二苯甲酮(benzophenones, BPs)类紫外线吸收剂是一类光稳定剂,目前较为广泛的应用于个人护理用品、食品包装、塑料、纺织品和汽车零件等产品中[1]。大量紫外线吸收剂通过直接迁移或污水排放而释放到环境中,流入海洋甚至极地,并产生累积[2],甚至会累积到人体中,危害人类的健康。BPs已在人类血液、尿液及母乳中被频繁检出[3-5],因此BPs的长期排放所带来的影响不容忽视。部分BPs类化合物已被列入“怀疑具有内分泌干扰效应的物质”[6]。研究表明,BPs能够影响中枢神经系统及神经系统的发育和功能[7-9],Fong等[10]研究发现2,2’,4,4’-四羟基二苯甲酮(2,2’,4,4’-tetrahydroxybenzophenone, BP2)会影响斑马鱼颅内神经嵴细胞的表达,Broniowska等[7]的研究表明BP2损害大鼠脑细胞中甲状腺激素的功能,影响中枢神经系统细胞活力,加剧神经退行性过程。Wnuk等[9]研究发现2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮(2-hydroxy-4-methoxybenzophenone, BP3)会介导细胞信号转导通路从而诱导神经细胞凋亡,Meng等[11]的研究表明BP3可使机体内分泌系统紊乱。
2,4-二羟基二苯甲酮(2,4-dihydroxybenzophenone, BP1)是一种典型的二苯甲酮类紫外线吸收剂[12],多次在沉积物、地表水及废水中检测出[13]。BP1是BP3在水环境和生物体内的主要代谢产物,因此推测BP1和BP3的毒性作用和分子机制相似[4,11,14]。Blüthgen等[14]的斑马鱼毒理实验表明,BP1和BP3会在成年斑马鱼体内积累。Mao等[15]研究发现,BP1具有毒性效应,会抑制藻类的细胞生长,王一超等[16]研究发现BP1会导致小鼠脑组织细胞中神经递质含量异常而引起神经毒性,Thia等[17]的大鼠毒理实验表明,BP1可以影响雄激素的合成,干扰内分泌代谢过程。BP1的暴露严重影响环境及危害人类健康。
随着社会的发展,新型的环境有机污染物越来越受到关注。二苯甲酮类紫外稳定剂是其中一种。研究表明,环境有机污染物有神经内分泌毒性作用。神经系统和内分泌系统相互作用对机体产生影响。本课题组以往研究发现,双酚芴对斑马鱼中枢神经系统的发育、运动、神经元分化以及下丘脑-垂体-甲状腺轴(hypothalamic-pituitary-thyroid axis, HPT)基因表达有影响[18]。斑马鱼拥有和人类相似的神经系统和甲状腺激素(thyroid hormone, TH)结构[19],是一种常用的环境毒理研究模式生物。本研究以斑马鱼为模型,利用转录组测序技术研究BP1处理组和空白对照组斑马鱼基因表达的差异,观察斑马鱼运动行为、甲状腺发育情况以及通过实时荧光定量PCR检测与神经内分泌相关的部分基因表达水平来探究BP1对斑马鱼神经内分泌的毒性作用,为BP1的安全使用提供参考。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 材料
1.1.1 斑马鱼
转基因斑马鱼ioz4Tg/+(AB)、野生型斑马鱼AB品系均由山东省科学院生物研究所药物筛选实验室提供。
1.1.2 试剂药品
BP1粉末(由齐鲁工业大学制备),二甲基亚砜(DMSO)(北京索莱宝科技有限公司,中国),亚甲基蓝三水合物(国药集团化学试剂有限公司,中国),1-苯基-2-硫脲(PTU)(美国Sigma公司),RNA试剂盒(RN28,北京艾德莱生物科技有限公司,中国);反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(近岸蛋白质科技有限公司,中国)。
1.1.3 仪器设备
斑马鱼养殖系统(北京爱生科技发展有限公司,中国),Zebrabox斑马鱼行为分析仪(ZebraLab 3.3,法国Viewpoint公司),蔡司荧光显微镜(AXIO-V16,德国Carl Zeiss光学有限股份公司),梯度PCR仪(C1000 Touch,美国Bio-Rad公司),实时荧光定量PCR仪(Light Cycler®96,瑞士Roche诊断产品有限公司)等。
1.2 方法
1.2.1 BP1溶液的制备
