氯虫苯甲酰胺对环境生物的急性毒性与安全性评价

农药作为减少病虫草害、调节植物生长的重要生产资料在农业生产中发挥着不可或缺的作用，但同时也带来了突出的生态环境问题[1]。因此，在农药产品研发、注册登记与风险评估中，应以新的农药管理政策为导向，追求新化合物高活性的同时也要确保人体健康和环境安全，促进环境友好型绿色农药产品的创制与推广，加速推动农药产业升级。

双酰胺类杀虫剂是继新烟碱类杀虫剂之后又一重大突破，该类药剂通过激活昆虫鱼尼丁(ryanodine receptor, RyR)受体，导致昆虫过度释放平滑肌和横纹肌细胞内钙库中的钙离子，引起肌肉调节功能衰弱，致使昆虫瘫痪死亡[2-4]。由于靶标昆虫与其他生物间鱼尼丁受体存在差异，这为双酰胺类杀虫剂在农业害虫防治上提供了优异的选择性。近年来，氟苯虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺、环溴虫酰胺、氟氰虫酰胺和溴虫氟苯双酰胺等产品陆续上市[5]。

氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)是美国杜邦公司开发的一种邻氨基苯甲酰胺类杀虫剂，作为解决传统农药抗性问题的良好替代品，具有高效、低毒和选择性高等特点[6]。近几年，氯虫苯甲酰胺在我国防治入侵害虫美国白蛾、草地贪夜蛾及传统农业害虫上得到广泛推广和应用。随着氯虫苯甲酰胺的大量使用，其抗性问题[7-8]和对环境生物的潜在风险[9-11]也逐渐显露。氯虫苯甲酰胺对鳞翅目家蚕的毒性毋庸置疑，亚致死剂量的氯虫苯甲酰胺会影响家蚕变态发育[10]。Naiara Gomes等[11]研究发现农田中使用推荐浓度的氯虫苯甲酰胺会对蜜蜂的飞行能力产生负面影响。在对水生环境生物上，研究表明氟苯虫酰胺会在环境中分解成对一些水生无脊椎动物产生严重危害的持久性物质，2018年我国禁止其在水稻作物上使用，与氟苯虫酰胺相比，目前仍在水稻上有登记的氯虫苯甲酰胺对水生无脊椎动物的毒性同为剧毒，其土壤吸附性更差，对鱼类慢性毒性较高且降解较慢[6]。目前关于氯虫苯甲酰胺对环境生物的潜在风险还没有系统定论，为综合评价氯虫苯甲酰胺对环境非靶标生物的安全性，根据我国现行农药登记环境毒理试验要求，本研究参考《化学农药环境安全评价试验准则》(GB/T 31270—2014)[12-16]和《化学农药天敌(瓢虫)急性接触毒性试验准则》(NY/T 3088—2017)[17]，开展了氯虫苯甲酰胺对鹌鹑、家蚕、蜜蜂、蚯蚓、瓢虫和斑马鱼6种环境生物的急性毒理研究及安全性评价，旨在为全面评估该类杀虫剂的环境风险提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

日本鹌鹑(Coturnix japonica)，嘉祥县鸿新鹌鹑养殖有限公司；家蚕(Bombyx mori L.)，品种为“菁松×皓月”，山东广通蚕种有限公司；赤子爱胜蚯蚓(Eisenia fetida)，济南市宏源蚯蚓养殖基地；意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)，济南伟宏生态蜜蜂园有限公司；七星瓢虫(Coccinella septempunctata)，山东省农药科学研究院测试中心；斑马鱼(Brachydanio rerio)，山东鱼之道生物技术有限公司。

70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂(推荐使用剂量：21～31.5 g a.i.·hm-2)，山东邹平农药有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 鸟毒性试验

鸟毒性试验采用灌药法[12]。试验鹌鹑同批孵化，选择(30±5)日龄，体质量90～100 g，健康、无病、活泼的鹌鹑用于试验，试验前16 h停止喂食，试验温度(25±2) ℃，相对湿度50%～70%，14 h (光照)∶10 h (黑暗)，室内排气扇通风。根据预试验结果，试验设计2 000 mg a.i.·kg-1 (以单位体质量计)限度试验剂量，采用经口给药，一次性灌胃染毒，给药量为1 mL·(100 g)-1(以单位体质量计)，以纯水处理作为对照，每处理10只鹌鹑(雌雄各半)，无需重复，给药后常规饲养。观察并记录受试鹌鹑1～7 d中毒症状及死亡数，求LD50。依据农药对鸟类的急性毒性登记划分标准(剧毒：LD50≤10 mg a.i.·kg-1 (以单位体质量计)；高毒：10 mg a.i.·kg-150≤50 mg a.i.·kg-1 (以单位体质量计)；中毒：50 mg a.i.·kg-150≤500 mg a.i.·kg-1 (以单位体质量计)；低毒：LD50>500 mg a.i.·kg-1 (以单位体质量计)，判定毒性等级。

