氯化石蜡(chlorinated paraffins, CPs)是一系列多氯正构烷烃的复杂混合物,由正构烷烃和分子氯在紫外线、高温或高压条件下发生自由取代反应产生,一般氯含量(质量分数)在30%～70%之间[1]。根据碳链长度CPs通常被分为三大类,C10～13的为短链氯化石蜡(short chain chlorinated paraffins, SCCPs);C14～17的为中链氯化石蜡(medium chain chlorinated paraffins, MCCPs);C≥18的为长链氯化石蜡(long chain chlorinated paraffins, LCCPs)。此外,还存在C6～9的超短链氯化石蜡(very short chain chlorinated paraffins, vSCCPs),被认为是SCCPs的加工副产品[2],或是由SCCPs和MCCPs降解而产生[3]。
20世纪30年代,CPs已经在全球范围内开始生产,主要用作增塑剂、阻燃剂、金属加工液和皮革加脂剂等[4-5]。我国自20世纪50年代末开始生产CPs,2019年总产能已超过200万t·a-1,主产区为河南、山东和河北,三省占据全国总产量的49%[6]。随着产量增加,在生产、运输和使用过程中难免会向环境中泄漏,在废品处置过程中(如垃圾焚烧、填埋等)也会源源不断地释放到环境中。不仅如此,CPs在焚烧过程中还会产生多种持久性氯化芳烃,如多氯联苯、多氯萘等,带来了一系列环境问题[7-8]。
海洋是各类持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs)的汇,CPs作为POPs之一,加之其主要产区和消费区分布在东部沿海[6],使得我国海洋环境更易受到CPs的污染。有报道称,山东半岛渤海湾沿岸海水中SCCPs浓度为572.6～1 978 ng·L-1,平均值为1 256 ng·L-1[3];黄海沿岸海水中SCCPs浓度为370.0～543.3 ng·L-1,平均值为449.3 ng·L-1[3];珠江口海水中SCCPs浓度为180～460 ng·L-1[9];辽东湾海水中SCCPs浓度相对较低,为4.10～13.1 ng·L-1,平均7.70 ng·L-1[10]。此外,在渤海沿岸的陆地土壤(120.31 ng·g-1,干质量)、潮间带沉积物(203.17 ng·g-1,干质量)和海洋表层沉积物(259.64 ng·g-1,干质量)中均有SCCPs污染的报道[11]。CPs不仅存在于环境中,海洋生物体中也有检出。在渤海湾沿岸软体动物中,SCCPs浓度高达5 510 ng·g-1(干质量)[12];而在辽东湾鱼类体内SCCPs浓度在428～2 896 ng·g-1(湿质量),甲壳类为243～1 053 ng·g-1(湿质量),双壳贝类为1 058～2 259 ng·g-1(湿质量),此外,在珠江口鱼类和甲壳类体内也有报道,但含量相对较低[9]。SCCPs分布广泛,污染严重,且具有生物富集性、环境持久性等特征,因而被国内外学者广泛关注[13],2017年SCCPs也被列入斯德哥尔摩公约POPs清单[14]。
SCCPs作为新型污染物,关于其毒性的研究相对较少。现有研究表明,SCCPs具有致死性、致癌性和发育毒性,导致内分泌系统紊乱和代谢功能异常[15]。在哺乳动物小鼠(Mus musculus)的经口暴露实验中发现,SCCPs主要损伤肝脏、肾脏,并具有致死性、致癌性[16-17];对于内分泌系统的影响,主要是降低甲状腺素总T4浓度,引起促甲状腺素(TSH)和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UDPGT)水平升高,导致甲状腺功能紊乱[7]。在非洲爪蟾(Xenopus laevis)的实验中发现SCCPs能够导致胚胎生长缓慢、发育畸形,并诱导了谷胱甘肽转移酶活性增加[18]。对于鱼类而言,SCCPs能够引起虹鳟幼鱼(Oncorhynchus mykiss)肝脏纤维损伤、肝细胞坏死和炎症反应[19];能够导致斑马鱼(Danio rerio)胚胎死亡率增加,孵化率降低,并影响甲状腺激素的代谢[20-21],在Ren等[22]在研究中发现SCCPs对斑马鱼胚胎13 d的LC50低至34.4 μg·L-1。关于SCCPs的毒性机制,一般认为可能是SCCPs与大分子结合,继而引起机体氧化应激、代谢紊乱、内分泌紊乱等有关[15]。现已证明,SCCPs会引起体外培养细胞产生氧化应激反应,导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性增加[23],而氧化应激会产生诸多不利影响,如破坏细胞成分,导致DNA损伤和基因突变等,因此,氧化应激可能是SCCPs毒性作用的基础[24-25],这也是本研究中重点关注鱼类胚胎氧化损伤的原因。
