Purification efficiency of Takifugu obscurus aquaculture tail water by combination of photosynthetic bacteria and aquatic plants

实验所用菌株为市售生产用的光合细菌(Photosynthetic bacteria)，由江苏省兴化市恒威生物技术有限公司提供：光合细菌，荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)，液体状，活菌量为2×10⁸ CFU·L⁻¹；实验所用凤眼莲(Eichhornia crassipes)和狐尾藻(Myriophyllum verticillatum)均采购于杭州市水草市政园林绿化工程有限公司，蕹菜(Ipomoea aquatica)采自本研究所奉贤科研基地4号塘蕹菜养殖区，选取植株健壮且长势一致的蕹菜进行移栽培养。凤眼莲为浮水植物，俗称水葫芦，雨久花科凤眼莲属，是世界上公认的富集水体氮磷能力最强的水生植物之一；狐尾藻为多年生沉水植物，小二仙草科(Haloragaceae)狐尾藻属，常被作为污水处理及生态修复过程中首选的重要植物之一；蕹菜为一年生挺水植物，俗称空心菜，旋花科番薯属，有很强的耐高温和耐污性能。实验之前，先将3种水生植物暂养于陆基温室水泥池内，以备实验所用。

本实验所用养殖尾水为上海市水产研究所奉贤科研基地(30°51′21″N，121°44′11″E) (以下简称奉贤科研基地)内的暗纹东方鲀养殖池塘的清塘尾水，池塘养殖面积约1 200 m²，平均水深1.5 m。养殖从2018年5月底开始至8月底结束，共计90 d，养殖鱼种为暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)，初始平均体质量为5.56 g，共4 488尾。养殖所用暗纹东方鲀均来自本研究所奉贤基地，于2018年5月经全人工集约化繁育并用鳗鱼配合饲料经过室内驯化(驯化率90%以上)培育而成的。养殖所用饲料为鳗鱼粉状配合饲料，购自江苏常熟市泉兴营养添加剂有限公司。饲料加工成团块状，现投现做，每天09:30投喂1次，日投饲量为暗纹东方鲀鱼体质量的1%~4%，以池塘中暗纹东方鲀当天下午15:00摄食完为准，具体投喂量根据天气和水温适当增减，阴雨天和低温天气少投喂，晴天多投喂。养殖过程中每2周换水1次，每次换1/3。养殖用水是经过60目(孔径250 μm)筛绢网过滤的内河水。池塘具有独立进排水设施，装配1台1.5 kW的叶轮增氧机。养殖期间，每天晚上18:00点开增氧机，第2天早上06:00关增氧机(阴雨天气，适当调整开机时间)，水体为自然水温22.6~30.6 ℃，DO不低于7.26 mg·L⁻¹，养殖过程中鱼体生长良好。

1)实验方法与设计。养殖结束后，在奉贤科研基地卤虫孵化塑料大棚内进行养殖尾水的净化实验，将实验水泥池(长100 cm×宽100 cm×高105 cm)消毒清洗干净后，将养殖池塘中的暗纹东方鲀全部拉出，池塘排水，将最终的清塘尾水充分混匀，利用配管内径102 mm的QY65-7-2.2型潜水电泵，将其注入实验池内至70 cm处。分别选取生长良好的凤眼莲(A1)、蕹菜(A2)和狐尾藻(A3)成熟植株，同一植物统一修剪至尺寸一致，清洗干净后种植于实验池浮床网片上。本实验采用相同的自制浮床网片(图1)固定水生植物，按照水泥池的长宽，利用直径1.5 cm的竹竿和网目2.0 cm的聚乙烯网片制成50 cm×50 cm的正方形浮床网片。将浮床网片放入水面中间，将凤眼莲、蕹菜和狐尾藻按照等距平均插入网眼中。光合细菌(P)使用前需进行培养活化，光合细菌使用时需先将光合细菌和培养基放入盛水的白色透光塑料桶中不停搅拌混匀，后密封并放入持续光照条件下培养3 d，制成光合细菌浓度约为5×10⁸ CFU·mL⁻¹。

