微塑料是指尺寸<5 mm的塑料或合成橡胶颗粒、碎片及纤维等。轮胎微塑料是环境中微塑料的重要来源之一[1-2]，广泛分布于水、大气和土壤等环境介质中[3]。研究发现，常见地表水中轮胎微塑料的浓度为0.09～10 mg·L-1[3]，而河流沉积物中的浓度高达400～2 200 mg·kg-1[4]。轮胎微塑料的化学性质稳定、难降解、粒径小且分布范围广，可在环境中持久存在，并吸附多种污染物，具有较高的生态风险。
轮胎微塑料对水生生物具有一定的毒性效应[4-6]。Wik等[5]研究了轮胎微塑料浸出液对月牙藻(72 h生长抑制率)、大型溞(24～48 h死亡率)、网纹溞(48 h存活率，9 d繁殖率和存活率)以及斑马鱼胚胎(48 h致死率)的毒性，发现浸出物对网纹溞的9 d繁殖率影响最为显著，对应的半数效应浓度(EC50)值为10 mg·L-1，该浓度与路面径流中轮胎微塑料的预测浓度接近。Marwood等[6]发现温度是影响轮胎微塑料浸出液毒性的重要因素，在21 ℃时，浸出液对月牙藻(72 h生长抑制率)、大型溞(48 h存活率)和鲦鱼(48 h存活率)的EC50或半数致死浓度(LC50)值均>10 g·L-1，而当温度升高至44 ℃时，浸出液对大型溞的LC50值降低至5 g·L-1。以上研究均是用轮胎微塑料浸出液进行的短期急性毒性测试，所使用的轮胎微塑料浓度也比实际环境中的浓度高出多个数量级。与以上实验室暴露不同，真实水环境中的轮胎微塑料暴露是直接、低剂量而长时间的，其毒性效应尚不明晰。因此，开展轮胎微塑料对水生生物的毒性研究，尤其是环境浓度下的慢性毒性研究，对评估其生态风险具有重要意义。
本文以不同粒径的轮胎微塑料为研究对象，使用大型溞作为受试模式生物，研究轮胎微塑料对大型溞的死亡率、蜕皮频率和繁殖力的影响，并通过测定大型溞体内各种金属的含量，以及蛋白质/脂肪来初步探究轮胎微塑料的慢性毒性机理，以期为正确评估轮胎微塑料生态风险提供科学依据。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 实验材料及生物
实验使用的轮胎微塑料为实验室自制；将废弃汽车轮胎剪碎后放入研磨机(Tube Mill control，广州艾卡仪器公司，中国)中反复研磨，研磨粉末依次过100目、150目和200目筛湿筛，收集过筛后不同粒径范围的轮胎微塑料。
受试生物大型溞(Daphnia magna)培养于光照培养箱(HP1500G型，武汉瑞华仪器，中国)中，培养温度为22 ℃，光暗周期为14 h/10 h，培养用水为脱氯自来水，并每日喂食斜生栅藻。毒性测试开始前，将待产的母溞分离培养，次日即可获得日龄<1 d的幼溞用于实验。
1.2 研究方法
1.2.1 轮胎微塑料的物理化学性质表征
对制备好的轮胎微塑料颗粒进行颗粒密度、形貌与粒径以及重金属含量等理化性质表征。通过观察轮胎微塑料在不同密度溶液中的漂浮、悬浮和沉底状态来测量其密度范围。使用扫描电镜(S-4800，日立公司，日本)和激光粒度仪(MS2000，马尔文公司，英国)测定轮胎微塑料颗粒的形貌和粒径。使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS；7700x，安捷伦公司，美国)测定轮胎微塑料中Na、Mg、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Ag、Cd和Pb等金属的含量。
1.2.2 轮胎微塑料对大型溞的慢性毒性测试
大型溞慢性毒性实验设置6个轮胎微塑料暴露组、1个阳性对照组(Cr浓度20 μg·L-1的K2Cr2O7溶液)和1个阴性对照组(脱氯自来水)，每组3个平行。其中轮胎微塑料暴露组包括了3个微塑料粒径(100目、150目、200目)和0.5 mg·L-1、62.5 mg·L-1 (预实验显示此浓度对大型溞的生产具有负效应)2个颗粒浓度。