海洋是SCCPs污染的重灾区,但目前并没有关于SCCPs对海洋生物毒性效应的报道。褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国北方重要的经济鱼类和增殖放流的主要品种,其健康状况与人类息息相关,同时,褐牙鲆具有洄游习性,每年春季洄游至近岸产卵,受人类活动影响,近岸的底泥及海水中SCCPs污染更为严重[3],加之其胚胎、仔鱼的生理功能尚未发育完善,受SCCPs的影响可能更为严重。因此,本实验以褐牙鲆胚胎、仔鱼为研究对象,探究SCCPs对海洋鱼类的毒性效应。通过本研究,有助于进一步了解SCCPs的生态毒性,为制定和完善相关环境评价标准提供理论依据。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 SCCPs溶液配制
实验中的SCCPs(CAS号85535-84-8,纯度≥99%)购自山东嘉颖化工科技有限公司。SCCPs用二甲基亚砜(DMSO,分析纯,中国国药有限公司)助溶后,按照实验分组配成相应的浓度,各组中DMSO浓度均为0.02%(V∶V),此外设置溶剂对照组,仅添加相同剂量的DMSO。
1.2 褐牙鲆胚胎的暴露实验
褐牙鲆胚胎购自烟台天源水产有限公司,待亲鱼产卵受精后,立即收集受精卵运回实验室进行随机分组。暴露实验在外径120 mm的培养皿中进行,按照实验浓度分成了0、0.1、1、10、100、1 000和10 000 μg·L-1组(0.1、1和10 μg·L-1组用于探究目前海水污染水平的毒性效应;100、1 000和10 000 μg·L-1组用于评估严重污染时的毒性效应)和溶剂对照组(0.02%的DMSO),每组3个平行,每个平行100粒胚胎,其中0、1、100和10 000 μg·L-1组和DMSO组额外多设置6个平行,用于测定胚胎抗氧化酶活性及相关抗氧化基因的表达情况。分组完成后待受精率发育至桑椹胚时(约受精后4 h,4 hpf),开始暴露实验。
整个暴露期间保持光周期14 L∶10 D、水温(18±1) ℃、盐度(33±1)‰、溶解氧(7.0±0.5) mg·L-1。
1.3 毒性终点统计和显微观察
实验中采用显微镜(LEICA-DM2500,德国)观察胚胎的发育情况,拍照记录畸形个体,判别畸形类型等,部分测量指标采用解剖镜(OLYMPUS-SZ61TR,日本)及其自带软件(Olympus cellSens)直接测量。统计的各毒性终点如表1所示。
表1 胚胎发育中各毒性终点及其说明
Table 1 Toxic endpoints and description in embryonic development
毒性终点Toxicity endpoints评价时间/hpfHours post-fertilization/hpf说明Description自主运动Spontaneous movement42胚胎尾部每分钟内自发地从一边摆动到另一边的次数;每组统计15枚Number of spontaneous tail movements per minute per embryo; 15 embryos were scored per group孵化率Hatching rate60、72累积孵化胚胎数/总卵数Cumulative hatched embryos/total number of embryos仔鱼体长Larval length132解剖镜下测量体长,每组统计15尾Measurement of body length under dissecting microscope, with 15 individuals per group畸形率Malformation rate132畸形仔鱼数/存活仔鱼总数Umber of malformed larvae/total number of surviving larvae死亡率Mortality rate132累计死亡数/总卵数Cumulative mortality/total number of embryos卵黄囊面积Yolk sac area132解剖镜下测量仔鱼卵黄囊面积,每组统计15尾Measurement of yolk sac area in larvae under dissecting microscope, with 15 individuals per group
1.4 抗氧化酶活性测定及相关抗氧化基因表达情况
实验结束后,0、1、100和10 000 μg·L-1组和DMSO组各取3个平行测定SOD(WST-1法)、CAT(钼酸铵法)的活性以及MDA(TBA法)的含量,所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所,具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
