抗生素是某些微生物的代谢产物，对各类病原微生物的抑制作用十分突出[1]。因此，抗生素被广泛应用于医疗、畜牧和水产等行业中。我国作为全球第二大药物市场，抗生素的生产和使用量均位居全球首位[2]。然而，抗生素的大量使用甚至滥用，导致了环境中严重的抗生素污染问题[3-5]，如Gros等[6]在污水、河水甚至地下水等多种水体中检测出30多种抗生素，且阿奇霉素、甲氧苄啶和氧氟沙星等严重超标。然而，目前各种污水处理方法对于抗生素的去除效果微乎甚微[7]，导致水体中的抗生素积聚，且以各种不同的形式存在，形成复杂的混合物体系，而混合物的不同组分之间可能存在着毒性相互作用(协同与拮抗作用)，进而对环境或生物体造成更为严重的危害[8-9]。进入环境中的抗生素及其混合物很可能通过食物链进入生物体甚至人体，进而改变机体内菌群的结构和数量，致使人和动物体发生免疫失调，抵抗力下降，甚至导致机体感染某些超级细菌而致死，这不仅给水资源的循坏利用带来了难题[10]，也对人体健康造成了潜在的威胁[11]。

氨基糖苷类抗生素作为使用较早的抗生素之一[12]，由于其具有抗菌谱广、杀菌完全的优点而被广泛使用[13]，但过度地使用会对人体造成肾毒性等严重危害[14]。此外，氨基糖苷类抗生素在水中的溶解性较高，很难通过污水处理工业进行去除，这不仅会提高了其环境污染的风险，而且也大大增加了治理难度[15]。因此，开展氨基糖苷类抗生素污染物的研究具有重要的实际意义。

大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)是人与动物肠道的正常菌群的主要成员之一，一般不致病，而且能合成有益于机体的维生素B和K，某些菌株还能产生大肠杆菌素，具有抑制进入体内的有害菌的作用。然而，E. coli一旦进入机体内的其他部位，则可能致病[16]。近年来，因E. coli具有培养方式简单和繁殖速度快的优点，可以在短时间内获得所需的产物，且成本损耗低，具有一定的经济性[17-18]，被作为一种模式生物广泛用于科学研究。如宋雪薇等[19]将E. coli作为受试生物研究发现磺胺与四环素类抗生素联合具有拮抗作用，李莹和叶明[20]研究发现青霉素钠与硫酸链霉素组成的混合物对E. coli的抑制效果较组分单独作用强。这些研究结果对药物的使用具有指导意义。除了本身的科学价值外，E. coli作为模式生物评价生态风险时，无论污染物对其产生有害作用还是有益作用，对其他生物的风险评价甚至人类健康影响研究都有一定的参考意义。

本研究拟以硫酸阿布拉霉素(apramycin sulfate, APR)、双氢链霉素(dihydrostreptomycin sulfate, DIH)、新霉素硫酸盐(neomycin sulphate, NEO)为目标污染物，应用均匀射线法(uniform design ray, UD-Ray)[21]设计三元混合物体系(APR-DIH-NEO)，应用时间毒性微板分析法(time-dependent microplate toxicity analysis method, t-MTA)[22]系统地测定3种抗生素及其三元混合物体系的时间毒性；应用拟合归零法分析三元混合物体系中组分间的相互作用强度；通过电镜扫描对3种抗生素及其三元混合物体系作用前后的E. coli细胞形态变化进行观测，实验数据将为环境生态风险提供参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 菌种及培养

实验菌种为大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)，购自广东环凯微生物科技有限公司。实验用菌种先接种于事先制备好的平板，放入37 ℃培养箱中培养12 h后，再将菌种挑于LB液体培养基，置于培养箱(37 ℃、170 r·min-1)中培养12 h，之后再用2 MH肉汤培养基(Mueller-Hinton broth, MHB)对菌液进行稀释。本实验为了避免MHB培养基颜色对实验结果的影响，将实验菌液的初始光密度(optical density, OD600)设置为0.12～0.14，确保了初始菌液含量的一致性，并在对实验数据进行处理时，扣除了MHB培养基底色在OD600时的数值，确保了实验数据的可靠性，并同步测定了E. coli在0～12 h的生长曲线，如图1所示。

1.2 药品及仪器

3种抗生素：APR、DIH和NEO均购自上海原叶生物科技有限公司，标准品的纯度均>98%，其理化性质列于表1中。储备液均用Milli-Q水配制，并于4 ℃冰箱中保存、备用。本实验所用仪器见参考文献[23]。