毒性测试在光照培养箱中进行(与大型溞培养条件相同)。向每个盛有200 mL暴露液的250 mL锥形瓶中加入20只日龄<1 d的幼溞进行暴露。锥形瓶置于振荡器(HY-2型，国华电器有限公司，中国)上，转速30 r·min-1，使轮胎微塑料悬浮。暴露持续21 d，每日定时喂食斜生栅藻一次，喂食浓度为5×105 cells·mL-1。每2 d更新一次暴露液。暴露期间每日观察，记录死亡数、蜕皮数、产幼数，同时将新生幼体取出，并用显微镜观测死亡的大型溞以及大型溞蜕皮。21 d暴露结束后，收集存活的大型溞，用去离子水清洗后，置于2 mL离心管中，放入液氮冷冻，并冷冻干燥。冻干后大型溞称取干质量，用于测定金属元素浓度。
1.3 分析测试方法
1.3.1 轮胎微塑料颗粒密度的测定
参考Li等[7]的实验方法，使用NaI溶液(1.8 g·cm-3)、酒精(0.8 g·cm-3)和去离子水(1.0 g·cm-3)，按不同体积比配制不同密度(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7和1.8 g·cm-3)的溶液。将少量轮胎微塑料颗粒分别加入不同密度溶液中，超声混合5 min(KQ-5200DE超声波清洗仪，昆山舒美超声仪器有限公司，中国)后静置24 h，观察各溶液中微塑料的漂浮、悬浮和沉底状态。
1.3.2 轮胎微塑料和大型溞体内金属含量的测定
称取一定质量轮胎微塑料或冻干的大型溞于2 mL离心管中，加入适量65% HNO3，冷消解过夜，然后在80 ℃下消解6 h。用超纯水稀释消解液，过滤(0.45 μm孔径滤膜)。使用ICP-MS测定Na、Mg、K、Ca、Mn、Fe、Co、Ni、Cu和Zn等金属含量。
1.3.3 大型溞体内蛋白质/脂肪的测定
取适量冻干大型溞与150 mg KBr固体混匀研磨成粉末，制成压片后利用傅里叶红外光谱仪(iS10，美国热电公司)测定，得到各波长下能量含量变化，通过计算1 720～1 485 cm-1和3 000～2 830 cm-1这2个波段的面积比得到蛋白质与脂肪含量比[8]。
1.4 统计分析
在R(v4.1.2)中进行了方差分析(ANOVA)和事后检验(Tukey法)，以比较不同处理组与阴性对照组的内禀增长率等。数据需检验是否满足残差的正态分布(Shapiro-Wilk正态性检验)和方差齐性(Levene检验)，并在必要时进行对数转化。当P<0.05时，认为差异显著。
2 结果(Results)
2.1 轮胎微塑料物理化学性质
2.1.1 颗粒密度
在密度为1.0 g·cm-3的溶液中，轮胎微塑料颗粒全部沉底；在1.1 g·cm-3的溶液中，颗粒部分悬浮；在1.2 g·cm-3的溶液中，颗粒全部漂浮。这表明颗粒的密度范围为1.0～1.2 g·cm-3 (图1)。可以预测，进入水体的轮胎微塑料最终会沉入沉积物，但会有部分颗粒暂时悬浮于水中。本研究的受试生物大型溞是滤食性浮游动物，也会扰动并摄食表层沉积物，因而能通过不同方式摄食入轮胎微塑料。
2.1.2 颗粒粒径
通过激光粒度仪进一步测定轮胎微塑料粒径。过100目、150目和200目筛所得轮胎微塑料的平均粒径的范围为67～150 μm，这与环境中轮胎微塑料粒径的文献报道值相近。Kreider等[9]从路面收集轮胎微塑料颗粒，其粒径为4～350 μm，中位值在100 μm。Leads和Weinstein[10]从水体和沉积物样中分离获得轮胎微塑料颗粒，近70%的颗粒尺寸在63～149 μm之间。SEM形貌观察发现轮胎微塑料颗粒呈不规则的长条形和圆球形，表面粗糙(图1)，这与在路面上收集到的轮胎磨损产生的颗粒具有相似性[10-11]。因此，本研究所使用的轮胎微塑料从粒径和形貌上具有代表性。
图1 轮胎微塑料颗粒密度测定结果及扫描电镜观测图
Fig. 1 Density measurement and scanning electron microscope observations of tire-derived microplastics
2.1.3 轮胎微塑料颗粒的金属含量