实验设4个处理组(P、PA1、PA2、PA3)和1个对照组(CG，无光合细菌和水生植物)，每组设置3个平行，共15个实验池。其中，各平行中水生植物的初始量均是300 g，光合细菌浓度均为5×10⁸ CFU·mL⁻¹。实验在透明温室大棚内进行，实验期间在每个水泥池内微曝气，水体温度控制在(26.4±2.6) ℃，每次采样前补充由于蒸发而丧失的水分，补充蒸馏水至初始高度，实验周期为21 d。

2)水样采集与测定方法。实验开始后每3 d (3、6、9、12、15、18、21 d)采样1次，每次在水泥池的同一位置离水面20 cm处取样500 mL。水样采集后存于4 ℃冰箱，并在2 d内完成水质指标测定。其中的200 mL水样用于总固体悬浮物(TSS)测定，剩下水样用于总氨氮(TAN)、亚硝基氮(${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N)、硝基氮(${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N)，化学需要量(COD_Mn)、总氮(TN)和总磷(TP)测定。

本实验测定指标和方法^[16]如下：TAN测定采用苯酚-次氯酸盐法；${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N测定利用重氮-偶氮比色法；${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N测定利用锌镉还原-重氮偶氮法；TN测定采用碱性过硫酸消解紫外分光光度法(GB 11894-1989)；TP测定采用钼酸铵比色法(GB 11893-1989)；COD_Mn测定采用碱性高锰酸钾法，TSS采用滤纸重量法(GB 11901-1989)。温度(T)、酸碱度(pH)均采用美国产YSI仪器即时测定。光合细菌计数采用平板计数法。

应用Excel2007整理实验数据，利用SPSS17.0软件对不同组合间水质指标进行单因素One-way ANOVA方差分析及Duncan氏法多重比较，所得结果以平均值±标准差(mean±SD)来表示，且P<0.05表示差异显著。水生植物的相对生长速率^[10]按照式(1)进行计算，水体中各指标去除率按照式(2)进行计算。

式中：R_GR为植物的相对生长速率，%·d⁻¹；B₀和B_t分别为实验开始和结束时植物的总生物量，g；t为实验周期，d。

式中：W_i为第i天的去除率；C_i为第i天的浓度，mg·L⁻¹；C₀为初始浓度，mg·L⁻¹。

本实验所用清塘尾水的初始参数指标为：pH=7.12±0.03、TAN (0.335±0.069) mg·L⁻¹、${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N (0.824±0.078) mg·L⁻¹、${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N (3.280±0.293) mg·L⁻¹、COD_Mn (9.141±0.098) mg·L⁻¹、TSS (110.40±31.13) mg·L⁻¹、TN (7.317±0.243) mg·L⁻¹和TP (1.348±0.048) mg·L⁻¹，其中TAN、${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N、${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N、TSS、TN和TP浓度均大于《淡水养殖尾水排放要求》(SC/T 9101-2018)的二级排放标准，严重超标。但pH和COD_Mn均符合其要求的一级排放标准(pH为6.0~9.0，COD_Mn小于或等于15 mg·L⁻¹)。

由表1可见，实验结束后，各组中凤眼莲(A1)、蕹菜(A2)和狐尾藻(A3)的生物量均明显增加，A1和A2的生物量均已翻倍。其中，A2的生物量显著大于A1(P<0.05)，A1显著大于A3(P<0.05)。A1和A2的相对生长率均显著大于A3(P<0.05)，但两者间无明显差异(P>0.05)。这可能与蕹菜和凤眼莲具有发达的根系有关，发达根系更有利于吸收水体中的营养物质^[17]，从而促进其快速生长。其中生长最快的是蕹菜，相对生长率为4.61%，其次为凤眼莲，狐尾藻生长最慢。陈双等^[18]利用水生植物类型及生物量对污水处理厂尾水净化效果的影响进行研究，结果表明，不同生物量对空心菜生长存在明显影响，空心菜前期在未达到最大生物量880 g前生长较快。这与本实验结果蕹菜生长迅速，且结束生物量均未达到880 g相一致。因此，建议在选择蕹菜净化水质时，要及时对其进行采摘，以确保其在最好的生长状态，达到最佳的净化效果。