另外取0、1、100和10 000 μg·L-1组和DMSO组剩余的3个平行,以β-actin为内参基因,采用2-ΔΔCt法测定抗氧化基因sod和cat的表达水平。首先取0.1 g样品充分匀浆后使用Trizol试剂盒(生工生物工程股份有限公司)提取总RNA,使用超微分光光度计(NanoDropOne,Thermo,美国)测定总RNA的浓度和判断RNA的质量;随后使用MightyScript Plus第一链合成试剂盒(生工生物工程股份有限公司)合成cDNA;再用PowerUp SYBR Green Master Mix试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行cDNA的扩增。反应体系为20 μL,反应程序和条件为:95 ℃下预变性2 min,95 ℃变性15 s,53 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,重复40个循环。引物相关信息见表2。
表2 内参基因和目的基因引物信息
Table 2 Primer information of internal reference genes and target genes
名称Name序列5’～3’Sequence 5’～3’GenBank登录号GenBank accession no.sod-FGGCAAGAATCATGCTGGTCCTAsod-RTCGTCAGCCTTCTCGTGGATEF681883.1cat-FAACGGCTACGGCTCTCACAcat-RCGCTCTGCCTCCTCTACCAAXM_020079314.1β-actin-FATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAβ-actin-RAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGGXM_020109620.1
1.5 数据统计与分析
利用SPSS 25软件对数据进行Kolmogorov-Smirnow正态分布检验和Levene方差齐性检验,满足2种检验条件后进行one-way ANOVA分析。利用Tukey test进行组间多重比较,在DMSO组与对照组无显著差异(P<0.05时表示差异显著)的基础上,以DMSO组为对照与各实验组进行比较。半致死浓度(LC50)通过Probit模型进行确定。数值结果以Mean±SD表示。
2 结果(Results)
2.1 SCCPs对褐牙鲆胚胎孵化的影响
本研究统计了胚胎60 hpf、72 hpf的孵化率,结果如图1(a)所示。可见各实验组60 hpf的孵化率均小于对照组,表明SCCPs推迟了褐牙鲆胚胎的孵化,其中1、1 000和10 000 μg·L-1组的孵化率分别为(7.7±5.8)%、(7.3±1.5)%和(7.0±1.0)%,与对照组(14.7±2.1)%存在显著差异(P<0.05)。在受精后72 h时,对照组胚胎的孵化率达到了(96.3±0.5)%,而1 000 μg·L-1组和10 000 μg·L-1组分别为(90.3±2.1)%、(91.0±4.4)%,均与对照组存在显著差异(P<0.05),此时其他低浓度(0.1、1、10和100 μg·L-1)实验组的孵化率与对照组无显著差异(P>0.05),这表明高浓度的SCCPs胁迫会导致褐牙鲆胚胎孵化率下降,但低浓度胁迫时对胚胎孵化率没有影响。此外,在10 000 μg·L-1组还发现了部分出膜困难的胚胎(胚胎存活,但未孵化出膜),在受精后84 h和108 h时仍未出膜,如图2(e)、图2(i),可见这些胚胎表面粗糙,附有大量颗粒杂质。
图1 短链氯化石蜡(SCCPs)对褐牙鲆胚胎化率和自主运动的影响
注:(a)各组60 hpf和72 hpf的孵化率;(b) 各组胚胎42 hpf自主运动情况;*代表示实验组与对照组间P<0.05,**代表P<0.01,***P<0.001;下同
Fig. 1 The effect of short chain chlorinated paraffins (SCCPs) on embryo hatching rate and autonomous movement
Note: (a) Hatching rate of embryos at 60 hpf and 72 hpf; (b) Autonomous movement of embryos at 42 hpf; asterisks denote significant difference between treatments and control, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.01; the same below.