轮胎微塑料含有大量的Ca (>15 mg·g-1)、Zn (>10 mg·g-1)、Na (4～6 mg·g-1)、K (2～3.5 mg·g-1)、Fe (2～5 mg·g-1)和Mg (0.9～2.5 mg·g-1)，中等含量的Cr (50～120 μg·g-1)、Mn (20～50 μg·g-1)、Co (5～20 μg·g-1)、Ni (30～70 μg·g-1)、Cu (30～130 μg·g-1)、Se (20～22 μg·g-1)、Pb (19～23 μg·g-1)，以及少量的As (0.4～0.6 μg·g-1)、Ag (0.02～0.03 μg·g-1)、Cd (0.5 μg·g-1) (表1)。不同粒径的颗粒中Ca、Zn、Se、Cd和Pb的浓度范围基本一致，而粒径越小的颗粒含Na、Mg、K、Co和Cu浓度越高。这可能与轮胎微塑料上不同金属的浸提效率有关。前几种金属的提取不受颗粒比表面积影响，而后几种金属的提取效率则受颗粒比表面积控制，表现为比表面积越大越易提取。
表1 不同粒径的轮胎微塑料中金属元素浓度
Table 1 Metal concentrations in tire-derived
microplastics of different particle sizes
元素Element浓度/(μg·g-1)Concentration/(μg·g-1)100目100-mesh150目150-mesh200目200-meshNa380±69464±39581±11Mg925±181 360±802 340±110K219±13258±19333±10Ca15 400±60016 800±70015 700±600Cr103±1454.5±5.5117±4Mn21.7±3.324.2±1.946.9±2.6Fe1 960±7402 110±804 700±300Co4.88±0.1511.2±0.318.4±6.6Ni41.2±1.929.7±2.668.6±13.9Cu31.3±2.656.1±14.3128±31Zn11 600±20011 400±40010 900±400As0.379±0.1420.362±0.0210.613±0.107Se21.5±1.721.6±0.820.0±2.6Ag0.0212±0.00460.0202±0.00270.0299±0.0025Cd0.487±0.0150.509±0.0410.508±0.011Pb19.4±0.720.7±0.522.9±0.5
2.2 轮胎微塑料对大型溞的慢性毒性效应
2.2.1 对存活率、蜕皮数和繁殖能力的影响
经21 d暴露，阴性对照组大型溞的死亡率在2%以内；阳性对照组的死亡率超过30%；轮胎微塑料暴露组的死亡率在5%～20%之间(图2(a))。这说明不同粒径和浓度的轮胎微塑料均会降低大型溞的存活率。轮胎微塑料暴露组的死亡率均不高于20%，说明毒性效应不大。此外，在浓度为0.5 mg·L-1的暴露组中，大型溞的存活率随微塑料粒径的减小而升高；而在62.5 mg·L-1的暴露组中，大型溞的存活率随粒径的减小而降低。
轮胎微塑料暴露没有明显改变大型溞的蜕皮频率。如图2(b)所示，暴露组与对照组的大型溞在21 d中蜕皮9次左右，平均蜕皮数接近。
轮胎微塑料暴露对大型溞的繁殖有可观测的影响(图2(c))。暴露组的累积产幼数量接近甚至高于阴性对照组，但是暴露组的初次生产时间滞后于阴性对照组。暴露于62.5 mg·L-1的轮胎微塑料，大型溞初次生产的时间延后3～5 d。而暴露浓度为0.5 mg·L-1时，生殖延后效应较小，仅在较大粒径(100目)组观察到初次生产时间延后4 d。该结果表明轮胎微塑料对大型溞繁殖能力的不利影响主要体现在发育抑制上，而非体现在产幼数量上。
图2 暴露于不同粒径、浓度轮胎微塑料的大型溞21 d存活率(a)、存活个体累积平均蜕皮数(b)和
存活雌性个体累积平均产幼数(c)