1.2.2 家蚕毒性试验

家蚕毒性试验采用浸叶法[13]。家蚕饲养在人工气候箱中，试验温度(25±2) ℃，相对湿度为70%～80%，14 h (光照)∶10 h (黑暗)，试验用蚕选择个体大小一致健康的2龄起蚕。试验设计0.0296、0.0444、0.0667、0.100和0.150 mg a.i.·L-1共5个试验剂量，将药剂用纯水稀释至相应试验浓度，在不同质量浓度药液浸渍桑叶10 s，悬挂晾干后置于15 mL培养皿中，每个重复接入20头2龄起蚕，置于培养箱中饲养，每处理3次重复，以纯水处理作为对照。观察并记录处理后家蚕1～4 d中毒症状及死亡数，求LC50。依据农药对家蚕的急性毒性等级划分标准(剧毒：LC50≤0.5 mg a.i.·L-1；高毒：0.5 mg a.i.·L-150≤20 mg a.i.·L-1；中毒：20 mg a.i.·L-150≤200 mg a.i.·L-1；低毒：LC50>200 mg a.i.·L-1)，判定毒性等级。

1.2.3 蚯蚓毒性试验

蚯蚓毒性试验采用人工土壤混药法[14]。蚯蚓室内饲养2月龄以上，选择已出现生殖带，体长5～6 cm，体质量300～600 mg的个体用于试验，试验蚯蚓饲养在人工气候箱中，温度为(20±2) ℃，相对湿度70%～90%，光强400～800 lx连续光照。人工土壤由10%泥炭藓、20%高岭土、68%石英砂和2%碳酸钙配制而成。根据预试验结果，试验设计100 mg a.i.·kg-1 (以单位土壤干质量计)限度试验剂量，将供试药剂溶解在定量纯水中，将药液加入人工土壤，混匀，调节土壤水分，将试验土壤装到1 L烧杯中，每个烧杯放入10条蚯蚓，每处理设3个重复，同时设空白对照组。观察并记录蚯蚓处理后第7天、第14天的中毒症状和死亡数，求LC50。依据农药对蚯蚓的急性毒性等级划分标准(剧毒：LC50≤0.1 mg a.i.·kg-1 (以单位土壤干质量计)；高毒：0.1 mg a.i.·kg-150≤1.0 mg a.i.·kg-1 (以单位土壤干质量计)；中毒：1.0 mg a.i.·kg-150≤10 mg a.i.·kg-1 (以单位土壤干质量计)；低毒：LC50>10 mg a.i.·kg-1 (以单位土壤干质量计)，判定毒性等级。

1.2.4 蜜蜂毒性试验

蜜蜂于室外自然条件下人工控制饲养，蜜蜂于试验前1 d收集，饲喂50%蔗糖水溶液，试验温度(25±2) ℃，相对湿度50%～70%，黑暗条件下使蜜蜂保持24 h适应期，适应期后观察蜜蜂个体的活力，剔除死亡或表现异常的个体。蜜蜂急性经口毒性试验采用摄入法[15]。试验设计37.5、75.0、150、300和600 μg a.i.·蜂-1共5个试验剂量，将供试药剂用纯水配制成相应浓度，然后将上述药液分别与50%蔗糖水以1∶1混匀。试验前蜜蜂饥饿处理2 h，按10 μL·蜂-1药液量加入饲喂器中供蜜蜂取食，以不含被试物的蔗糖水作为对照，每重复10只蜜蜂，每处理3次重复。观察并记录蜜蜂处理后1 d和2 d中毒症状及死亡数，求LD50。依据农药对蜜蜂急性经口毒性等级划分标准(剧毒：LD50≤0.001 μg a.i.·蜂-1；高毒：0.001 μg a.i.·蜂-150≤2.00 μg a.i.·蜂-1；中毒：2.0 μg a.i.·蜂-150≤11.0 μg a.i.·蜂-1；低毒：LD50>11 μg a.i.·蜂-1，判定毒性等级。