1.3 时间毒性微板分析法

采用t-MAT法测定了3种氨基糖苷类抗生素对E. coli的时间-浓度-效应数据。选用透明的96孔微板为测试载体，首先在每块板的4周36孔中加入200 μL水以防止边缘效应，将第2、6、7和11列设为空白对照，每个孔中均加入100 μL超纯水。每个污染物均设12梯度浓度，分别加入100 μL到余下6列的36个孔中，且每个浓度均设3个平行(处理孔)，然后在空白孔和处理孔中均加入100 μL已培养至对数期的E. coli菌液，此时，所有孔中的溶液总体积为200 μL。以上过程重复做3次即加3块板，以此避免误差。然后全部置于37 ℃恒温振荡培养箱中静置培养，分别在暴露时间为0.25、2、4、8和12 h取出微板，使用酶标仪检测其OD600值。具体过程详见参考文献[24]。污染物对E. coli生长的抑制率计算如式(1)所示：

(1)

式中：E为抑制率，OD600,0为空白对照孔平均OD600测量值，OD600为实验处理组平均OD600测量值。

1.4 细胞形态的观察

为了探讨3种氨基糖苷类抗生素及其三元混合体系对E. coli的抑制机制，采用电镜扫描技术，以分析3种抗生素及其三元混合体系代表射线R1在12 h-EC50条件下对E. coli细胞结构的影响。取处于对数生长期的E. coli悬液置于不同锥形瓶中，再向瓶中加入3种氨基糖苷类抗生素及其混合物代表射线，使瓶中抗生素及其混合物浓度为12 h时的EC50浓度，锥形瓶最终体积为40 mL，置于37 ℃、170 r·min-1的恒温摇床中培养12 h。培养完成后，将锥形瓶中培养好的时间悬液置于离心管中，在8 000 r·min-1条件下离心15 min，弃上清液。再加入磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1，pH=7.4)清洗3次，每次10 min。之后加入2.5%戊二醛，固定过夜(4 ℃，12 h)。固定完成的菌体再采用磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1，pH=7.4)清洗3次，每次20 min。然后，采用从低到高的系列浓度的乙醇溶液对菌体进行脱水处理。最后采用冷冻干燥机干燥菌体8～12 h，喷金，并置于扫描电镜下观察菌体细胞形态，具体实验步骤见文献[25]。

1.5 混合物设计

为了尽可能全面地考察3种氨基糖苷类抗生素，在整个浓度空间范围内对E. coli的抑制效果，3种抗生素的三元混合物体系采用均匀设计射线法(UD-Ray)[26]设计，采用U7(76)均匀表[27]，共计5条混合物射线(R1、R2、R3、R4和R5)，混合物的设计水平及每条射线的混合体系组分构成和浓度比(pi)如表2所示。

1.6 浓度-效应曲线拟合

对在不同暴露时间得到的浓度-效应数据可以用两参数非线性函数Weibull拟合，并在软件APTox上完成[28]，并绘制浓度-效应曲线(concentration-effect curve, CRC)，Weibull表达式如式(2)所示：

E=1-exp(-exp(α+βlgc)

(2)

式中：E. coli的抑制率为E，参数和斜率参数分别为α和β，单个抗生素或其混合物的浓度为c。

1.7 混合物毒性作用相互分析

用CA模型对混合物体系之间的相互作用进行预测和评估[29]，其表达式如式(3)所示：

(3)

式中：m代表混合物体系中的组分数；ci代表混合物体系中第i个组分所表现出x%效应时对应的浓度；ECx,i表示混合物体系中第i个组分单独作用时所表现出x%效应时对应的浓度[30]。

当CA预测线位于95%置信区间(observed confident interval, OCI)以上、区间内或以下时，则认为混合物各组分之间发生了拮抗、加和或协同作用[31]。

拟合归零法可以进一步定量分析混合物组分间的相互作用，其基于浓度加和偏离指数(deviation from CA model, dCA)与95%OCI可直观表达混合物体系中拮抗和协同作用的强度。dCA、dOCI表达式分别如式(4)和式(5)所示：

dCA=(EPRD-EOBS)×100%

(4)

dOCI=(OCIx-EOBS)×100%

(5)

式中：EPRD为CA预测效应，EOBS为拟实验效应，OCIx为置信区间。当dCA在dOCI内时，说明混合物体系为加和作用；当dCAdOCI上限时，其绝对值越大说明混合物体系中的拮抗作用越强。

2 结果(Results)