Fig. 2 Survivorship (a), accumulative number of moltings (b) and offspring (c) of Daphnia magna
in the 21-d exposure to tire-derived microplastics of different particle sizes and concentrations
内禀增长率(rm)综合反映轮胎微塑料对大型溞生存与繁殖的影响(图3(a))。暴露于62.5 mg·L-1的轮胎微塑料，rm值(0.231～0.255 d-1)显著低于阴性对照的(0.294±0.014) d-1 (F3,8=18.15, P<0.01)，而与阳性对照的(0.250±0.011) d-1接近 (F3,8=2.987, P=0.096)。暴露于0.5 mg·L-1的轮胎微塑料，rm值与阴性对照组接近，种群增长速率未受影响。
图3 暴露于不同粒径、浓度轮胎微塑料的大型溞内禀增长率(rm) (a)和体内蛋白质/脂肪的含量比(b)
注：灰色水平实线和虚线是阴性对照组的内禀增长率或蛋白质/脂肪的含量比值(均值±标准差)，红色水平实线和虚线是阳性对照组的
内禀增长率或蛋白质/脂肪的含量比值(均值±标准差)；*表示处理组与阴性对照有显著差异(ANOVA，Tukey检验，P<0.05)。
Fig. 3 Intrinsic population growth rate (rm) (a) and protein-to-lipid ratio (b) of Daphnia magna exposed to
tire-derived microplastics of different particle sizes and concentrations
Note: Grey solid and dashed lines represent negative control for intrinsic population growth rate or protein-to-lipid ratio
(mean±standard deviation), and red solid and dashed lines represent its positive control (mean±standard deviation);
*represents P<0.05, compared with negative control (ANOVA，Tukey test).
2.2.2 对大型溞体内金属元素浓度的影响
在低浓度(0.5 mg·L-1)暴露水平下，轮胎微塑料的存在基本不会引起大型溞体内金属含量的变化，而高浓度的轮胎微塑料暴露会导致大型溞体内重金属Co、Cu和Zn的增加以及生长的必需金属元素Ca、Fe的减少(图4)。62.5 mg·L-1轮胎微塑料实验组中的大型溞体内重金属Co、Cu、Zn含量高于阴性对照组和低浓度实验组(图4(a))；而大型溞体内生长的必需金属元素Ca和Fe的含量则低于阴性对照组和低浓度实验组(图4(b))。轮胎微塑料暴露对其他元素(Ag、As、K、Mg、Mn、Na、Pb和Se等)的浓度没有明显的影响(数据未显示)。
图4 暴露于不同粒径、浓度轮胎微塑料的大型溞体内Co、Cu、Zn含量(a)和Ca、Fe含量(b)
注：蓝色水平实线和虚线是阴性对照组的金属浓度(均值±标准差)。
Fig. 4 Concentrations of Co, Cu, Zn (a) and Ca, Fe (b) in Daphnia magna exposed to tire-derived microplastics
of different particle sizes and concentrations
Note: Blue solid and dashed lines represent negative control (mean±standard deviation).
