邻苯二甲酸酯类(phthalate esters, PAEs)能够增加塑料制品的可塑性[1]，其在工业生产过程中常作为增塑剂被应用于医疗器械、洗涤护理产品、清洁剂、化妆品和食品包装等各个领域[2]，与人们日常生活息息相关。相关产品在生产、使用和处置过程中，可不断释放PAEs到环境中[3]，污染土壤[4]、水体[5]和大气[6]。环境中的PAEs能够通过皮肤接触、呼吸和进食等多种途径进入人体[7-8]，危害机体健康。血液是人体极其重要的组织，具有携氧、免疫、物质运输、调节体温及信息传递等多种功能。进入人体的部分PAEs会被血液吸收，并在内源性酯酶的作用下被水解代谢为相应的邻苯二甲酸单酯(mPAEs)[9]。此外，环境中的mPAEs也能以各种方式进入生物体血液[10-12]。研究人员已经在男性血液、母血和脐带血中检测到了mPAEs的存在[13-14]。存在于血液中的PAEs及其代谢产物随血液循环被输送到全身各处，损害体内的组织和器官，引发疾病。
目前，关于PAEs及其代谢产物毒性的研究主要集中在生殖发育、神经和遗传等方面[15-21]，涉及血液毒性及其作用机制的研究鲜有报道，且研究对象主要针对分子量较大、毒性较强的邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)及其代谢产物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)、邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)。张弘等[22]的研究表明，DEHP(500 mg·kg-1)亚慢性染毒90 d会使大鼠白细胞、红细胞数量及血红蛋白含量显著下降。另有研究表明，MEHP也与血液中血红蛋白含量的下降有关[23-24]。Sicińska[25]通过体外实验发现，DBP、BBP(25 μg·mL-1)及其代谢产物MBP、MBzP(250 μg·mL-1)会使红细胞出现溶血现象。此外，DBP、BBP、MBP和MBzP还会增加离体红细胞中活性氧(ROS)含量，改变其抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT))活性，使胞内高铁血红蛋白(MetHb)含量升高[26]。
邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate, DMP)作为一种分子量较低的PAEs已经被列入我国优先污染物黑名单[27]，其一级代谢产物邻苯二甲酸单甲酯(monomethyl phthalate, MMP)具有急性毒性、致畸和致癌活性[28-29]。目前，DMP和MMP在人体的各种体液中均已被检测到[30-32]。Babu-Rajendran等[33]采用气相色谱-质谱联用法测定了人体尿液中的PAEs，发现尿液中DMP的浓度范围为nd～141 ng·mL-1。陈甘讷等[34]的研究表明，MMP在孕妇分娩后母血和脐血中的浓度分别为1.89～2.07 μg·L-1和2.41～2.67 μg·L-1。针对研究现状的不足，本实验选取MMP(DMP的代谢产物)为研究对象，以Sprague Dawley(SD)大鼠为受试动物，通过检测血细胞(红细胞、白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞)数量、血液生化指标(总胆固醇、尿素氮、总蛋白和碱性磷酸酶)以及氧化应激水平(抗氧化酶SOD、CAT和丙二醛(MDA))以探究MMP(50、250和500 mg·kg-1)对大鼠血液的毒性影响及作用机制，有助于完善PAEs类代谢物对血液毒性效应的研究，为其风险评价和相关疾病预防提供科学依据。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 主要仪器设备与试剂耗材
主要仪器设备：动物版血液分析仪(HF-3800，济南汉方医疗器械有限公司，中国)、紫外-可见分光光度计(岛津UV-1700，Shimadzu，日本)、离心沉淀机(80-2，上海荣泰生化有限公司，中国)、数显恒温水浴锅(HH-S，常州翔天实验仪器厂，中国)、旋涡混合器(XH-C，金坛市白塔新宝仪器厂，中国)、电热鼓风干燥箱(101-00A，上海路韵仪器设备有限公司，中国)。
主要试剂耗材：邻苯二甲酸单甲酯(MMP；分析纯，国药集团化学试剂有限公司，中国)、乙酸(冰醋酸；分析纯，国药集团化学试剂有限公司，中国)、肝素钠(heparin sodium salt；185 USP units·mg-1，上海麦克林生化科技有限公司，中国)、长寿花金胚玉米油(山东三星玉米产业科技有限公司，中国)；总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)测试盒、过氧化氢酶(catalase, CAT)测试盒、丙二醛(malonicdialdehyde, MDA)测试盒、总胆固醇(total cholesterol, T-CHO)测试盒、尿素氮(BUN)测试盒、总蛋白(total protein, TP)定量试剂盒、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)。
1.2 实验动物
本研究选用的SD大鼠购自正规畜牧中心，所有大鼠均健康。在实验过程中，大鼠被饲养在实验室动物房中，温度控制在18～25 ℃，相对湿度控制在(55±5)%，接受正常光照，可自由获取标准动物饲料和经过滤的自来水。按照本地法规进行动物实验。
