塑料的微生物降解机理研究进展

塑料制品可在自然环境中通过物理、化学或生物过程分解成小塑料颗粒和碎屑,其中粒径<5 mm的称为微塑料(microplastics, MPs)[1]。常见的微塑料种类为聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(PUR)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚乳酸(PLA)等。MPs普遍分布在空气、水、土壤和其他环境介质中,在风和洋流的作用下,它们会进行长距离迁移,甚至在极地地区和深海沉积物中被检测到[2]。由于其数量多、体积小,MPs会在生物体内富集,通过食物链进行传递,最终进入人体。MPs对人体的危害远远大于大型塑料[3]。MPs污染已成为一个备受关注的环境问题[4]。

环境中的塑料很少以原生塑料形态存在,易受光照、高温、风化以及物理磨损等因素逐步降解。塑料废物在环境中的降解被认为是促进MPs形成的主要过程[5]。降解会引起MPs表面和结构特征的改变,增加表面含氧官能团和亲水性,进而增加其对于部分有机污染物和重金属的吸附能力,同时促进了MPs在土壤和水体中的运移能力,增加浮游动物或贻贝对其的摄入与积累。此外,MPs降解会产生更多的微米级MPs甚至纳米级MPs,纳米级MPs可以进入血液循环从而到达消化系统以外的其他器官[6]。不仅如此,降解也会导致MPs中添加剂(增塑剂、阻燃剂、抗氧化剂等)向环境的释放。因此,了解塑料降解机理对于规避MPs可能带来的不良效应至关重要。

在探索降解塑料污染方法的过程中发现,塑料可以在环境中持续存在并具有一定抗降解作用。但是,有氧降解塑料(oxo-degradable plastics)和有氧生物降解塑料(oxo-biodegradable plastics)由于在合成塑料中添加了催化剂或生物可降解成分,在适当条件下降解成单体或微塑料[7]。近年的研究表明,自然环境中存在一些能降解难降解塑料的微生物,微生物降解无二次污染且对环境扰动少。在微塑料的去除中具有很好的应用潜力。因此,微塑料的快速降解已经成为生物化学和生态毒理领域科研人员的关注重点。系统归纳微生物对塑料的降解作用及其机制,对于了解塑料在环境中的迁移和归趋具有十分重要的意义。目前关于塑料降解的主要方法、影响因素及环境风险已有大量研究,但尚缺乏详细系统的综述。基于此,本文总结了近年来微生物介导的塑料降解的研究进展,并讨论塑料降解的相关特征和机制,提出未来的重点研究方向。以期为科学评估塑料降解效果及污染去除提供参考。

1 微生物降解机理及表征(Mechanism and characterization of microbial degradation)

1.1 降解机理

微生物降解是指微生物以塑料作为底物,发生一系列的生化反应进行的代谢降解,由需氧微生物转化为CO2、H2O、矿物质和生物质,或者在厌氧性生物作用下转化为CO2、CH4和腐殖质[8]。微生物降解过程通常分为生物附着(biofouling)、解聚(biofragmentation)、同化作用(assimilation)和矿化作用(mineralization)4个阶段(图1)。

首先,微生物通过分泌多种多糖或蛋白质类物质附着在聚合物表面。这些物质穿透并改变聚合物的孔径,影响其表面的形态特征。在这一阶段,聚合物的耐久性和电阻降低,比表面积增加。同时,细胞外黏液的分泌促进了污染物的积累,加速了微生物的生长,并增加生物退化(bio-deterioration)的速度。之后,定植微生物释放胞外酶(如脂肪酶、酯酶、解聚酶等)将复杂的聚合物分解成短链的低聚物、二聚体和单体,引发解聚或裂解[9]。不仅如此,微生物分泌的酶还可以催化各种氧化反应,产生自由基诱导氧化应激,引发链式反应,促进聚合物降解。在解聚步骤之后,具有羰基或羟基官能团的代谢中间体可通过β-氧化和三羧酸(TCA)循环在微生物细胞内被摄取并同化,转化为初级和次级代谢产物。最后,这些代谢物被微生物完全矿化为CO2、H2O、N2和CH4