在水产养殖过程中，总氨氮是评价养殖尾水排放标准的重要参数指标，当水中含量大于0.50 mg·L时，对鱼体有毒害作用^[19]。图2(a)显示了TAN浓度的变化情况。实验开始后，各实验组中TAN浓度迅速降低，并均在9 d后逐渐趋于稳定；而对照组TAN浓度降低缓慢，在15 d后趋于稳定；至实验结束时，各组之间TAN的去除率均无明显差异(P>0.05) (表2)。这表明光合细菌与水生植物联合去除TAN的速度均快于对照组，但去除率均未产生显著差异。其原因可能是：一方面栽种的水生植物可直接吸收水体中的氨氮，但由于水生植物或光合细菌未达到一定数量时，对氨氮的净化效果未产生显著差异；另一方面，水体中氨氮存在氨化和同化作用以及氨态氮的挥发而导致实验组和空白组的去除率差异不显著。李文祥等^[12]研究浮床水蕹菜对养殖水体中营养物的去除效果发现，水蕹菜池塘与对照塘中的氨氮没有明显差异。陈双等^[18]利用水生植物类型及生物量对污水处理厂尾水净化效果的影响进行研究发现，不同类型植物对氨氮的净化效果(30 d)无显著差异。这均与本研究结果相似。

图2(b)中显示${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N浓度的变化情况。光合细菌和水生植物组合对${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N的去除速度较快，在第6天时迅速降至最低，并趋于稳定。对照组因水体中本身存在的微生物和消化-反硝化作用也逐渐降低，但明显慢于实验组。实验结束时，PA1、PA2和PA3组对${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N的去除率均显著大于P组和对照组(P>0.05)，均大于99.60%，而3者间均无明显差异(P<0.05) (表3)。这表明在光合细菌处理尾水时，栽种水生植物对去除尾水中亚硝基氮具有显著促进作用。造成此结果的原因是，光合细菌与水生植物净化养殖尾水可形成协同作用，光合细菌可把亚硝基和有机氮转化成水生植物能吸收的硝基氮和氨氮，然后水生植物及时吸收大量的无机氮，特别是硝基氮和氨氮，这样形成一个氮转化的通路，从而不断降低尾水中的${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N浓度。邹万生等^[1]利用有效微生物菌与水生植物联合净化珍珠蚌养殖废水的研究中也发现相似的结果。

微生物是水环境介质中氨化、硝化和反硝化作用的驱动者，会导致水体中硝基氮含量也会发生一定的变化^[20]。如图2(c)所示，PA2组的${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N浓度降低最快，于15 d时降至最低；其次为PA3组，于18 d降至最低，但各组均比去除TAN和${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N时间长。这主要是因为水环境介质中氨化、硝化和反硝化作用，将不稳定的TAN和${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N转化为${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N所致。至实验结束时，PA2组的${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N去除率最大，为99.11%；PA3组次之，去除率为98.40%，PA2和PA3组去除率显著大于PA1(P>0.05)，PA1显著大于P和空白组(表2)。上述结果表明，光合细菌和水生植物组合去除硝基氮效果均好于光合细菌组，其中光合细菌+蕹菜组去除效果最佳。产生此结果的原因主要有2点：一是水生植物可直接吸收硝基氮，通过光合细菌的转化，蕹菜对硝基氮的吸收效果依次大于狐尾藻、凤眼莲；二是水生植物根系能形成生物膜，尾水中的光合细菌等有益菌可附着于根系上，同时水生植物能使根系泌氧速率加快^[21]，根系形成的微氧环境有利于还原型和氧化型有机氮之间的相互转换，无机氮再经过同化作用被水生植物吸收，从而提高了硝基氮的去除率。上述研究结果与常会庆^[22]及吴伟等^[23]的研究结果一致，但与许国晶等^[24]的研究结果不同。可能是由于有益菌种类不同对N元素吸收能力的不同导致的。本研究利用的是光合细菌，而许国晶利用的除了光合细菌还包括硝化细菌(Ni-trobacteria) 乳酸菌(Lactobacill)放线菌(Actinomy-cetes) 酵母菌(Yeast) 及芽孢杆菌(Bacillus cohn)。