1.3 实验方法
1.3.1 SD大鼠染毒及采血
设置3个不同剂量的染毒组(低剂量50 mg·kg-1、中剂量250 mg·kg-1、高剂量500 mg·kg-1)和对照组，每组选用3只SD大鼠，按照体质量计算出每只大鼠灌胃所需MMP质量，用玉米油配成1.5 mL染毒液，对大鼠灌胃染毒。对照组灌胃等量的1.5 mL玉米油。
染毒结束后，用固定器将SD大鼠固定，在鼠尾中下部涂抹75%酒精消毒，用5.5号静脉输液针扎入静脉采集所需血液。
1.3.2 血细胞检测
将SD大鼠灌胃染毒3 h后，从尾部采集血液至EDTA-K2抗凝管中，使用HF-3800动物版血液分析仪的全血模式检测血液中红细胞、白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的数量，记录检测结果。
1.3.3 血液生化指标检测
对SD大鼠灌胃染毒24 h(禁食12 h)和连续染毒7 d(每天同一时间灌胃染毒)后，从大鼠尾部取全血于离心管中，以3 000 r·min-1将血样离心15 min，取上层血清用于检测血液中总胆固醇、总蛋白的含量及酸性磷酸酶的活性。从大鼠尾部采取染毒24 h和连续染毒7 d后的全血于肝素抗凝离心管中，在3 000 r·min-1条件下离心15 min，取上层血浆用于检测血液中的尿素氮含量。根据总胆固醇、尿素氮、总蛋白和酸性磷酸酶试剂盒说明书上的操作步骤，使用紫外-可见分光光度计检测。
1.3.4 血液氧化应激水平检测
对SD大鼠灌胃染毒3 h后，从尾部取全血于离心管中。将血样以3 000 r·min-1离心15 min，取上层血清用于检测血液中SOD、CAT活性和MDA含量。根据SOD、CAT和MDA试剂盒说明书上的操作步骤，使用紫外-可见分光光度计检测。
1.4 数据分析
用Origin 2018和SPSS 25.0软件计算平均值和标准差，对各组红细胞、白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等血细胞数量，总胆固醇、尿素氮、总蛋白的含量和酸性磷酸酶活性等血液生化指标，以及SOD、CAT的活性和MDA含量等氧化应激指标之间的差异性进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐性采用LSD检验，并绘制柱状图。
2 结果(Results)
2.1 MMP对SD大鼠血液中血细胞数量的影响
染毒3 h后，MMP对大鼠血液中红细胞、白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的毒性影响如表1所示。统计分析表明，随着MMP剂量的增加，SD大鼠血液中红细胞、白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量总体上均呈现下降趋势。低、中、高剂量染毒组红细胞数量与对照组相比分别下降1.11%、4.7%和9.13%，但均无显著差异(P>0.05)。淋巴细胞和中性粒细胞数量呈现低剂量兴奋效应[35]，高剂量组白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量与对照组相比分别下降43.57%、30.7%和26.44%，均有显著性差异(P<0.05)。这表明，MMP会导致大鼠血液中的血细胞数量出现不同程度的降低。
表1 不同剂量邻苯二甲酸单甲酯(MMP)染毒3 h后对SD大鼠血液中血细胞数量的影响
Table 1 The number of blood cells of SD rats after monomethyl phthalate (MMP) exposure for 3 h
血细胞种类Types of blood cellsMMP剂量/(mg·kg-1)MMP dose/(mg·kg-1)050250500RBC/(1012个·L-1)10.84±0.8310.72±1.27(↓1.08%)10.33±0.76(↓4.67%)9.85±0.94(↓9.13%)WBC/(109个·L-1)16.87±1.1216.62±1.33(↓1.46%)11.23±1.79*(↓33.4%)*9.52±0.24*(↓43.56%)*LYM/(109个·L-1)10.34±0.9811.25±0.26(↑8.83%)9.72±0.88(↓6.03%)7.17±0.32*(↓30.66%)*GRA/(109个·L-1)3.48±0.383.76±0.53(↑7.95%)2.99±0.34(↓13.98%)2.56±0.30*(↓26.34%)*
注：RBC表示红细胞，WBC表示白细胞，LYM表示淋巴细胞，GRA表示中性粒细胞；↑或↓表示与对照组相比上升或下降的百分比；*表示染毒组与对照组有显著性差异(P<0.05)。
Note: RBC stands for red blood cell, WBC stands for white blood cell, LYM stands for lymphocyte, and GRA stands for granulocyte; ↑ or ↓ indicates the percentage increase or decrease compared with the control group; *indicates significant difference from the control (P<0.05).