等小分子化合物。矿化过程需要各种酶的参与,包括酯酶、脂肪酶、角质酶、过氧化物酶和漆酶等[10]。

1.2 降解效果的表征

塑料结构稳定,不易降解,生物可利用率较低。而现有降解微生物普遍降解缓慢且降解现象不明显。表征微生物对塑料的生物降解程度可通过分析其材料的性质变化,如表面官能团变化、机械性能、表面形貌、疏水性/亲水性、相对分子质量分布和降解产物等,评价生物降解的效果。例如:通过使用扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)观察塑料颗粒表面结构的变化,包括颜色的变化、裂纹和孔洞的产生、表面粗糙化和表面微生物菌落的形成,为塑料生物降解提供了初步证据。使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量微生物降解后表面官能团的变化情况,例如,1 710～1 715 cm-1处红外吸收率的增加表明PE主链上形成了羰基(—C

O—),这被视为其生物降解的起始步骤[11]。另一方面可通过监测微生物在以塑料作为唯一碳源生长时的生长动力学变化,来判断对塑料的降解能力。考虑到不同塑料聚合物中涉及的各种化学添加剂的干扰,不能仅通过分析其表面结构变化、官能团变化和质量损失来确定降解程度。微生物在有氧条件下产生CO2作为主要代谢产物之一;而在厌氧条件下产生CO2和CH4作为最终产物[8]。因此,可通过气相色谱法(GC)监测其耗氧量或沼气(CO2/CH4)产量的变化来表征降解程度。不同的表征方法单独或组合应用,以监测和量化微生物或酶对塑料的降解能力。常用表征方法如表1所示。

2 参与塑料降解的微生物(Microorganisms involved in plastic degradation)

2.1 细菌介导的塑料降解(Bacterial-mediated plastic degradation)

细菌是微生物的主要类群,许多细菌具有降解污染物的能力。塑料作为一类碳基有机物,可以作为碳源,供细菌自身的生长发育。在实验室条件下,细菌介导塑料降解的研究主要集中于使用纯细菌培养物。这些培养物大多从土壤、海洋、污泥甚至是昆虫肠道中分离并富集(表2)[12]。在塑料降解研究中使用纯菌株的优势在于能够评估不同环境条件下对降解的影响。

Auta等[13]从马来西亚半岛的红树林沉积物中分离出8株细菌用于降解不同类型聚合物(包括PE、PS和PET)。实验结果表明,PE、PET和PS在40 d内均有显著的减重效果,同时观察到MPs的表面变得粗糙,并具有许多裂缝和凹槽。Auta等[14]开展进一步实验,提取了2种纯细菌培养物(Rhodococcus sp. strain 36和Bacillus sp. strain 27),用于降解PP MPs。培养40 d后PP MPs的减重率分别为6.4%和4.0%。除沉积物外,更多的降解菌来自土壤环境。Habib等[15]从南极土壤中分离出假单胞菌(Pseudomonas sp.)和红球菌(Rhodococcus sp.)用于降解PP MPs。PP MPs经处理40 d后的失重率分别为17.3%和7.3%。深入研究表明,细菌不仅可以改变塑料的表面形态,还会改变其内部官能团结构。例如,研究人员将PE与蜡样芽孢杆菌(B. cereus)共同培养一段时间后,发现PE的FTIR光谱中羰基官能团峰值增强,且在3 738 cm-1和3 419 cm-1处出现了新的吸收带,这分别与N—H键和O—H键的存在有关[16]。另外,细菌对改性塑料有着更强的降解能力。Mohan等[17]研究了分离的芽孢杆菌菌株降解高抗冲聚苯乙烯(HIPS)的效果。用芽孢杆菌菌株降解后,30 d内HIPS膜的质量下降了23%。除此之外,一些功能性细菌可从昆虫的肠道中获得。Yang等[18]从蜡虫的肠道中分离出2株能够降解PE的细菌(Enterobacter asburiae YT1和Bacillus sp. YP1)。Zhang等[19]从幼虫肠道分离出一种细菌菌株(Klebsiella sp. EMBL-1),实验表明能够解聚并利用PVC作为唯一的碳源并确定了可能参与PVC降解的基因和蛋白质。目前虽然已经开发了许多创新的方法来获得降解菌株,但选择用于筛选的细菌数量仍然较少。从单个菌株对塑料的降解效率来看,如表2所示,如果不考虑其他因素对降解效率的影响,日降解效率最高的是假单胞菌,其不同的种也表现出较高的降解效率。在这里,我们可以推测,微生物降解塑料的差异可能与它们的代谢过程有关,而代谢过程又由微生物的遗传组成决定。