图2 SCCPs诱导褐牙鲆胚胎-仔鱼产生的畸形类型
注:(a)、(b)、(c)和(d)为对照组36 hpf、48 hpf、72 hpf和108 hpf的胚胎或仔鱼;(e)、(i)分别为实验组84 hpf、108 hpf未孵化出膜的胚胎(HF);(f)为实验组48 hpf卵黄囊水肿(YSE)的仔鱼;(g)、(h)分别为实验组96 hpf、108 hpf脊柱弯曲(SC)、鳍膜损伤(FD)的仔鱼;(j)为实验组60 hpf仔鱼(YSE、FD);(k)、(l)为实验组108 hpf心包水肿(PE)、SC和YSE的仔鱼。
Fig. 2 Types of malformations induced by SCCPs in the Paralichthys olivaceus embryos
Note: (a), (b), (c), (d) The control group embryos at 24, 48, 72 and 96 hpf, respectively; (e), (i) Hatch failure (HF) embryos in the treatments at 84 hpf, 108 hpf, respectively; (f) Embryo with yolk sac edema (YSE) at 48 hpf; (g), (h) Larvae with spinal curvature (SC), fin membrane damage (FD) in the treatments at 96 hpf, 108 hpf, respectively; (j) Larvae with YSE and FD in the treatments at 60 hpf; (k), (l) Larvae with pericardial edema (PE), SC and YSE in the treatments at 108 hpf.
2.2 SCCPs对褐牙鲆胚胎致畸、致死作用
研究发现SCCPs对褐牙鲆胚胎具有致畸作用,且存在明显的剂量效应。如图3(a)所示,120 hpf时100、1 000和10 000 μg·L-1组的畸形率分别为(8.2±1.3)%、(10.6±4.3)%和(14.1±2.7)%,与对照组(3.8±1.4)%均有显著差异(P<0.05),但0.1、1和10 μg·L-1各组与对照组相比差异不显著(P>0.05)。在畸形个体中,畸形类型主要为脊柱弯曲(图2(g)、图2(h)、图2(k)、图2(l))、卵黄囊水肿(图2(f)、图2(j)、图2(l))、心包水肿(图2(k)、图2(l))、鳍膜损伤(图2(g)、图2(h)、图2(j)),同时发现随着暴露时间延长,畸形个体一般会同时表现出多种畸形类型,其中水肿现象较为普遍。
图3 SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼畸形率和存活率的影响
Fig. 3 Effect of SCCPs on embryonic malformation and survival rate of Paralichthys olivaceus
各组存活率的统计结果如图3(b)所示,在实验结束时(132 hpf),对照组存活率为(78.3±2.1)%,而100、1 000和10 000 μg·L-1组的分别为(68.7±2.9)%、(58.7±5.7)%和(52.3±2.8)%,与对照组均有显著差异(P<0.05),其他各浓度实验组则与对照无显著差异(P>0.05)。可见随着暴露浓度增加,存活率逐渐下降,表现出剂量效应。随着暴露时间增长,各实验组存活率逐渐降低,尤其是96～132 h高浓度实验组(100、1 000和10 000 μg·L-1组)仔鱼的存活率急速下降,时间效应明显。此外,通过Probit模型估算的SCCPs对褐牙鲆胚胎132 h-LC50为49 743.34 μg·L-1。
2.3 SCCPs对胚胎-仔鱼生长和卵黄吸收的影响