高浓度暴露处理明显提升大型溞体内Zn的含量，说明在高浓度暴露水平下，被大型溞摄入的轮胎微塑料颗粒在其肠道内释放重金属Zn，进而产生毒性效应，使大型溞死亡率增加。同时，轮胎微塑料颗粒在肠道内的停留可能减少大型溞对食物的摄入，并且Zn干扰了Ca和Fe的吸收，这使得大型溞体内Ca和Fe元素含量下降，从而抑制了大型溞的生长发育，使大型溞初次生产的时间延迟3～5 d。因此，在高浓度暴露水平下，轮胎微塑料被大型溞摄入后，颗粒本身及其释放的有害物质导致大型溞死亡率的增加和生殖延后。
在高浓度实验组中，大型溞体内重金属Co、Cu和Zn的含量随轮胎微塑料粒径的减小而呈现上升趋势(图4(a))。这与暴露实验中大型溞的死亡率的规律一致，进一步说明高浓度轮胎微塑料对大型溞的毒性主要是由其释放的Zn等重金属引起的。低浓度暴露组中大型溞体内重金属Zn的含量与阴性对照组差别不大，这表明低浓度轮胎微塑料对大型溞的毒性不是由其释放的毒性物质主导的，而主要是由颗粒本身所导致的。
2.2.3 对大型溞体表的影响
通过显微镜观察到大型溞蜕皮内外表面粘附着大量轮胎微塑料颗粒。死亡个体的肠道内也充塞着轮胎微塑料，且有大量颗粒粘附在其附肢表面(图5)。这说明轮胎微塑料会阻塞大型溞的消化道，并会干扰其运动和滤食。
图5 暴露于轮胎微塑料的死亡大型溞个体及大型溞蜕皮的显微镜观察图
Fig. 5 Microscopic observation of the dead individuals of Daphnia magna and the shed
molts after exposure to tire-derived microplastics
2.2.4 对蛋白质/脂肪的影响
实验组与阴性对照组的大型溞体内蛋白质/脂肪的值大小相似，但低于阳性对照组(图3(b))。阳性对照组中Cr(Ⅵ)毒性使得大型溞体内脂肪消耗增加，从而导致蛋白质/脂肪的增大。轮胎微塑料摄入虽然会阻塞消化道并对大型溞产生刺激作用，但并未改变大型溞体内蛋白质和脂肪的消耗和分配。
3 讨论(Discussion)
在环境相关浓度下，轮胎微塑料会对大型溞产生一定的慢性毒性。本研究发现暴露在0.5 mg·L-1轮胎微塑料中21 d，大型溞的死亡率(5%～20%)高于阴性对照组(2%)，且较大粒径的轮胎微塑料使大型溞初次生产的时间延后了4 d。而关于轮胎微塑料对大型溞的急性毒性研究发现625～10 000 mg·L-1的轮胎磨损颗粒在标准实验温度(21 ℃)条件下的浸出液均不会导致大型溞的死亡[6]。本研究中轮胎微塑料之所以会对大型溞产生慢性毒性，可能是由于暴露时间的延长导致的，也可能是轮胎微塑料在更长的暴露时间中释放出的化学物质所导致的。
虽然暴露在环境相关浓度水平下的轮胎微塑料会对大型溞产生一定的慢性毒性，但毒性较小。在本研究中，0.5 mg·L-1轮胎微塑料悬浮液中大型溞的死亡率均<20%，轮胎微塑料对蜕皮频率和平均产幼数量均无明显的不利影响，这与一些研究结果相似。Redondo-Hasselerharm等[2]研究发现即使是在暴露浓度为沉积物干质量的10%的情况下，沉积物中的轮胎磨损颗粒对底栖动物钩虾、栉水虱、颤蚓和带丝蚓的影响很小。