与纯菌株相比,复合菌群在降解塑料聚合物方面更加高效。潜在的原因可能是菌群中不同微生物之间的协同共生作用[20]。例如,降解过程中产生的有毒代谢物可以作为其他微生物的底物,从而减少代谢物对降解细菌的影响[21]。目前利用复合菌群降解塑料的研究已经有了一定进展(表3)。Park和Kim[22]的一项研究中,分析了从垃圾填埋场沉积物中获得的细菌群降解PE的情况。芽孢杆菌(Bacillus sp.)和类芽孢杆菌(Panenibacillus sp.)使MPs颗粒的干质量和平均粒径降低(60 d后分别降低14.7%和22.8%)。Meyer-Cifuentes等[23]研究了海洋微生物富集培养以降解芳香-脂肪族共聚酯MPs。复合菌群以MPs薄膜作为其唯一的碳源,在大约15 d内实现了最大的矿化。该菌群以协同的方式进行降解,不同的降解步骤由复合菌群中的不同菌株执行,复合菌株降解效率高主要取决于多种酶的参与和相互作用。Skariyachan等[24]从垃圾处理厂中筛选菌株,并将其组合成复合菌群,发现相较于单一菌株,这种新型微生物群落具有较高降解潜力。在120 d内,该菌群对LDPE薄膜和LDPE颗粒的降解效率分别为(81±4)%和(38±3)%。Syranidou等[25]研究将自然风化后的PS薄膜与海洋中上层自然菌群(indigenous, INDG)和经生物增强(bioaugmented, BIOG)的人工菌群进行孵育,发现红球菌(Rhodococcus sp.)、希瓦氏菌(Shewanella sp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)组成的复合菌群能够以PS作为唯一碳源生长。

目前虽然已有研究支持复合菌群的降解率高于单一菌株,但证明仍然十分有限。原因在于混合的微生物需要适当的匹配,才能有更好的降解效果,而一些相互竞争或相互排斥的微生物混合物可能产生相反的效果。未来研究应注重将具有不同功能的菌种配制成复合菌群。

2.2 真菌介导的塑料降解(Fungal-mediated plastic degradation)

当前,无论是在实验室还是在野外,大多数微生物降解研究都使用细菌。主要原因在于传统的微生物富集技术更有利于细菌生长,而真菌的生长速度较慢,通常需要协同代谢底物才能生长。然而研究表明,真菌对塑料的降解效果可能优于细菌[26]。因为相比于细菌,真菌的菌丝能更牢固地附着在塑料的表面,并且可能穿透到颗粒内部[27]。不仅如此,真菌也可以促进塑料中羰基、羧基和酯基等化学键的形成,从而降低其疏水性[28]。真菌对塑料的降解能力归因于它们的酶系统,该系统能够分泌木质素修饰酶(LME),包括锰过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)、多功能过氧化物酶和漆酶(Lac)等,这些酶能够分解并最终使木质素矿化。高分子聚合物与木质素具有相似的化学结构(即存在醚键、芳香环、碳骨架等),这些化学结构使得某些塑料(如PE和PP)能够被LME所降解[29]。

目前,真菌在不同环境下降解塑料的研究仍是一个活跃的研究领域,已经取得了一些进展(表2)。Paço等[30]的研究证明了海洋真菌(Zalerion maritimumis)对PE的生物降解能力,他们通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱(FTIR-ATR)和核磁共振(NMR)表明Z. maritimumis具有利用PE的能力,导致PE颗粒(质量和尺寸)减少。Russell等[31]从不同植物中分离出来内生真菌,在固态和水中发酵条件下都能降解PUR。其他具有显著塑料降解性的真菌种类包括腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、穗霉(Spicaria spp.)、地丝霉属真菌(Geomyces pannorum)等。由表2可知,曲霉菌属和青霉菌属是微生物降解中应用较广泛的菌株。大多数研究都集中在PE作为真菌底物,但需要对更多的塑料类型和不同的真菌菌株进行研究。