化学需氧量(COD)作为评价养殖水体受有机物污染程度的重要标志，是水质监测的基本参数。图3(a)显示了各组COD随时间的变化情况。PA1、PA2和PA3组中COD随时间逐渐降低，并在6 d时趋于稳定；而P组耗氧有机物(以COD计)先降低后略有升高，最终COD去除率显著大于PA3组和对照组(P<0.05)，但与PA1组和PA2组无显著差异(P>0.05)，去除率大于35.24%(表3)。本研究发现，单光合细菌组的COD去除效果最好，其次为光合细菌+蕹菜、光合细菌+凤眼莲和光合细菌+狐尾藻组，但均大于对照组，说明本实验中的光合细菌和3种水生植物组合对COD的去除效果不显著。造成此结果的主要原因可能是从水生植物根系等部位分泌产生有机、无机碳源以及氧化有机物所需的O₂供应不同而导致的^[25]。另一个原因是，本实验的初始COD值较低(已达到较低的浓度水平)，故未产生显著差异。相似的研究结果也出现在常会庆^[22]对2种水生植物与固定化光合菌联合作用的研究中。

图3(b)显示了各组TSS浓度随时间的变化情况。各实验组TSS浓度降低速率均比对照组快，其中PA2和PA3降低最快，并于6 d时开始趋于稳定；其次为PA1，于9 d时开始趋于稳定。如表3所示，PA1、PA2、PA3组TSS的去除率均明显大于P组和对照组(P<0.05)，P组TSS去除率也显著大于对照组(P<0.05)，其中PA2去除率最大，为97.23%。这说明光合细菌能有效去除尾水中的TSS，并在含有光合细菌的尾水中，栽种水生植物对TSS去除有促进作用。产生此结果的原因主要是水生植物具有发达的根系，在尾水中悬浮颗粒和有机物颗粒均可附着于植物根部，并在光合细菌的作用下进行分解，从而导致TSS浓度迅速降低^[26]。但空白组在21 d后的TSS去除率也达到了82%。导致此结果的原因是：一方面，由于养殖尾水自身的自由沉降起到重要作用^[27]；另一方面，尾水本身中含有可降解有机物颗粒的微生物，降低了TSS浓度。因此，建议在养殖尾水净化实践中，可将浑浊的高浓度养殖尾水沉静一段时间，再进行净化处理，可以达到事半功倍的效果。

在光合细菌与水生植物联合处理过的养殖尾水中，其TN、TP浓度的变化规律呈现一定的差异性。图4(a)显示了各组TN浓度随时间的变化情况。各实验组的TN浓度降低速率均大于对照组，其中PA1、PA2和PA3组降低速度最快，并于第6 天时开始趋于稳定，去除效果较好。相同的结果也出现在许国晶等^[24]在EM菌液+大薸组对TN的去除速率的研究中。产生此结果的主要原因：一方面是水生植物和光合细菌可直接吸收和利用水中N元素；另一方面是水生植物可以通过根系向水体中分泌氧气和有机碳，可以为硝化-反硝化的有益菌提供生长微域环境，从而促进生物脱氮^[28-29]。如表4所示，实验结束后，PA2、PA3组对TN的去除率明显大于P组和对照组(P<0.05)，但与PA1和PA3组无显著差异(P>0.05)，其中PA2去除率最高，为87.74%。常会庆^[22]研究发现，在经过19 d的处理后，光合细菌与漂浮植物黄花水龙(Jussiaea stipulacea Ohwi)结合去除养殖废水中TN的效果比与沉水植物伊乐藻(Elodea nuttallii)结合去除效果显著，TN去除率分别达到98.01%，这与本研究结果相一致。