2.2 MMP对SD大鼠血液生化指标的影响
染毒24 h和连续染毒7 d后，MMP对大鼠血液总胆固醇、尿素氮、总蛋白含量和酸性磷酸酶活性的影响如图1所示。
图1 不同染毒时间下MMP对SD大鼠血液生化指标的影响
注：T-CHO表示总胆固醇，BUN表示尿素氮，TP表示总蛋白，ACP表示酸性磷酸酶；*表示染毒组与对照组有显著性差异(P<0.05)。
Fig. 1 Blood biochemical indexes of SD rats after MMP exposure for different time
Note: T-CHO stands for total cholesterol, BUN stands for blood urea nitrogen, TP stands for total protein, and ACP stands for acid phosphatase;
* indicates significant difference from the control (P<0.05).
随着MMP剂量增大，大鼠血液中总胆固醇含量均呈现出下降趋势，且连续染毒7 d后下降得更快(图1(a))。染毒24 h后，低、中、高剂量组总胆固醇含量分别下降17.47%、31%和36.67%，与对照组相比均差异显著(P<0.05)。连续染毒7 d后，与对照组相比，低、中、高剂量组总胆固醇含量分别下降22.97%、37.4%和43.97%，均有显著差异(P<0.05)。连续染毒7 d后，各剂量组总胆固醇含量均比染毒24 h后低，且500 mg·kg-1剂量下总胆固醇含量为最低。这表明，摄入MMP的时间越久、剂量越大总胆固醇含量降低越快，对血液损害越大。
MMP均会导致血液中尿素氮含量减少，且总体呈现下降趋势(图1(b))。其中，染毒24 h后，低、中、高剂量组尿素氮含量和对照组相比差异均显著(P<0.05)，分别下降15.97%、26.43%和34.33%。连续染毒7 d后，尿素氮含量呈现低剂量兴奋效应，中、高剂量MMP使尿素氮含量较对照组分别下降22.13%和28%，差异显著(P<0.05)。这表明，短时间摄入不同剂量MMP均会使大鼠血液尿素氮含量减少；而长时间摄入低剂量MMP时，大鼠血液尿素氮含量会升高；MMP剂量增大后，血液中尿素氮含量会减少。
血液中总蛋白含量均随着MMP剂量增加而减少，呈下降趋势，但连续染毒7 d后下降趋势较慢(图1(c))。其中，高剂量MMP染毒24 h和连续染毒7 d后，总蛋白含量分别减少18.25%和26.35%，与对照组相比差异显著(P<0.05)；连续染毒7 d后高剂量组的总蛋白含量最低。这表明，长时间高剂量摄入MMP会使大鼠血液总蛋白含量大幅降低。
MMP能使大鼠血液中酸性磷酸酶活性下降(图1(d))。其中，染毒24 h后，血液中酸性磷酸酶活性随着MMP染毒剂量的增加而下降，低、中、高剂量组较对照组分别显著下降10.63%、19.93%和41.37%(P<0.05)。连续染毒7 d后，低剂量组酸性磷酸酶活性与对照组相比显著上升27.4%(P<0.05)，呈现低剂量兴奋效应；中、高剂量MMP分别使酸性磷酸酶活性显著下降21.87%和31.43%(P<0.05)。这表明，无论短时间还是长时间，摄入MMP剂量越大，大鼠血液中酸性磷酸酶活性越低。
2.3 MMP染毒后SD大鼠血液氧化应激水平
不同剂量MMP染毒3 h后，大鼠血液中SOD、CAT相对活性及MDA相对含量如图2所示。
随着MMP剂量增加，SOD活性呈下降趋势(图2(a))。与对照组相比，低、中、高剂量MMP使SOD活性分别下降3.6%、11.7%和17.5%(P>0.05)。这表明，MMP能够抑制SOD活性，但影响较小。
各剂量MMP对大鼠染毒3 h后，血液中CAT活性均低于对照组，且随着MMP剂量的增加呈现下降趋势(图2(b))。低、中、高剂量染毒组CAT活性与对照组相比分别下降19.57%、24.13%和57.68%(P<0.05)。这表明，MMP会使CAT活性下降，损害血液的抗氧化防御体系。
图2 不同剂量MMP染毒3 h后大鼠血液氧化应激水平
注：SOD表示超氧化物歧化酶，CAT表示过氧化氢酶，MDA表示丙二醛；*表示染毒组与对照组有显著性差异(P<0.05)。
Fig. 2 Oxidative stress level in the blood of SD rats after MMP exposure for 3 h
Note: SOD stands for superoxide dismutase, CAT stands for catalase, and MDA stands for malonic dialdehyde;
*indicates significant difference from the control (P<0.05).