随着现代分子生物学技术的发展,如体外转录、原位杂交、高通量测序和PCR等技术的广泛使用,在不同的环境中研究了多种细菌和真菌的降解机理。总体而言,大多数具有塑料降解能力的菌种都是细菌,它们主要属于变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和蓝细菌;而已报道的真菌也主要属于子囊菌门、担子菌门和毛霉菌门。且主要的一些细菌门和真菌门都包含已报道可以降解塑料的菌种。不同微生物种类对塑料的降解性能可能存在显著差异,有些微生物可以降解一种或多种塑料。同一种塑料在不同条件下的降解效率也会有所不同。然而许多菌株的降解机制尚不明晰,并且当前研究中,降解大多在实验室条件下进行。塑料的生物降解速率有明显增加,但无法推论到塑料在环境中也会发生显著降解。未来还应对降解机制进行更深入的研究。

2.3 生物膜介导的塑料降解(Biofilms-mediated plastic degradation)

为了适应不同的生存环境和生态需求,微生物进化出了许多附着机制。微生物不可逆地附着在惰性或活性基质的表面,繁殖、分化并分泌一些多糖物质,将菌体包裹在其中,形成生物膜[47]。生物膜作为一种屏障,为细胞的生命活动创造稳定的内部环境,介导细胞与基质之间的连接,同时还承担着物质运输、跨膜信息传递和能量转换等功能[48]。因MPs具有比表面积大、难降解、较强的吸附能力等特性,其可作为微生物的保护性和营养性载体,给微生物提供稳定的栖居环境和丰富的营养底质[49]。生物膜中的微生物种类十分多样,包括硅藻、蓝藻、变形菌门、拟杆菌门等[50]。研究表明,MPs表面生物膜的微生物群落组成及多样性与周围环境及某些天然基质表面的微生物有显著的差异性,MPs已成为微生物新生态位的一部分,称之为“Plastisphere”(塑料圈)[51-52]。塑料圈中微生物数量和形态受环境参数的影响,有机物含量是决定MPs生物膜群落的最显著因素,其次是盐度和溶解氧,同时也受聚合物类型、表面性质和尺寸的影响[53]。

生物膜的形成会影响塑料的降解过程。一方面,当生物膜附着于塑料表面时,较厚的被膜可使其免受阳光中紫外线的照射。并且,附着微生物会改变塑料的密度,导致其下沉,减少紫外线引起的降解[54]。另一方面,生物膜的形成可改变塑料的理化性质(如亲水性、表面形貌和官能团等),同时还会通过多种方式破坏塑料的结构和功能,包括掩盖表面特性、降解添加剂、分泌修饰/降解酶和释放代谢副产物等,进而影响塑料在环境中的迁移与归趋[55]。

Lobelle和Cunliffe[56]研究了PE表面的生物膜形成。1周后,PE表面可见明显的生物膜,并在接下来的2周持续增加。PE表面异养细菌数量也从第1周的1.4×104 cells·cm-2增加到第3周的1.2×105 cells·cm-2。同时PE在生物膜的作用下发生一定程度的降解和转化。McCormick等[57]研究发现假单胞菌能够富集在MPs表面,假单胞菌已被证明对多种MPs(PE、PP和PET等)具有降解作用[58]。Ogonowski等[59]指出,生物膜中的潜在碳氢化合物微生物群落可以利用MPs作为其唯一的碳源和能源,因为它们具有生物降解复杂生物聚合物的能力。生物膜介导的塑料降解过程极其复杂,尚未得到系统的研究。例如,塑料的降解产物没有得到有效的收集和检测。更多的研究应该在不同的老化条件和实际环境条件下进行,同时考虑紫外线、微生物、机械磨损和温度的影响。探索塑料与环境条件下微生物定植形成的生物膜之间的相互作用,具有重要的意义和实用价值。

2.4 微藻介导的塑料降解(Microalgal-mediated plastic degradation)

微藻是水生态系统的初级生产者,对于整个生态系统的平衡和稳定具有重要作用。研究表明,微藻对塑料具有一定程度的降解作用。微藻可以通过附着在塑料表面,并通过分泌胞外聚合物(extracellular polymer substances, EPS)和木质素水解酶启动降解过程。