蜜蜂急性接触毒性试验采用点滴法[15]。试验设计29.6、44.4、66.7、100和150 μg a.i.·蜂-1共5个试验剂量，将供试药剂用丙酮配制成相应浓度，将度过适应期的蜜蜂进行氮气麻醉，然后用手持式微量点滴器将药液点滴在蜜蜂的中胸背板处，点滴量为1.0 μL·只-1，待蜜蜂完全恢复前装入蜂盒内，饲喂50%蔗糖水，同时设置丙酮溶剂对照和空白对照，每重复10只蜜蜂，每处理3次重复。观察并记录蜜蜂处理后1 d和2 d中毒症状及死亡数，求LD50。农药对蜜蜂急性接触毒性等级划分标准同农药对蜜蜂急性经口毒性等级划分标准。

1.2.5 瓢虫毒性试验

瓢虫毒性试验采用药膜法[17]。供试瓢虫饲养于温度(25±2) ℃、16 h (光照)∶8 h (黑暗)，湿度60%～90%的恒温光照气候箱中。试验设计17.8、26.7、40.0、60.0和90.0 g a.i.·hm-2共5个试验剂量，将药剂用纯水稀释至相应试验浓度，取0.5 mL药液加入指形管中(内表面积为38.5 cm2)，于滚膜机上滚动至晾干，制成均匀药膜管，然后选取大小一致的瓢虫2龄幼虫接入药膜管中，每管1头，每天饲喂足量的豆蚜，直至羽化。以纯水处理作为对照，每个重复10头，每个处理重复3次。每天观察并记录瓢虫的中毒症状及死亡数，求LR50并计算安全系数。依据农药对瓢虫的急性接触毒性等级划分标准(极高风险性：安全系数≤0.05；高风险性：0.05<安全系数≤0.5；中等风险性：0.5<安全系数≤5；低毒：安全系数>5)，判定风险等级。

1.2.6 斑马鱼毒性试验

斑马鱼毒性试验采用半静态法进行试验[16]，试验期间每隔24 h更换一次试验药液。斑马鱼在试验室条件下驯养7～14 d，每天光照12～16 h，水温21～25 ℃，试验前24 h停止喂食，试验期间亦不喂食，选择体长(2±1) cm健康活泼的斑马鱼用于试验。试验设计92.0、106、122、140和161 mg a.i.·L-1共5个试验剂量，用曝气水溶解稀释，将上述药液分别过0.45 μm滤膜，取2 L上述药液转移至5 L烧杯中用于试验，以曝气水为空白对照，每个处理10尾斑马鱼，无需重复。观察并记录受试斑马鱼24、48、72和96 h的中毒症状及死亡数，用玻璃棒轻触斑马鱼尾部，无可见运动即为死亡，及时清除死亡斑马鱼。于试验前0 h和试验后1～4 d从试验药液中取样，检测试验药液中有效成分的浓度，根据实测浓度求LC50。根据农药对鱼类的急性毒性等级划分标准(LC50≤0.1 mg a.i.·L-1为剧毒，0.1 mg a.i.·L-150≤1.0 mg a.i.·L-1为高毒，1.0 mg a.i.·L-150≤10 mg a.i.·L-1为中毒，LC50>10 mg a.i.·L-1为低毒)，判定毒性等级。

氯虫苯甲酰胺检测采用Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器。检测条件：紫外检测器的检测波长为245 nm；流动相为0.05%磷酸水∶甲醇(30∶70, V∶V)，流速为1 mL·min-1；进样体积为10 μL；柱温为30 ℃，色谱柱为Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm)。

准确称量氯虫苯甲酰胺标准品，配成系列标准溶液，试验浓度在标准溶液浓度范围内，进行浓度测定，并绘制标准曲线。在标准系列浓度范围内，浓度与峰面积有良好的线性关系。回收率试验表明，氯虫苯甲酰胺的回收率均>90%。

1.3 数据来源与处理

死亡率=死亡虫数/接虫总数×100%；校正死亡率=(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)×100%；安全系数=药物对被试生物的LR50/该药物的田间推荐施用浓度。采用SPSS Statistics 22.0对数据进行Tukey’s HSD检验。根据剂量对数值和校正死亡率进行分析(Probit analysis)。有效成分为氯虫苯甲酰胺的生态毒性数据来自欧洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)，如表1所示。

2 结果(Results)

2.1 鸟急性毒性

试验期间，对照组和处理组鹌鹑均无死亡，药剂处理组鹌鹑表现精神萎焉、羽毛蓬松等症状，24 h后恢复正常。70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对鹌鹑的毒性试验结果如表2所示，结果表明，该药剂对鹌鹑急性经口毒性7 d-LD50>2 000 mg a.i.·kg-1 (以单位体质量计)。依据农药对鸟类的急性毒性登记划分标准，该药剂对鹌鹑急性毒性经口毒性为“低毒”。