不同剂量染毒组MDA含量均高于对照组，且均有显著差异(P<0.05) (图2(c))。与对照组相比，低、中、高剂量组MDA含量分别升高70.43%、59%和34.8%。这表明，MMP进入机体后能够诱导血液发生氧化应激反应，引起血液MDA含量升高。
3 讨论(Discussion)
3.1 MMP对SD大鼠血液功能的影响
血液是机体重要的组织，由血细胞和血浆组成，具有携氧、免疫等功能。血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。大量研究证实，红细胞的主要功能是运输氧气和二氧化碳[36-37]，同时还具有免疫功能，参与免疫应答调节[38-39]。白细胞是血液中执行免疫功能最主要的细胞[40]，其能够通过吞噬细菌等途径来抵御和杀死入侵的病原体[41]，对机体防御系统的建立有重要意义。淋巴细胞和中性粒细胞均属于白细胞，分别在机体特异性和非特异性免疫功能方面发挥重要作用[41-43]。
已有研究表明，PAEs会造成血细胞数目下降，影响机体的免疫功能[44]，但对其代谢物的影响仍不明确。本研究结果显示，MMP(DMP的代谢产物)会对血液中红细胞、白细胞、淋巴细胞及中性粒细胞造成不同程度的损伤，使其数目下降；且随着MMP剂量的增大，细胞数目下降愈发明显(表1)。这表明，作为PAEs类代谢物MMP也会使血液中的血细胞数量减少，进而造成血液的携氧和免疫等功能下降。
临床上，红细胞、白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞也常作为诊断病理变化的重要依据。红细胞数量下降意味着机体可能出现贫血、白血病等疾病；白细胞数目减少代表机体的造血功能出现障碍；淋巴细胞数目偏低会导致机体免疫缺陷；中性粒细胞数量减少表明机体受到化学损伤，出现骨髓造血异常等疾病。由此推测，MMP会影响血液的携氧和免疫等功能，进而可能会引发机体出现贫血、免疫缺陷及骨髓造血功能障碍等疾病。
3.2 MMP对SD大鼠血脂代谢、肾、肝功能的影响
总胆固醇是反映机体内脂肪代谢水平的一项重要指标[45]，其含量过多过少都会对机体产生危害。Zhu等[46]研究发现PAEs类代谢物会使胆固醇含量下降。本研究也得到了相似的结果，无论短时间还是长时间摄入MMP，机体血液总胆固醇含量均呈现下降趋势(图1(a))。这表明，MMP会影响血液中脂质的新陈代谢水平。
尿素氮是蛋白质代谢的终末产物，其常作为机体肾功能评价的重要指标[47]。在正常情况下，尿素氮会被肾小球滤过排出体外，若其含量偏低则代表着肾功能失调，含量偏高则意味着过滤功能可能失效，造成器质性肾功能损害。本研究中，机体摄入MMP后，血液中尿素氮含量下降(图1(b))。这表明，MMP会影响机体肾功能，导致其功能失调。
总蛋白含量能够反映肝脏的合成功能以及储备能力[48]。酸性磷酸酶也是描述机体肝功能的一个重要指标[49]。本研究发现，MMP会使血液中总蛋白含量以及酸性磷酸酶活性下降(图1(c)、图1(d))。总蛋白含量下降可能是因为机体摄入MMP后使肝细胞受损，肝脏合成功能出现障碍，最终导致其合成蛋白质减少。由于PAEs类代谢物具有亲脂性容易渗入膜脂质[50]，因此推测酸性磷酸酶活性下降可能是因为MMP与溶酶体膜相互作用，抑制了酸性磷酸酶的释放，也可能因为MMP妨碍了溶酶体和质膜的融合，阻止酸性磷酸酶分泌到胞外而导致其活性下降[51]。总蛋白含量和酸性磷酸酶活性下降均反映出MMP对肝功能有一定影响。由于肝脏是胆固醇和尿素氮合成的主要场所，因此推测两者含量的下降也可能是肝功能受损造成的[52-53]。