制备BP1粉末[20],将BP1粉末用DMSO溶解,按实验分组用培养液稀释到相应的浓度(每个实验组的DMSO浓度不超过5‰)。
1.2.2 斑马鱼胚胎培养与给药
将成年的雌雄斑马鱼于水温28 ℃斑马鱼养殖系统中分开饲养,光暗周期14 h∶10 h交替进行,每日定时喂食丰年虾2次。实验前一天下午将一年左右鱼龄的斑马鱼按雌雄比例2∶2放入有隔板的产卵缸中。次日早上8: 30抽取隔板,2 h后收取鱼卵,将死卵及未受精的卵剔除,培养液冲洗2次,放入新的培养液中,加入2 mg·L-1的亚甲基蓝2～3滴,进行后续实验。4 hpf后,将斑马鱼胚胎放于6孔板中,每孔放入30个胚胎,根据前期斑马鱼耐受试验,用BP1处理斑马鱼胚胎144 h,确定了最小致死浓度(lethal concentration 1, LC1)为1 μg·mL-1,半数致死浓度(50% lethal concentration, LC50)为2.4 μg·mL-1。选取3个实验组:空白对照组(Ctl)、0.8 μg·mL-1低浓度BP1处理组、2.4 μg·mL-1高浓度BP1处理组。转基因斑马鱼ioz4Tg/+(AB)需用0.003%(m/V)PTU处理,以抑制黑色素的形成,便于后期在显微镜下观察记录。加完药后,将6孔板放入培养箱内培养,每日定时更换含有药品的培养液。
1.2.3 转录组测序
为了鉴定斑马鱼在BP1处理后的显著差异表达基因,6 dpf时,将2.4 μg·mL-1BP1处理组(BP1组)与空白对照组(Ctl组)斑马鱼组织破碎,提取mRNA,对照组和BP1组各用3组检测合格的mRNA样品进行建库,由欧易生物进行转录组测序。
1.2.4 斑马鱼幼鱼运动行为学检测
6 dpf时,将野生型斑马鱼幼鱼的不同组别逐条放入48孔板中,每孔一条,将48孔板放入Zebrabox斑马鱼行为分析仪暗箱中适应10 min后,开始进行10 min黑暗环境-10 min光照环境交替进行的行为学检测,采集60 min内幼鱼的运动视频。运用Zeblab软件进行数据处理,计算每条鱼游动的距离。
1.2.5 斑马鱼甲状腺的发育情况
6 dpf时,在蔡司荧光显微镜下,选取不同实验组的转基因斑马鱼ioz4Tg/+(AB)(n=6)观察斑马鱼甲状腺的发育情况。
1.2.6 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)测定神经内分泌相关基因mRNA表达水平。取6 dpf的斑马鱼幼鱼(n=30)进行RNA提取,提取步骤参照试剂盒说明书,利用超微量分光光度计测定提取的RNA浓度,参照反转录试剂盒说明书将RNA反转为cDNA;RT-qPCR步骤参照实时荧光定量PCR说明书。RT-qPCR结束后输出对照组和待测组目的基因(gfap、gap43、trα、trβ、tshr、tg、dio1和dio2)的Cq值以及内参基因rpl13a的Cq值,以相对定量法用2-ΔΔCt计算各组基因的相对表达量,对部分与神经内分泌相关的基因进行验证。
1.2.7 差异基因分析
将基因表达量的变化倍数为2倍以上的基因作为显著差异(P<0.05)表达基因。以热图、火山图和PCA图的形式对显著差异表达基因进行聚类分析比较。对显著差异表达基因进行GO和KEGG Pathway功能分析。
1.2.8 统计学方法
利用软件Graphpad prism 7.0对实验结果以单因素方差分析法(One-way ANOVA)进行组间比较分析,数据结果用平均值±标准误差(means±SEM)表示。P<0.05表示组间差异具有统计学意义。
2 结果(Results)
2.1 显著差异表达基因的检测结果
实验流程如图1(a)所示,收集6 dpf的斑马鱼进行转录组测序分析。如图1(b)和1(d)所示,各组3个测序样本之间聚集良好,说明该组表达模式在3个测序样本之间较一致。如图1(c)所示,空白对照组与BP1组显著差异表达基因的数量为390个,其中上调基因98个,下调基因292个(图1(c))。
图1 基因表达水平分析结果
注:(a)实验流程图;(b)样本聚类结果;(c)火山图;(d)PCA图。
Fig.1 Gene expression level analysis results
Note:(a)Experimental flow chart;(b)Sample clustering results;(c)Volcanic plot;(d)PCA plot.