由图4(b)可见，PA1、PA2和PA3组的TP浓度降低的速率均明显大于P组和对照组，在6 d内迅速降低，由1.348 mg·L⁻¹降至0.185 mg·L⁻¹，并逐渐趋于稳定；至实验结束时这3组TP浓度均显著低于P组和对照组(P<0.05)。这表明光合细菌和水生植物联合作用去除养殖尾水中TP的效果更好。产生此结果的主要原因是：一方面，水生植物根部可附着大量的微生物群落，在其根部的好氧区，可增加有益菌吸附的反应面积，从而促进了磷的去除^[17]；另一方面，水生植物可分泌助凝物质，从而加速吸附和沉降水体中的固体悬浮物，这部分主要体现在颗粒态磷浓度的下降^[11]。而这3组间TP浓度无显著差异，这可能是栽种的水生植物未达到一定生物量所致^[24]。如表4所示，PA1、PA2和PA3组的TP去除率均显著大于P组和对照组(P<0.05)，P组显著大于对照组(P<0.05)，其中去除率最大的为PA2，去除率为86.26%，明显高于王超等^[30]研究中TP的去除率(25%)和许国晶等^[24]研究中TP的去除率(60.32%)。

KORNER^[31]研究表明，有益微生物能有效快速降解、转化和吸收水体中的有机营养物质，对养殖尾水中的TN、TP有明显的抑制作用。CHRISTIANSE等^[32]研究表明，养殖水体中的磷元素主要是依靠水生植物直接吸收、根部吸附和其自身的沉淀作用等途径消除，本研究也证明了此结果。同时，本研究发现，光合细菌可与水生植物能形成协同作用，可更有效的去除TN和TP。总氮的去除机理是利用光合细菌将亚硝基和有机氮转化成无机氮，水生植物及时吸收大量的无机氮，从而促进水生植物生长，降低了总氮含量；而水生植物产生的发达根系又可为光合细菌提供更大的附着面积，有助于光合细菌的生长繁殖，进而加快有机氮转化为无机氮，形成一个氮转化的通路，最终实现迅速降低尾水中总氮含量。总磷的去除主要分2种方式：一是无机磷被植物直接吸收；二是有机磷被光合细菌等微生物吸收作为营养物质储存在体内，再经过氧化分解后以无机磷${\rm{PO}}_{\rm{4}}^{{\rm{3 - }}}$-P形式释放出来，最终被水生植物吸收从而降低了尾水中总磷含量。

1)光合细菌与水生植物联合净化组对暗纹东方鲀养殖尾水的净化效果均优于光合细菌组，TAN、${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N、${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N、耗氧有机物(以COD计)、TN和TP浓度均达到《淡水养殖尾水排放要求》(SC/T 9101—2018)的一级排放标准，TSS浓度均达到二级排放标准。

2)光合细菌+蕹菜组(PA2)对尾水净化速度最快，去除效果最好，TAN、${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N、TN、TP和耗氧有机物(以COD计)的浓度于9 d内降至最低，${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N和TSS于15 d时降至最低，对TAN、${\rm{NO}}_{\rm{2}}^ -$-N、${\rm{NO}}_{\rm{3}}^ -$-N、TSS、TN和TP的去除率均大于86.26%，COD去除率达到34.07%。就污染物去除率而言，光合细菌+蕹菜>光合细菌+凤眼莲>光合细菌+狐尾藻>光合细菌。

3)在构建的光合细菌+水生植物联合净化组中，蕹菜(A2)生长最快，相对生长率为4.61%；其次为凤眼莲(A1)，相对生长率为3.90%；狐尾藻(A3)生长最慢，相对生长率为2.37%。

4)光合细菌与水生植物(蕹菜、凤眼莲、狐尾藻)间具有协同作用，在含有一定浓度光合细菌的淡水养殖尾水中栽种一定数量的水生植物，能提高净化养殖尾水的能力。