综上所述，机体摄入MMP后，会导致血脂代谢能力以及肾、肝功能受损。临床上，总胆固醇含量偏低意味着机体可能出现肝硬化、贫血等疾病。尿素氮含量减少表明机体肾功能出现障碍且可能有严重的肝脏疾病。总蛋白含量偏低代表机体可能患有肾炎、肝炎和肝硬化等疾病。酸性磷酸酶活性下降代表机体可能患有贫血、肾炎等疾病。本研究中，4个指标相互印证，且与3.1推测相吻合，因此MMP可能会诱导机体出现贫血、肾炎、肾功能障碍、肝炎和肝硬化等疾病。
3.3 MMP对SD大鼠血液抗氧化能力的影响
氧化应激(oxidative stress, OS)是指机体氧化与抗氧化平衡被破坏，生成过多的氧自由基而无法被清除，从而对机体产生的一种负面作用[54]。由于氧自由基可以直接或间接氧化DNA、脂质和蛋白质，诱发基因突变、脂质过氧化以及蛋白质变性，因此氧化应激通常被认为是污染物对机体产生毒性的作用机制之一[55]。已有研究表明，苯、四氯化碳及重金属铅、镧、钛等污染物能够通过氧化应激引起机体造血、肾、肝功能受损，进而诱发贫血、造血功能障碍、肾炎、肾功能失调以及肝炎、肝硬化等疾病[56-60]。因此，笔者从氧化应激的角度探究MMP对大鼠血液、肾、肝损伤的可能作用机制。
SOD和CAT作为机体抗氧化酶系极其重要的组成部分，其存在可以减轻氧化应激产生的损伤[61]。其中，SOD能够催化超氧阴离子进行歧化反应[62]，清除有害的超氧化物自由基；CAT能够催化过氧化氢将其迅速转化为无害或毒性较小的物质[63]，防止过氧化氢过多积累对机体造成损伤。本研究发现，机体摄入MMP后会使血液中SOD和CAT活性下降，且随着MMP剂量的增加，SOD和CAT活性呈现出下降趋势(图2(a)、图2(b))。这表明，MMP能够抑制血液中抗氧化酶SOD和CAT的活性，进而损害血液的抗氧化系统。
MDA作为脂质过氧化物的产物，其含量的多少可以反映出机体氧化损伤的程度[64]。本研究发现，各剂量MMP染毒组的MDA含量均高于对照组(图2(c))。这表明，机体摄入MMP后导致血液抗氧化防御体系受损，清除自由基的能力下降，引起氧化应激反应，对血液造成损伤。Holland等[65]研究发现妇女妊娠期尿液中的某些PAEs类代谢物会引起8-异丙醇烷(脂质过氧化的生物标志物)水平升高，使机体发生抗氧化损伤及氧化应激反应。本研究结果与之相符。
综上所述，MMP作为PAEs类代谢物的一种，会使血液的抗氧化能力下降，诱发氧化应激反应，从而对血液中血细胞以及血液生化指标产生影响，损害血液的携氧、免疫等功能；血脂的代谢能力以及机体的肾、肝功能，推测MMP进而可能引发机体发生贫血、造血功能障碍、肾功能失调以及肝硬化等相关疾病。本研究有助于明确邻苯二甲酸酯类代谢物对血液的毒性效应，并为其潜在的风险评估和相关疾病的预防提供一定的理论指导。
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