2.2 显著差异表达基因GO功能分析结果
对空白对照组与BP1组显著差异表达基因进行GO富集分析,共获得46个GO条目(图2)。富集条目包括代谢过程(metabolic process)、对刺激的反应(response to stimulus)、生物调控(biological regulation)、生物过程的调控(regulation of biological process)、发育过程(developmental process)、信号(signaling)、行为(locomotion)和神经突触(synapse)等与神经内分泌相关。
图2 显著差异基因GO富集结果
Fig. 2 GO enrichment results of significantly different genes
2.3 显著差异表达基因KEGG Pathway分析结果
将显著差异表达基因进行KEGG通路富集分析,结果显示显著差异基因参与6种功能类别的相关途径,主要富集于脂质代谢(lipid metabolism)、信号转导(signal transduction)、内分泌系统(endocrine system)、信号分子与相互作用(signaling molecules and interaction)、运输和分解代谢(transport and catabolism)和细胞生长与死亡(cell growth and death)等通路(图3)。其中,富集在信号传导及内分泌系统等与神经内分泌相关通路的显著性差异基因较多。
图3 显著差异基因的KEGG通路富集结果
Fig. 3 KEGG pathway enrichment results of significantly different genes
2.4 BP1暴露对斑马鱼幼鱼运动行为的影响
以斑马鱼为模型验证BP1对行为的影响。如图4(a)所示,与空白对照组相比,BP1组斑马鱼幼鱼运动总距离低于空白对照组,2.4 μg·mL-1BP1组部分幼鱼甚至停滞不动。与空白对照组相比,BP1组幼鱼的运动速度变慢,活力显著降低。且2.4 μg·mL-1BP1组幼鱼应对明暗交替环境刺激的反应异常,在光照时并没有表现出正常的速度升高趋势(图4(b))。如图4(c)和4(d)所示,BP1组幼鱼在黑暗、光照条件下的运动距离均低于空白对照组。说明BP1暴露可导致斑马鱼幼鱼运动障碍。
图4 行为学检测结果
注:(a)斑马鱼60 min运动总距离;(b)斑马鱼游动速度;(c)斑马鱼在黑暗环境下运动的距离;(d)斑马鱼在光照环境下运动的距离;*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。
Fig.4 The locomotion test results
Note:(a)Total distance of 60 min movement of zebrafish;(b)Swimming distance of zebrafish per minute;(c)Distance of zebrafish moving in dark environment;(d)Distance of zebrafish moving in the light environment; *represents P<0.05, **represents P<0.01, and ***represents P<0.001.
2.5 BP1暴露对斑马鱼甲状腺发育的影响
6 dpf时,空白对照组斑马鱼的甲状腺清晰可见。与空白对照组相比,BP1给药组的甲状腺发生了明显的变化,甲状腺发育受损、变小(图5中红色箭头标注),说明BP1对甲状腺的发育有毒性作用。
图5 不同浓度的2,4-二羟基二苯甲酮(BP1)对斑马鱼甲状腺的毒性作用
注:黄色虚线内荧光部分为斑马鱼甲状腺;红色箭头表示甲状腺发育的受损部位。
Fig.5 Toxic effects of different concentrations of 2,4-dihydroxybenzophenone(BP1)on zebrafish thyroid
Note: The fluorescent part in the yellow dotted line box is zebrafish thyroid; red arrow indicates the damaged part of thyroid development.
2.6 BP1对神经内分泌相关基因表达的影响
基于上述检测结果,为了进一步验证BP1对神经内分泌的影响,选择神经及甲状腺相关基因(gfap、gap43、tshr、tg、dio1、dio2、trα和trβ)开展mRNA表达水平的检测。结果如图6所示,与空白对照组相比,0.8 μg·mL-1组gfap、tshr和trβ表达降低,dio2表达升高,gap43、tg、dio1和trα表达无明显变化;2.4 μg·mL-1组gfap、tshr、dio1、trα和trβ表达降低,gap43和tg表达升高,dio2表达无明显变化。
图6 基因表达水平
注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。
Fig.6 Gene expression level
Note: *represents P<0.05, **represents P<0.01, and ***represents P<0.001.