2.1 3种氨基糖苷类抗生素对E. coli的抑菌毒性

采用Weibull函数对3个抗生素在不同暴露时间的浓度-效应数据进行拟合，拟合结果如表3所示。由表3可知，Weibull函数对3种抗生素的浓度-效应数据拟合结果除0.25 h外都较好(RMSE<0.10，r>0.90)，这可能是由于菌液刚接入到微板中，不够稳定，浓度-效应关系不够好，也可能需要其他更好的函数拟合。3种抗生素均对E. coli具有明显的抑制作用(pEC50>4.40)，但在相同的暴露时间，3种抗生素对于E. coli的抑制效果各不相同，且随着暴露时间的延长，其抑制效果大小的顺序也发生了改变。通常用半数浓度效应(EC50)的负对数(pEC50)值作为毒性大小的指标[32]，结果显示，暴露时间不同，3种抗生素的抑菌毒性顺序不同，在2～4 h时，抑制毒性大小顺序为：DIH(pEC50=4.92～5.15)>NEO(pEC50=4.46～4.70)>APR(pEC50=4.44～4.50)；在8～12 h，抑制毒性大小顺序为：DIH(pEC50=5.66～5.85)>APR(pEC50=5.52～5.57)>NEO(pEC50=5.06～5.18)。

3种氨基糖苷类抗生素对E. coli均具有明显的抑制作用，随着暴露时间的延长，同一种抗生素的pEC50逐渐增大，且3种抗生素抑制作用的大小顺序均随着暴露时间的延长而不断变化，到达最终暴露时间12 h时，抑制毒性大小关系为：DIH>APR>NEO。

在不同暴露时间，3种氨基糖苷类抗生素对E. coli的浓度-效应数据通过非线性函数Weibull拟合的CRC绘于图2。

由图2可知，3种氨基糖苷类抗生素对E. coli的CRC均是随暴露时间的延长从下到上出现偏移，表明3种氨基糖苷类抗生素对E. coli的抑制效果均具有明显的时间依赖性。在暴露时间为0.25 h时，3种氨基糖苷类抗生素对于E. coli均未产生明显的抑制效果；但随暴露时间的延长，在4～8 h时，其抑制作用均出现明显的增强；在暴露时间为8～12 h时，其抑制效应均呈现增加缓慢趋势。虽然3种氨基糖苷类抗生素在低浓度时，对于E. coli的抑制效果均不明显，且抑制效果也并未随着时间的延长而发生变化，但是在高浓度时，3种氨基糖苷类抗生素对于E. coli均表现出明显的抑制效果，且抑制效果与时间成正比，表现出了显著的时间依赖性。丁婷婷等[33]研究发现氨基糖苷类抗生素对蛋白核小球藻和Q67青海弧菌2种受试生物的抑制效果均随着暴露时间的延长而增强，可见，暴露时间和浓度对于实验结果均有重要的影响。

3种氨基糖苷类抗生素对E. coli的抑制毒性具有明显的时间依赖性，整体抑菌效果呈现出随着暴露时间的延长，抑制效果愈发显著；在0.25～8 h时，抑制效果增加较为明显，在8～12 h时，抑制效果增加略缓慢，且低浓度增加幅度没有高浓度的明显。

2.2 3种氨基糖苷类抗生素三元混合物体系对于E. coli的抑制效果

为了探究3种氨基糖苷类抗生素联合抑制作用，以3种氨基糖苷类抗生素构成的三元混合物体系为研究对象，通过t-MTA获得浓度-效应数据，三元混合物的浓度-效应关系可用Weibull函数有效表征(RMSE<0.10，r>0.90)，三元混合体系的5条射线毒性数据拟合结果及统计参数如表4所示。

由表4可知，5条曲线都对E. coli有着明显的毒性作用(pEC50>4.60)，且R1、R2、R3、R4和R5分别在不同暴露时间节点的pEC50都有一定的差异。在不同的暴露时间节点下，5条射线的毒性大小顺序也发生变化，结果显示：当暴露时间4 h时，抑制大小顺序为：R2(pEC50=5.03)>R4(pEC50=4.83)>R5(pEC50=4.81)>R1(pEC50=4.75)>R3(pEC50=4.74)，而暴露时间为12 h时，抑制大小顺序为：R2(pEC50=5.42)>R4(pEC50=5.38)>R5(pEC50=5.29)>R3(pEC50=5.05)>R1(pEC50=5.01)，但整体呈现出：随着时间的延长，每条曲线的pEC50都有略微的上升，说明三元混合物的抑制效果同样具有时间依赖性，并且抑制效果与暴露时间成正比。