相比细菌和真菌,微藻是一种理想的降解生物,因为微藻体内不含内毒素,在光自养条件下不需要有机碳源,能够利用大气中的CO2和阳光作为主要能源来源[60]。不仅如此,来自杆菌藻、绿藻和蓝藻的几种无毒藻类物种被证明更容易在MPs表面定植,并能够在池塘、湖泊和废水等各种受污染的水体中形成微藻生物膜[61]。研究人员发现2种易于分离和生长的微藻(Phormidium lucidum和Oscillatoria subbrevis),可以定植在LDPE表面,无需任何预处理就能有效降解LDPE[62]。Kumar等[63]研究了二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)、螺旋鱼腥藻(Anabaena spiroides)和瞳孔舟形藻(Navicula pupula)降解LDPE和HDPE的能力,其中螺旋鱼腥藻降解程度最大,30 d后对LDPE降解率达到8.18%。不仅如此,微藻还可以通过基因工程改造为微生物细胞工厂,从而能够生产和分泌MPs降解酶。例如,对莱茵衣藻进行基因改造,可使其产生PET水解酶。测试结果表明其在PET表面形成了空洞和孔洞[64]。目前,藻类降解MPs的机理和降解效率还有待进一步的研究。

3 不同类型塑料的降解及降解酶(Degradation and degradation enzymes of different types of plastics)

塑料按其骨架可分为以碳原子为主链的聚合物(如PP、PE、PS和PVC)和主链上有其他原子(N和O)的聚合物 (如PU、PET)两大类。其中PE、PP、PVC和PS是水环境中MPs污染的主要组分,由于聚合物主链为高度稳定的C—C键,而自然界中缺乏可以直接裂解C—C键的酶,导致其在环境中具有极低的生物降解性。与C—C键相比,聚合物主链中含有杂原子通常更容易被生物降解[65]。类似的,塑料降解酶可分为胞内酶和胞外酶两大类。图2展示了塑料在胞外酶和胞内酶共同作用下的降解情况。胞外酶如解聚酶、异构酶等,可以将复杂的聚合物分解成短链或较小的分子,如低聚物、二聚体或单体,它们可以穿过微生物的外膜,然后作为碳源被微生物吸收。筛选出塑料的有效降解菌和降解酶,优化其降解条件是科研工作者近几十年来的重要研究方向。参与降解不同类型塑料的酶如表4所示。

3.1 C-C骨架塑料(C-C backbone plastic)

3.1.1 PE微生物降解及关键降解酶 (PE microbial degradation and key degradation enzymes)

聚乙烯(PE)由乙烯聚合形成,是全球生产量最高的塑料。聚乙烯分为高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)。PE由于具有高疏水性、高分子量和结晶度导致在微生物降解中难于其他各种塑料,所以PE的微生物降解成为当前研究的热点[66]。PE降解酶包括羟化酶(hydroxylases)、漆酶(laccases)、过氧化物酶(peroxidases)和还原酶(reductases)。其中,锰过氧化物酶在2种真菌——黄孢平革菌(P. chrysosporium)和云芝(T. versicolor)中被发现能够降解PE[67]。Jeon和Kim[68]研究发现铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)中含有烷烃羟化酶,可在亚末端或末端位置天然氧化线性烷烃。另外,研究人员从细菌(赤红球菌[69])和真菌(黄曲霉[38])中分离出多种漆酶,FTIR分析表明漆酶的酶促氧化性在PE的生物降解中起重要作用。另外,一类特殊的载体蛋白,如ABC转运蛋白(ATP-binding cassette)和主要促进因子超家族蛋白(MFS)也被认为能同化PE[70]。

3.1.2 PS微生物降解及关键降解酶 (PS microbial degradation and key degradation enzymes)

聚苯乙烯(PS)由苯乙烯单体经自由基加聚反应合成。因其良好的机械性能和相对较低的成本而被广泛应用于包装工业、建筑材料和食品容器等行业,是一种常见的热塑性塑料[71]。PS具有与PE相同的C—C主链,这使得PS在自然环境中难以生物降解。PS降解包含主链和侧链2种途径。主链降解为苯乙烯在苯乙烯单氧酶(SMO)的作用下生成氧化苯乙烯,然后在氧化苯乙烯异构酶(SOI)、苯乙醛脱氢酶(PAALDH)等一系列酶的作用下生成三羧酸循环的中间产物乙酰辅酶A,从而进入微生物新陈代谢[72]。另一个途径是通过PS的侧链断裂。单加氧酶或芳香环羟化酶对PS具有潜在的降解作用,然而详细的降解途径和相关酶尚未揭示[73]。