2.2 家蚕急性毒性

试验期间，对照组家蚕无死亡，观察药剂处理后家蚕在不同时间的中毒症状，高浓度处理组家蚕出现取食减少，中毒症状表现为头部摇摆、吐水等症状，死亡家蚕头部肿大，身体扭曲变软，呈“U”形。70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对家蚕的毒性试验结果如表3所示，结果表明，该药剂对家蚕的急性毒性4 d-LC50为0.0588 mg a.i.·L-1。依据农药对家蚕的急性毒性等级划分标准，该药剂对家蚕急性毒性为“剧毒”。

2.3 蚯蚓急性毒性

试验期间，对照组和处理组蚯蚓均无死亡，蚯蚓体表光滑，活动正常，处理组供试蚯蚓无明显中毒症状。70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对蚯蚓的毒性试验结果如表4所示，结果表明，该药剂对蚯蚓急性毒性14 d-LC50>100 mg a.i.·kg-1 (以单位土壤干质量计)，依据农药对蚯蚓的急性毒性等级划分标准，该药剂对蚯蚓急性毒性为“低毒”。

2.4 蜜蜂急性毒性

蜜蜂急性经口试验中处理组蜜蜂染毒6 h，高浓度处理组有少量药液沉淀剩余。试验期间，对照组无蜜蜂死亡，药后蜜蜂出现行走不稳，侧躺挣扎等症状，死亡蜜蜂出现双翅展开，身体蜷缩等现象，70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对蜜蜂的急性经口毒性试验结果如表5所示，结果表明，该药剂对蜜蜂的急性经口毒性2 d-LD50为133 μg a.i.·蜂-1。蜜蜂急性接触试验中对照组无蜜蜂死亡，处理组蜜蜂染毒后，出现活动迟缓，精神萎靡等症状，死亡蜜蜂出现双翅展开，蜷缩发黑等现象，70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对蜜蜂的急性接触毒性试验结果如表6所示，结果表明，该药剂对蜜蜂的急性接触毒性2 d-LD50为77.3 μg a.i.·蜂-1。依据农药对蜜蜂急性经口/接触毒性等级划分标准，该药剂对蜜蜂急性经口和接触毒性均为“低毒”。

2.5 七星瓢虫急性毒性

试验期间，对照组瓢虫死亡率为3.33%，处理组瓢虫表现不活跃或静止状态，死亡瓢虫挺直不动或蜷缩，虫体干瘪，体型缩小，各处理组存活瓢虫在药后第8天完成化蛹，第15天完成羽化。70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对七星瓢虫的急性接触毒性试验结果如表7所示，结果表明，该药剂对七星瓢虫急性接触毒性15 d-LR50为37.3 g a.i.·hm-2，该药剂在田间最大推荐使用剂量为31.5 g a.i.·hm-2，计算安全系数为1.18。依据农药对瓢虫的急性接触毒性等级划分标准，该药剂对瓢虫的风险性为“中等风险”。

2.6 斑马鱼急性毒性

试验期间，对照组无斑马鱼死亡，处理组斑马鱼染毒后，出现游动缓慢、侧翻等症状，70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对斑马鱼的急性毒性试验结果如表8所示，结果表明，以实测浓度计算该药剂对斑马鱼毒性4 d-LC50为10.2 mg a.i.·L-1，根据农药对鱼类的急性毒性等级划分标准，该药剂对斑马鱼的急性毒性为“低毒”。

70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对6种环境生物的急性数据分析结果具体如表9所示。

3 讨论(Discussion)

本研究通过测定70%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂对环境生物日本鹌鹑、家蚕、蚯蚓、蜜蜂、七星瓢虫和斑马鱼的急性毒性，评价其对环境生物安全性。结果显示，该制剂对环境生物鸟、蚯蚓、蜜蜂和斑马鱼的急性毒性等级均为低毒，对家蚕为剧毒，对天敌瓢虫属中风险。因此，在田间使用时，应避免在蚕室和桑园附近使用，延长药后桑叶采摘间隔期，同时为充分发挥天敌昆虫生物防治的控害潜能，应避免在天敌昆虫放飞区及繁育期使用。