采用CA模型来探究分析混合物各组分之间的相互作用，APR-DIH-NEO三元混合体系各射线的CRC图如图3所示。由图3可知，三元混合物的5条射线都存在明显拮抗作用，且有部分射线在短暴露时间下存在协同作用。在0.25 h时，5条曲线的形状相似且曲线均未发生变化，可以表明此时三元混合物体系对E. coli没有抑制效果或者抑制效果过低，且此时的抑制效果与单个抗生素对E. coli的抑制效果相似；在2～12 h内，5条射线的抑制效果均随着暴露时间的延长而增强。

R1与R3射线在0.25 h时，CA预测线落于95% OCI内，出现加和作用；在2～8 h内，CA预测线在高浓度范围处落于95% OCI下方，出现了协同作用；在12 h时，CA预测线却在中高浓度范围处落于95% OCI上方，呈现出与前期截然不同的拮抗作用。分析发现：射线R1与R3具有相似性，且R1与R3射线中NEO浓度配比均达80%上，这可能是导致R1与R3射线出现相同效应的原因。而R2、R4与R5射线也具有一定的相似性，在0.25 h时，CA预测线同样落于95% OCI内，出现加和作用；在2 h时，R2与R4射线的CA预测线落于95% OCI内，出现加和作用，而R5射线的CA预测线在高浓度处落于95% OCI下方，出现协同作用；在4～12 h时，除R4射线外，R2和R5射线的CA预测线在中高浓度处落于95% OCI上方，出现拮抗作用，而R4射线的CA预测线却落于95% OCI内，出现加和作用。

运用拟合归零法进一步定量评估APR-DIH-NEO三元混合物的相互作用强度，5条混合射线的拟合归零指数图如图4所示。

由图4可知，5条射线在0.25 h时，dCA均未出现明显的变化。射线R1与R3在2～8 h内，中高浓度区域的dCA值dOCI上限，这表明R1与R3射线组分间的协同强度不断减小，并最终过渡到拮抗作用；射线R2、R4与R5在0.25～2 h内，整体呈现dCA值虽在dOCI内，但有拮抗作用的趋势，在4～12 h内，中高浓度区域的dCA值>dOCI上限，且dCA值随着暴露时间的延长先增大后减小，这表明组分间的拮抗强度先增大后减小。在中高浓度区域组分间的相互作用强度变化较为明显，而低浓度区域无明显变化。射线R4在暴露时间为4 h，浓度为2.74E-06 mol·L-1时，三元混合体系的dCA达到最大值为15.70%，即此时在一定混合比例下，三元混合物可产生一定的拮抗作用，且该混合体系的作用效果低于3种氨基糖苷类抗生素单独作用效果的15.70%。

2.3 3种氨基糖苷类抗生素及其混合物对E. coli的细胞结构的影响

对细菌而言，能否进行生命活动的前提是其细胞结构是否正常[34]。当细胞的结构遭受到破坏，细菌的各项代谢活动就会出现紊乱，从而导致死亡。因此，测定了3种氨基糖苷类抗生素及其混合物在12 h-EC50条件下对于E. coli细胞的影响，并以R1射线进行电镜观测，结果如图5所示。

由图5可知，在经过3种氨基糖苷类抗生素及其三元混合物处理后，部分E. coli细胞出现了收缩，并转变为椭球形，细胞表面粗糙不平，菌体外壁不完整，且少量细胞出现了内陷的现象；空白对照组和阴性对照组的E. coli细胞呈杆状，外观无变形，菌体结构完整。这表明3种氨基糖苷类抗生素及其三元混合物会破坏E. coli细胞的形态结构，使其无法正常生存，从而导致死亡。张赟彬等[35]发现肉桂酸对E. coli作用后，其细胞结构发生塌陷，胞膜表面褶皱破裂，核酸与蛋白质外流，导致细胞死亡。

为进一步观察药物对E. coli细胞结构的损伤程度，高倍镜的扫描图像如图6所示。由图6可知，在经过APR作用后，E. coli表面出现褶皱但未出现破裂；DIH作用后，部分菌细胞出现短球形并有部分细胞出现破裂；NEO作用后，部分细胞出现内陷，菌体发生破裂；APR-DIH-NEO混合物作用后，部分细胞呈现出短球形，细胞表面出现褶皱以及发生破裂。

3种抗生素及三元混合物作用于细胞前后，细胞结构出现明显变化，部分细胞内陷、坍塌，部分细胞形态变为椭球形。

通过对实验结果的进一步分析可得：除混合物的浓度和组分配比因素外，暴露时间也是重要的影响因素。暴露时间的不同，其实验结果也不同；随着暴露时间的延长，其结果可能与实际情况更为相近，更具有准确性。所以，探究混合物组分间在动态暴露时间下的相互作用，更有利于环境生态风险的评估，并可为其提供一定的参考。