3.1.3 PP微生物降解及关键降解酶(PP microbial degradation and key degradation enzymes)

聚丙烯(PP)是由丙烯聚合而成的聚合物,是产量仅次于聚乙烯(PE)的第二大塑料,约占塑料总产量的18.85%,在医疗、汽车工业和包装用途等多个领域有着广泛应用。PP由于链中分子量高且缺少官能团,较大的底物无法穿透微生物细胞膜,因此难以被直接降解[74]。PP的降解通常开始于非生物降解(如光降解或化学降解),通过分解碳链降低其分子量,并在骨架上生成羰基基团,从而使聚合物具有亲水性,继而开始PP的生物降解过程[75]。

Jain等[76]利用5种不同的芽孢杆菌菌株,蜡样芽孢杆菌(P3、P13)、苏云金芽孢杆菌(P8、P10)和地衣芽孢杆菌(P6)对PP-PLA共混薄膜进行生物降解,FTIR和TGA分析结果表明细菌处理后聚合物样品羰基键断裂和热性能下降,证明所有芽孢杆菌都可以生物降解MPs。芽孢杆菌具有最大的降解能力,因此可能比其他菌株更适用于降解PP。de Oliveira等[77]利用黑曲霉(A. niger)和宛氏拟青霉(P. variotii)组成的混合菌株降解纯PP和PP/PET/热塑性淀粉共混物。结果表明,30 d后混合物的降解率可达2.32%,而纯PP的降解率仅为0.62%。纯PP的生物降解率低于PP与其他物质的混合物。尽管PP可以被多种微生物降解,但迄今为止,还没有发现一种关键的酶具有降解PP的能力。

3.1.4 PVC微生物降解及关键降解酶(PVC microbial degradation and key degradation enzymes)

聚氯乙烯(PVC)在塑料工业中的需求量位居第三,仅次于聚乙烯和聚丙烯。它是由氯乙烯聚合而成的,主要用于涂层材料、电子、医疗设备和食品包装[78]。PVC在生产过程中使用了大量的添加剂,如邻苯二甲酸酯和重金属,易造成严重环境污染[79]。关于PVC光降解和热降解的报道很常见,但生物降解却很少见到。

Webb等[80]研究发现,黑酵母菌(A. pullulans)能够利用PVC作为唯一的碳源,减轻其质量。Khandare等[81]从海洋环境中分离出多种菌株如弧菌、单胞菌(Altermonas sp.)等,发现未塑化的PVC材料可以被分解。扫描电镜分析显示,在处理过的PVC样品表面出现了凹槽和裂缝。Giacomucci等[82]从海洋样品中富集厌氧菌落对PVC膜的生物降解进行了厌氧微观世界的评价。7个月后,3个微观世界的MPs表面出现了致密的生物膜,聚合物平均分子量下降了11.7%,这表明微生物对聚合物链产生降解。研究发现,分解木质素的能力与PVC的生物降解有关。黄孢原毛平革菌(P. chrysosporium)分泌的木质素过氧化物酶能够改变PVC的结构[83]。值得注意的是,考虑到PVC具有极高的增塑剂比例(高达50%)。而增塑剂可被许多真菌或细菌用作营养碳的来源,这就导致微生物只是代谢PVC中增塑剂的一个成分(如邻苯二甲酸二酯),而不是PVC的主干[84]。