评价农药对环境生物的安全性不仅要根据急性毒性终点值的大小，还要考虑其对环境生物是否具有潜在的慢性毒性。氯虫苯甲酰胺对鸟类急性和短期毒性风险较低，但对慢性毒性风险较高，急慢性比高达223[9]，推断氯虫苯甲酰胺可能对鸟类繁殖具有潜在风险。关于氯虫苯甲酰胺对蚯蚓急性毒性和慢性毒性均很低，但Liu等[18]研究发现蚯蚓暴露在含有氯虫苯甲酰胺的土壤中42 d(土壤中降解<20%)，蚯蚓体内氯虫苯甲酰胺含量随着暴露时间的延长而累积，当氯虫苯甲酰胺含量高于5.0 mg·kg-1时，会诱导细胞产生过量的氧化自由基，导致体内生物大分子氧化损伤，抑制蚯蚓的生长和繁殖。同样，Zhang等[19]和刘修园等[20]发现对蚯蚓低毒的溴氰虫酰胺和氟苯虫酰胺也能够诱发蚯蚓体内的氧化胁迫，导致细胞和DNA损伤，可见，酰胺类杀虫剂虽然对无脊椎动物短期内毒性较低，但会产生持久性危害。氯虫苯甲酰胺原药对蜜蜂经口毒性较低，但对蜜蜂接触毒性可能较高。Dinter等[21]通过半田间试验研究了蜜蜂取食花粉过程中喷洒氯虫苯甲酰胺对其影响，结果表明氯虫苯甲酰胺对蜜蜂影响较小，安全性高。氯虫苯甲酰胺原药对斑马鱼急性毒性为低毒，生物富集因子(BCF)为15，清除50%的时间(CT50)为1.5 d[9]，表明暴露于氯虫苯甲酰胺后对鱼类产生的潜在风险很低。宋玥颐[22]、Venkata和Rathnamma[23]等在慢性毒性研究中发现氯虫苯甲酰胺会导致斑马鱼肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性以及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量发生显著改变，肝脏中出现明显的氧化应激反应，出现了一定程度的肿胀和空泡[22]。关于氯虫苯甲酰胺原药对七星瓢虫和家蚕的毒性终点国外目前还没有相关报道。池艳艳等[24]研究发现亚致死剂量的氯虫苯甲酰胺会抑制家蚕生长，影响变态发育，导致蚕茧和茧丝的质量下降。考虑到氯虫苯甲酰胺防治对象以鳞翅目害虫为主，家蚕对氯虫苯甲酰胺十分敏感，在常规推荐用量下，不可避免地对蚕业生产造到极大威胁，因此，在蚕室及桑园附近避免使用该类农药。Nawaz等[25]研究发现氯虫苯甲酰胺对异色瓢虫2龄幼虫的LC50值为36.67 mg a.i.·L-1，亚致死剂量下能显著延长瓢虫发育历期，抑制蛹及成虫体质量、成虫寿命和繁殖力下降，本研究中氯虫苯甲酰胺对七星瓢虫2龄幼虫的LC50值为37.3 g a.i.·hm-2，接近于推荐剂量，表明氯虫苯甲酰胺对鞘翅目瓢虫具有一定的风险。

氯虫苯甲酰胺对昆虫与其他生物间具有优异的选择毒性，主要原因是昆虫与哺乳动物、鸟类、蜜蜂和鱼类等生物鱼尼丁受体(RyR)存在差异。对比昆虫RyR与哺乳动物的RyR发现同源性很低，而不同昆虫物种间RyR具有高同源性[26]。研究发现，双酰胺类杀虫剂对鳞翅目昆虫的敏感性与昆虫RyR的局部结构域(N-末端结构域、Repeat34结构域和SPRY2结构域)密切相关[27-29]。Kato等[27]通过置换兔RyR2和蚕RyR的N-末端序列，揭示了N-末端是RyR对氟苯虫酰胺敏感的结构基础。Xu和Yuchi[28]通过研究小菜蛾RyR的Repeat34结构域发现该结构域的磷酸化位置附近比哺乳动物多出一个α-螺旋结构，表明Repeat34很可能是RyR上的选择性靶标。Zhou等[29]解析小菜蛾RyR的SPRY2区域，发现该结构域与BSol结构域之间的界面对Ca2+通道的变构有重要作用，说明药剂可能通过SPRY2结构域控制Ca2+的释放。

综上所述，氯虫苯甲酰胺对环境生物具有较好的选择性，考虑到长期暴露或反复暴露对环境生物的影响，该类药剂对环境生物仍存在潜在风险，因此，关于氯虫苯甲酰胺对人及环境生物风险可结合农药在环境中的暴露程度进行全面风险评估及开展高级阶段毒性效应研究。

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