚糖菌属，在厌氧段会与聚磷菌竞争碳源，从而导致生物除磷效果恶化，这2种菌属在改良型UNITANK工艺冬季污泥样品中的相对丰度仅为0.16%~0.21%、0.51%~0.56%，表明聚糖菌所占比例较低，这与目前的普遍研究结论^[13]一致，即在低温条件下，聚磷菌更具竞争优势，而当温度高于20 ℃，聚糖菌的生长占优势。

Nitrosomonas为氨氧化菌(AOB)优势菌属，其功能是将氨氮转化为亚硝酸盐，该菌属在改良型UNITANK工艺内所占比例为 0.31%~0.45%。Nitrospira为亚硝酸盐氧化菌(NOB)优势菌属，其作用是将亚硝酸盐转化为硝酸盐，该菌属所占比例为0.41%~0.60%。在污水处理系统中，常见的NOB菌属包括Nitrospira和Nitrobacter^[23]。然而，在改良型UNITANK工艺冬季3组污泥样品中均未检测出Nitrobacter。已有研究^[24]表明，Nitrobacter生长速率高，但与底物之间的亲和能力弱，适合生长于基质充足的环境；Nitrospira的生长速率仅为Nitrobacter的1/3，但Nitrospira对基质亲和力更大。因此，在氨氮浓度较低的城市污水处理系统中Nitrospira更具优势。韩文杰等^[15]针对长三角地区5座污水厂低温季节微生物检测结果中也指出，在活性污泥系统中Nitrospira为NOB优势菌，相对丰度达0.25%~3.06%，未检测到Nitrobacter。张晓红等^[14]在京津冀区域5座城市污水厂的微生物检测中虽发现了Nitrobacter的存在，但其丰度远低于Nitrospira。

1)改良型UNITANK工艺冬季反硝化充分，均匀曝气导致边池前端和中段硝化不充分，在边池的推流作用下，出水氨氮、${\rm{SPO}}_4^{3 - }$-P逐时升高。边池均匀曝气是导致改良型UNITANK工艺冬季出水水质波动的主要原因，加大边池前端的曝气量，同时适当削弱后端曝气量可作为解决这一问题的措施。

2)改良型UNITANK工艺冬季微生物多样性较高，可能与独特的工艺运行方式有关。Saprospiraceae是优势菌属，其相对丰度可达4.83%~5.40%，工艺内可能存在反硝化除磷现象。Defluviicoccus和Micropruina 2种聚糖菌属的相对丰度仅为0.16%~0.21%和0.51%~0.56%。

3) Nitrosomonas、Nitrospira分别为AOB、NOB的优势菌属，其在改良型UNITANK工艺中的相对丰度分别为0.31%~0.45%、0.41%~0.60%，这2类菌属主要完成了冬季改良型UNITANK工艺脱氮功能。