实验中SCCPs对褐牙鲆仔鱼表现出了生长抑制作用,如图4(a)所示,实验结束时(132 hpf)对照组仔鱼体长为(34.0±2.9) mm,高于各浓度的实验组,并与1、10、100、1 000和10 000 μg·L-1组差异显著(P<0.05)。如图4(b)所示,实验结束时(132 hpf)对照组卵黄囊面积要大于各实验组,且与各实验组均有显著差异(P<0.05)。
图4 SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼体长和卵黄囊面积的影响
Fig. 4 Effect of SCCPs on larvae body length and yolk sac area in Paralichthys olivaceus
2.4 SCCPs对仔鱼抗氧化系统的影响
SCCPs对褐牙鲆抗氧化酶SOD、CAT的活性及脂质过氧化产物MDA含量的影响如图5和图6所示。与对照组相比,SCCPs诱导了褐牙鲆仔鱼SOD活性增加,其中1 μg·L-1组的SOD活性为(95.53±3.32) U·mg-1,较对照组显著增加了192.3%(P<0.05);100 μg·L-1组的SOD活性为(54.10±8.52) U·mg-1,较对照组显著增加了65.53%(P<0.05);10 000 μg·L-1组的SOD活性为(40.12±3.06) U·mg-1,较对照组显著增加了22.8%(P<0.05)。同样,实验组CAT活性也高于对照组(0.42±0.09) U·mg-1,1、100和10 000 μg·L-1组分别为(1.27±0.30) U·mg-1、(0.78±0.09) U·mg-1和(0.73±0.19) U·mg-1。仔鱼sod、cat基因表达情况如图5(b)、5(d)所示,各实验组两基因的表达量均高于对照组,且随着实验浓度增加,基因表达情况有所抑制,这一规律也与抗氧化酶活力的变化相对应。
图5 SCCPs诱导褐牙鲆仔鱼产生的氧化应激
Fig. 5 SCCPs induced oxidative stress in Paralichthys olivaceus
图6 SCCPs诱导褐牙鲆仔鱼产生的丙二醛(MDA)
Fig. 6 SCCPs induced malonaldehyde (MDA) in Paralichthys olivaceus
对于MDA而言,本研究中1 μg·L-1组MDA含量为(13.32±0.24) nmol·mg-1,100 μg·L-1为(12.95±1.79) nmol·mg-1,10 000 μg·L-1组为(25.61±0.12) nmol·mg-1,均显著高于对照组的(8.86±1.44) nmol·mg-1(P<0.05),特别是10 000 μg·L-1组,MDA含量接近于对照组的3倍,表明机体已发生了严重的氧化应激反应。
3 讨论(Discussion)
SCCPs暴露会引起胚胎孵化延迟,高浓度胁迫时还会导致孵化率降低,如图1(a)所示。这一现象在斑马鱼中也有报道[21-22],但对其他水生生物孵化的影响还需要进一步研究。孵化是鱼类早期发育阶段的重要一环,一般包括2个过程,一是孵化腺分泌孵化酶、绒毛膜酶,引起卵膜膨胀、降解[26-27],二是胚胎机械运动使卵膜破裂[28-29]。本研究中发现SCCPs能够影响褐牙鲆胚胎的孵化,这与以上过程可能有关,遗憾的是本研究并没有对孵化酶进行研究。但关于胚胎的机械运动,我们发现在42 h时1、1 000和10 000 μg·L-1组胚胎的自主运动次数要低于对照组(图1(b)),均在4 次·min-1以下,由于这些胚胎自主运动的强度减弱,很难突破卵膜,使得实验组60 hpf的孵化率低于对照组,表现出孵化延迟的现象。而对于高浓度组出现胚胎出膜困难的现象,一方面可能是SCCPs抑制了胚胎的自主运动,使得胚胎出膜困难;另一方面可能是由于SCCPs具有亲脂性,大量附着在卵膜表面,呈现出颗粒状态(图2(e)、图2(i)),阻塞了气孔造成胚胎缺氧[30];早期研究,缺氧能够抑制胚胎发育,导致孵化延迟或死亡[31]。
SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼具有明显致死作用,这在非洲爪蟾[18]、虹鳟鱼[19]和斑马鱼[20]中均有报道。本实验中观察到SCCPs对褐牙鲆胚胎132 h的LC50为49 743.34 μg·L-1,而刘丽华等[21]发现SCCPs对斑马鱼胚胎96 h的LC50为1～10 mg·L-1,Fisk等[32]在日本青鳉鱼(Oryzias latipes)胚胎中发现其LC50值2.7～9.6 mg·L-1,相比较均低于本实验观察到的结果,这可能是物种耐受性不同引起的。值得注意的是Ren等[22]同样采用斑马鱼作为受试动物,在13 d的慢性毒性实验中发现SCCPs的LC50低至34.4 μg·L-1,可见暴露时间越长,其水生生物毒性越大,特别是对水生生物长期暴露的影响还需进一步深入研究。
诸多研究表明,环境污染物能够导致鱼类胚胎发育畸形[20,22,33-34]。本研究发现SCCPs对褐牙鲆胚胎同样具有致畸作用,且存在明显的剂量效应。Liu等[20]研究发现,SCCPs对斑马鱼胚胎发育毒性也具有低浓度致畸作用不明显、高浓度致畸作用显著的规律。值得注意的是,在畸形类型中水肿发生率较高,污染物导致鱼类水肿的发生可能与膜的通透性有关[35]。MDA作为脂质过氧化物,其含量能够反映生物膜受损程度,研究中观察到实验组仔鱼MDA含量显著高于对照组(图6),表明仔鱼体内生物膜发生了严重的脂质过氧化作用,生物膜结构和功能的损伤势必会影响其功能,改变通透性[36],最终导致了实验组大量水肿个体产生。此外,在实验结束时存活仔鱼中畸形个体仍占有一定量比例,对于畸形胚胎而言大多数最终会走向死亡[23],存活率会进一步降低。
体长是衡量仔鱼生长发育状况最直观的指标。由于整个实验过程处于内源性营养阶段,卵黄提供了胚胎生长发育所需的所有能量,卵黄囊面积在一定程度上能够反映胚胎-仔鱼能量利用的情况。我们结合体长规律发现,实验组胚胎-仔鱼消耗的能量多反而生长较慢(图4),这一现象在斑马鱼胚胎中也有发现[20],这可能是由于胚胎-仔鱼面临SCCPs的毒性胁迫,消耗了大量的能量用于解毒[37],导致分配给生长的能量减少,因而生长缓慢。
正常情况下,机体内ROS处于动态平衡状态,当受到污染物胁迫致使ROS积累时,机体的抗氧化系统会发挥作用,维持ROS代谢平衡,避免细胞遭受氧化损伤,影响组织、器官的功能。SOD和CAT是机体抗氧化防御系统的第一道防线[38],ROS过量时会诱导其活性增加,SOD能够催化
生成毒性较低的H2O2,而CAT负责催化H2O2分解成H2O和O2[39],因此,SOD和CAT的活性能够间接反映机体的氧化损伤情况,也被广泛地用于评价污染物的毒性效应中[40-42]。本研究中褐牙鲆仔鱼SOD、CAT活性及sod、cat基因的表达情况均显著高于对照组,表明SCCPs诱导机体发生了氧化应激反应,进而导致细胞损伤、凋亡,最终影响着生物体的代谢和免疫调节等[43]。研究发现,青鳉鱼幼鱼[44]、热带爪蛙胚胎[45]随着SCCPs暴露浓度的增加,机体SOD、CAT都呈下降趋势。原因可能是低浓度处理时,仔鱼产生适应性反应,通过提升抗氧化酶活性来消除ROS,保护机体免受氧化损伤;但随着SCCPs暴露浓度增加,机体产生的ROS大量积累,超过了抗氧化防御系统清除能力,过量ROS损伤抗氧化系统,致使抗氧化酶活性下降、相关抗氧化酶基因下调[46]。此外,由于MDA依赖于SOD进行清除,随着SCCPs浓度增加,SOD的活性逐渐下降,使得体内MDA含量增加,实验中SOD和MDA的变化规律也对应了起来。综上所述,我们认为SCCPs引起的氧化应激可能是导致褐牙鲆胚胎-仔鱼发育异常(畸形、死亡等)的主要原因,而这种氧化损伤即使在环境浓度(1 μg·L-1)下也会存在,结合其他毒性终点观察到的结果,我们认为短期环境浓度的SCCPs胁迫虽未导致鱼类存活率显著下降,但对鱼类的正常发育已产生影响。长期来看,这种影响可能会打破近海生态系统的稳定,导致鱼类资源量进一步下降。
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