Khan等[12]在钩虾的毒性测试中也发现，在较高的暴露浓度(0.15～0.59 g·L-1)下，钩虾的存活率、繁殖率和生长率才会受到显著的负面影响。但Wik等[5]的研究表明在环境预测浓度(13 mg·L-1)水平下，轮胎微塑料对网纹溞的9 d繁殖率有显著影响，其毒性测试中仅使用了轮胎胎面颗粒的浸出液。已有研究确定轮胎微塑料与胎面颗粒的化学组成存在较大差异[9]，二者所释放的化学物质也会不同。此外，Halle等[13]的研究比较了使用研磨机制作的轮胎微塑料的悬浮液和浸出液对端足类生物的急性毒性，结果表明在整个测试范围内(0～2.55 g·L-1)轮胎微塑料悬浮液的毒性比轮胎微塑料浸出液更高，且研究发现浸提操作并未将某些有害物质(辛硫醇、菲、蒽和铝)提出。这表明用浸出液来测试轮胎微塑料对水生生物的毒性并不能准确评估真实环境中轮胎微塑料的生态风险。
轮胎磨损颗粒浸出毒性研究表明，浸出液中的Zn和有机物是轮胎磨损颗粒对水生生物产生毒性效应的主要原因，且轮胎磨损颗粒对水生生物的毒性大小取决于它的量和其释放的有害物质的量[5-6]。Tian等[14]的研究发现轮胎橡胶中的一种抗氧化剂是导致美国太平洋西北部银鲑鱼在小溪中繁殖时急性死亡的主要原因。但已有研究发现多种水生生物可以摄入轮胎磨损颗粒[2,12]，且Halle等[13]的研究发现暴露在高浓度的2种不同化学组成的轮胎磨损颗粒中，对端足类的毒性一致，这说明其对端足类生物的毒性是由颗粒的物理性质决定的，轮胎磨损颗粒是通过改变生物的摄食行为及营养摄入对端足类产生毒性影响。本研究中，低浓度的轮胎微塑料(0.5 mg L-1)不会引起大型溞体内重金属Co、Cu和Zn等毒性物质含量的变化，这表明在低浓度暴露水平下，轮胎微塑料对大型溞的毒性不是由其释放的毒性物质所主导的，而主要是通过颗粒对大型溞附肢的干扰以及对肠道的刺激等物理因素所引发的。在高浓度暴露水平下，大型溞体内重金属Co、Cu和Zn等毒性物质的含量明显增加，且在所研究的微塑料粒径范围内呈现出金属累积量随颗粒粒径的减小而上升的趋势，而大型溞的死亡率同样随颗粒粒径的减小而增大。这说明在高浓度暴露水平下，轮胎微塑料对大型溞的毒性是由其释放的毒性物质所主导的。因此，大型溞是通过摄入轮胎微塑料，颗粒本身及其释放的有害物质对其产生毒性影响[15]，但在环境相关浓度水平下，毒性是由颗粒本身的作用主导的。考虑到轮胎磨损颗粒的成分较为复杂，重金属只是其中的部分组分[14]，将来研究有必要关注其他组分可能产生的毒性效应。
综上所述，本文探究了轮胎微塑料对大型溞的慢性毒性效应和毒性机理。结果表明，在地表水中，轮胎微塑料的预测浓度为0.09～10 mg·L-1时，其对大型溞的慢性毒性影响很小，且其对大型溞的慢性毒性是由颗粒本身的物理性质所引起的。少量轮胎微塑料颗粒的摄入对大型溞肠道产生了刺激，但并未改变其体内重金属和营养金属的含量以及蛋白质/脂肪。然而，对于某些道路冲刷雨水的直接受纳水体，其轮胎微塑料浓度可能高达几十mg·L-1[3]，这就可能抑制水生生物(如大型溞)的生长发育，并降低水生生物的存活率，从而威胁水生生态系统的健康。
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