3.2 C-O骨架塑料(C-O backbone plastic)

3.2.1 PET微生物降解及关键降解酶(PET microbial degradation and key degradation enzymes)

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一种常见的热塑性塑料,其单体成分为对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)。主要用于生产纺织工业中的合成纤维。由于PET的酯键位置被其他成分包围,降解酶难以接触到,因此不易降解。目前,只有少数细菌和真菌拥有部分降解PET为寡聚物或单体的能力,且已知的PET水解酶的周转率都相对较低[85]。日本研究人员分离出一种新型细菌(I. sakaiensis),它能够使用PET作为其主要能源和碳源。I. sakaiensis首先黏附在PET表面,分泌2种降解酶PETase和MHETase。PETase是一种胞外聚酯酶,能够将PET水解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸(MHET),对苯二甲酸(TPA)和双(2-羟乙基)对苯二甲酸(BHET)[32]。MHETase可将MHET水解为TPA和乙二醇(EG),然后将其内化在细菌细胞中。Cui等[86]提出了一种新型蛋白质稳定性计算设计策略,基于计算机蛋白质设计对PETase降解酶进行稳定性改造,获得了适应性更好的重设计酶(DuraPETase),其在常温下对在半结晶PET薄膜降解效果显著增强。Lu等[87]使用了基于结构的机器学习算法设计一种新型PET水解酶,其比原始PETase有着更好的耐受性和稳定性,能够实现对常用PET的完全降解,并能从回收的单体中重新合成PET。在实际应用方面,法国生物技术公司Carbios通过酶催化循环工艺,生产出全球首个以废弃PET为原料的食品级PET瓶,实现了PET的供应循环。除细菌外,真菌表皮酶也具有降解PET的能力。研究表明,腐殖菌门的表皮酶可与来自南极拟酵母的脂肪酶CalB一起使用,具有更好的降解效果[88]。除此之外,角质酶、脂肪酶和羧酸酯酶也被证明具有PET降解能力[89]。

3.2.2 PUR微生物降解及关键降解酶(PUR microbial degradation and key degradation enzymes)

聚氨酯(PUR)由二异氰酸酯和多元醇通过分子内氨基甲酸酯键缩合而成,是全球储量第六的合成高分子材料,常用于生产泡沫、绝缘材料、纺织品和防止腐蚀的涂料[90]。PUR有聚酯型和聚醚型两大类。具有降解PUR能力的酶,包括酯酶、脂肪酶和水解酶等。Howard等[91]从菌株Pseudomonas chlororaphis中纯化出3种不同分子量的酯酶,可以水解聚酯型PUR中的酯键。Gautam等[92]从皱褶假丝酵母(Candida rugosa)中纯化出的脂肪酶同样可以水解聚酯型PUR中的酯键。Russell等[31]从真菌小孢拟盘多毛孢菌(P. microspore)提取出的丝氨酸水解酶,可以切断PUR中氨基甲酯单元的脲键。值得注意的是,迄今为止研究的大多数活性酶对聚酯型PUR具有活性,而对聚醚型PUR不具有活性。可能原因在于聚酯型PUR中含有羰基,使其更容易被酶活性水解[89]。

在表4中总结了目前部分已报道的各种生境来源的主要塑料降解菌和酶的相关信息。总的来说,目前对降解酶的研究主要集中于陆地环境,有关海洋降解酶的研究报道并不多。我们知道,塑料生物降解过程中,第一步即是微生物在塑料表面附着定植,随后形成生物膜,导致其密度增加,使其以颗粒物形式沉积到深海中。研究发现,深海环境的微生物酶具有耐高温、低温和有机溶剂等特性,在塑料降解与循环利用中有重要应用潜力[93]。

4 微生物降解塑料的影响因素(Factors affecting the microbial-mediated degradation of plastic)

塑料的微生物降解受到多种因素的影响,主要包括聚合物特征、环境因素和预处理。这些因素的作用主要是通过影响聚合物表面积、亲水性以及降低分子量来促进后续的微生物降解作用。

4.1 聚合物特征(Polymer characteristics)

聚合物特征是生物降解过程的一个重要参数,主要包括疏水性、官能团、聚合物结构。首先,塑料的初始微生物定植程度因亲水性的增加而增强,而胞外酶的活性也会因较高的疏水性而受到抑制。不同的官能团亲水表面的润湿性增强,具有更高的表面能,与水的接触角更低,从而促进微生物附着在聚合物表面,加快降解速率。研究表明,与疏水性较高的PP相比,高亲水性的尼龙更容易被微生物降解[99]。另外,聚合物的结构特征也影响其降解性,包括分支度、结晶度和物理形态。例如降解速率会随着表面粗糙度的增加而增加,因为表面积的增加促进了其表面生物膜的形成[100]。同时具有较高的侧链比例的塑料聚合物难以被微生物降解。结晶度是影响生物降解性的另一个关键因素,结晶域的有序结构限制了分子链的运动能力,从而降低接触酶的机率和降解反应速率。因此,塑料的降解速率随着聚合物结晶度的增加而降低[101]。除此之外,聚合物的分子量以及玻璃转化温度(Tg)、熔化温度(Tm)等也会影响塑料的降解速率。微生物降解的速率随聚合物分子量的增加而降低。因此,小分子量的聚合物如单体、二聚体和低聚体更容易降解和矿化[102]。降解速率还与Tg、Tm相关。例如,PET降解速率主要取决于聚酯链的流动性,而聚酯链的流动性则与Tg成反比,即当Tg升高时,聚酯链的流动性降低,降解速率提升[103]。而Tm被证明与微生物降解速率呈负相关[9]。