3 讨论(Discussion)
由于BP1使用广泛,经常在不同环境中检测到,因此它引起人们越来越多的关注[21]。最新研究发现,我国年轻人尿液中BP1的检出浓度仅次于BP3的浓度[3],且浓度高于之前的报道值。BP3能对神经内分泌产生影响[22],而BP1的神经内分泌干扰作用很少有研究报道。本研究采用转录组测序技术对比了空白对照组和BP1组斑马鱼基因表达的差异,结果显示,显著差异表达的基因大多与神经内分泌通路密切相关,包括信号传导、内分泌系统、对刺激的反应、行为和神经突触等。因此,推测BP1对斑马鱼具有神经内分泌干扰作用。
以往研究发现,BP3通过调节钙信号通路干扰神经系统,BP3诱导神经发育凋亡并影响斑马鱼的运动和反应能力[11];BP3使斑马鱼反应降低,行为减少,轴突生长减少,对发育中的斑马鱼胚胎具有神经毒性作用[23]。以上结果与本研究结果相似,本研究发现,BP1暴露后斑马鱼运动平均速度变慢、运动总距离变短,且高浓度暴露后斑马鱼反应能力受到影响。研究发现,BPs具有内分泌干扰潜力,会影响甲状腺的功能,影响TH水平而干扰HPT轴[11,24-25],TH的合成与转运等过程主要受到HPT轴线的调控[26]。TH主要在甲状腺内进行合成、储存与释放。甲状腺组织结构发生改变会影响TH的合成、分泌,TH是甲状腺是否受到干扰的重要标志物[19]。以往研究发现,BP1、BP3和2,2’-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮(2,2’-dihydroxy-4-methoxybenzophenone, BP8)可使斑马鱼幼鱼TH下降[27]。本实验发现,暴露于BP1中,斑马鱼甲状腺发育受到了影响。甲状腺发育的缺失,可能影响TH的合成。以上结果表明BP1具有一定的神经内分泌干扰作用。
胶质纤维酸性蛋白(Gfap)是一种在中枢神经系统的成熟星形胶质细胞的骨架中表达的中间丝蛋白[28]。gfap基因可作为分析斑马鱼神经毒性的生物标记物[29],具有神经毒性作用的化学物质会引起斑马鱼gfap基因表达下降[30]。本研究结果显示gfapmRNA表达下降,说明BP1可能造成了神经胶质细胞的损伤。生长相关蛋白43(Gap43)主要位于突触前膜上,在发育过程中介导轴突生长,参与神经发育、转导细胞内外信号,反映突触结构功能变化,被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子,可作为神经元损伤后再生的标志[31]。Gap43是随着突触连接重建出现的,可以作为检测突触活力的突触前特异性标志物[32],BP3使gap43基因表达上调[23]。这与我们的研究结果一致,gap43mRNA表达上升说明BP1可能造成了神经元的损伤。为了验证BP1的神经内分泌毒性,本研究开展了甲状腺功能基因的检测。促甲状腺激素(TSH)是一种重要的垂体激素,调节维持甲状腺发育和功能正常,促使TH的合成与分泌[33]。内分泌干扰物会影响促甲状腺激素受体(TSHR),从而影响甲状腺功能[34],Sun等[35]发现内分泌干扰物会降低大鼠的TSHRmRNA水平表达,本研究中tshrmRNA的表达降低,可能BP1通过抑制tshrmRNA的表达来影响TH的合成。甲状腺球蛋白(TG)是甲状腺激素合成的基质,参与TH的合成[36]。Lee等[27]研究发现BPs能上调tg基因,这与本研究结果一致,tgmRNA的表达量升高,可能是TH的降低导致的负反馈调节。脱碘酶(Dio)在TH的代谢过程中起很大的作用。有研究指出Dio1在机体内的主要作用是降解失活的TH[37]。结果显示,dio1mRNA表达水平下降,可能是BP1抑制了Dio1的脱碘作用,抑制失活的TH降解。神经内分泌干扰物会提高dio2mRNA的表达量[38]。本研究中dio2mRNA水平上调说明可能是BP1影响了甲状腺的功能。TH与甲状腺激素受体(TRs),在脊椎动物的生长和代谢中起着重要作用[39]。内分泌干扰物能通过影响TRs的表达影响干扰甲状腺功能[40-41]。本研究中trα和trβmRNA表达水平的降低,说明BP1影响了斑马鱼甲状腺功能。
综上所述,本文研究结果初步探索了BP1对斑马鱼神经内分泌毒性效应,为BP1的深入研究提供了参考,同时对BP1环境暴露的健康风险评估和污染预警具有重要的参考价值。随着社会的发展,越来越多新型的环境有机污染物受到人们关注,大部分新型环境污染物在水、土地等环境中被广泛检出,对人类健康造成很大风险。环境污染物被广泛使用而对人类、生态系统造成很严重的影响,所以应该对相关污染物展开进一步研究,制定相应的措施。
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