4.2 环境因素(Environmental factors)

环境因素主要包括光(紫外线)、热、湿度和化学物质的存在。外界环境对塑料微生物降解的影响包括2个方面。一方面,环境影响相关微生物的生长和代谢,包括微生物的生物量和酶降解活性。比如,在所有其他因素保持不变的情况下,海洋环境中的降解效率明显高于陆地环境。不同的塑料聚合物被观察到对电磁辐射很敏感,因为它们能够吸收对流层太阳辐射中较强的部分。这些合成聚合物倾向于吸收光谱中紫外线区域的高能辐射,这将激发其电子产生更高的反应性,并导致氧化和分裂[104]。另一方面,外部氧化环境会对塑料造成老化和损伤。如温度和湿度有利于酯键的断裂,当环境温度超过生物聚合物的Tg时,水解和生物退化的速度会增强,加速微生物对塑料的降解和利用。

4.3 预处理(Pre-treatment)

由于合成聚合物的疏水性导致其缺乏固有的微生物降解性,但通过对聚合物进行预处理,通过在塑料表面引入亲水性官能团或中断大分子聚合结构,可提高其降解性能[105]。预处理一般可分为2类:化学预处理和物理预处理。化学预处理包括使用酸或碱性处理或2种同时处理。研究人员发现将塑料的化学预处理与厌氧消化结合使用,可增加沼气产量。例如,碱性预处理能够增强塑料的水解,从而在后期提高沼气生产的产甲烷率[106]。物理预处理包括研磨、光降解等多种处理方法。Taghavi等[107]研究了紫外线(UV)预处理对PS、PE和PET生物降解的影响。结果表明,UV预处理可以有效地改变塑料表面的亲水性、生物膜的形成和降解效率。

5 结论与展望(Conclusion and prospect)

相对分子质量高、疏水性强和化学性质稳定等特点使环境中的塑料难以自行降解,现有研究表明,自然界中多种微生物都具有降解塑料的能力。细菌通过在塑料表面形成生物膜,再通过在其产生的水解酶或氧化还原酶将塑料降解为小尺寸碎片和低聚物,其中分子量较低的低聚物进入微生物体内。真菌通过丝状结构延伸在塑料上,由菌丝的胞吐作用释放消化酶,从而将其分解成较小的有机化合物以吸收。由此可见,微生物降解塑料的最终机理都与微生物及其产生的酶有关。聚合物性质、环境因素以及预处理都会影响其降解效率,创造合适的条件有利于提高生物降解效率。为了系统和全面地认识与评价环境中塑料的环境行为和潜在生态风险,针对塑料的微生物降解提出以下展望。

(1) 塑料结构稳定,降解过程较为复杂,对于降解机制和机理的理解仍有待探索。未来应通过降解过程的酶学、化学及能量代谢等多学科交叉研究,确定关键酶及其降解机制,并通过定向改造提高关键酶的酶促效率和产量,加快微生物降解塑料走向实际应用。

(2) 目前关于微生物降解的研究通常是在实验室中进行,而真实环境条件复杂多变,微生物降解行为可能会与周围环境相互影响。未来研究中,应结合复杂的环境条件,充分考虑塑料的微生物降解与环境行为之间的相互作用,这有助于我们更好地理解塑料在环境中的归趋。

(3) 加强对塑料经生物降解后降解产物的研究。对塑料解聚后的单体进行重复利用,如塑料降解后与厌氧消化技术结合,实现能源的高效转化与资源化,达到塑料垃圾“变废为宝”的作用。

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