相关研究表明，氨基糖苷类抗生素的混合物在长暴露时间条件下，组分间可能会表现出现协同、拮抗或加和作用，且混合物间的相互作用类型受多重因素的影响[22,33]。据报道，即使污染物处于可观测浓度水平以下，其混合物也可产生明显的效应[28]。本实验结果显示3种抗生素处于环境浓度时，对E. coli的联合毒性呈加和作用，也不容忽视。

综上所述：

(1)3种氨基糖苷类抗生素及其三元混合物对E. coli的具有明显的抑制作用，在0.25 h均未产生明显的抑制效果，随着暴露时间的延长其抑制效果愈发明显，在12 h时，抑制率均达到70%以上，其抑制作用大小顺序为：DIH(pEC50=5.66～5.85)>APR(pEC50=5.52～5.57)>NEO(pEC50=5.06～5.18)。

(2)三元混合体系组分间呈现时间依赖协同和拮抗作用，即开始为加和作用，然后逐渐转为协同作用，最后所有射线均为拮抗作用：在0.25 h时，所有射线均为加和作用，在2 h时，除射线R2与R4表现为加和作用外，其余射线均为协同作用，在4～8 h时，除R1和R3表现为协同作用外，其余射线均为明显的拮抗作用；在12 h时，除射线R4表现为加和作用外，其余射线均为拮抗作用。

(3)三元混合体系的dCA值随暴露时间和混合物浓度的变化而变化。中高浓度区域组分间的相互作用强度变化较为明显，低浓度区域无明显变化，且在暴露时间为4 h，浓度为2.74E-06 mol·L-1时，三元混合体系射线R4的dCA达到最大值15.70%。

(4)通过扫描电镜可见，3种氨基糖苷类抗生素及其三元混合物作用前后，E. coli的细胞结构受到破坏；部分细胞变为椭球形，细胞表面粗糙不平，菌体外壁不完整，且少量细胞出现内陷。

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Characteristics of Combined Inhibitory Effects of Three Aminoglycoside Antibiotics on Escherichia coli

Hong Junhua1, Zhang Jin1,2,*, Luo Zongzong1, Ma Tianyi1, Shen Huiyan1

1. College of Environment and Energy Engineering, Anhui Jianzhu University, Hefei 230601, China 2. Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province, Hefei 230601, China

Abstract: The abuse of antibiotics has caused serious harm to human beings and their living environment. So, three aminoglycoside antibiotics: apramycin sulfate (APR), dihydrostreptomycin sulfate (DIH), neomycin sulfate (NEO) were selected as research objects, and Escherichia coli (E. coli) as the test organism. The uniform design ray method was used to design the ternary mixture system of antibiotics. A total of 5 rays with different concentration ratios were arranged. The time-dependent microplate toxicity analysis method was used to determine the concentration-inhibition data of antibiotics and their ternary mixture at 5 different exposure time (0.25, 2, 4, 8 and 12 h). Concentration addition (CA) model was used to analyze the toxicity interaction, and a return-to-zero fitting method was used to quantitatively characterize the strength of the toxicity interaction. The changes of E. coli cells were analyzed by scanning electron microscope. The results showed that the inhibition rates of APR, DIH, NEO and their ternary mixtures on E. coli were significantly time-dependent. Under different exposure time, the negative logarithm of median effect concentration (pEC50) orders of the three antibiotics varied and the order was DIH>APR>NEO at 12 h. Five mixture rays showed both synergistic and antagonistic effects on E. coli at 2～8 h. The interaction intensity of the five mixture rays decreased with the extension of exposure time, and turned into antagonism at 12 h. With the increase of concentration, the interaction intensity between components first increased and then decreased. When the concentration was 2.74E-06 mol·L-1 and the exposure time was 4 h, the dCA value of the mixture reaches the maximum value 15.70%. The effects of the three antibiotics and the ternary mixture on E. coli were mainly through the destruction of the cells’ morphology and structure, causing them to invagination, collapse and deformation.

Keywords: aminoglycoside antibiotics; Escherichia coli; time-dependence; antagonism; synergism

收稿日期：2022-01-27

录用日期：2022-03-26

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21677001)；安徽省省级质量工程项目(2020jyxm0354)；安徽建筑大学校级质量工程(2020xgk02，2020jy75)

第一作者：洪俊华(1997—)，男，硕士研究生，研究方向为生态毒理学，E-mail: 49919153@qq.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: ginnzy@163.com

DOI: 10.7524/AJE.1673-5897.20220127001

洪俊华, 张瑾, 骆纵纵, 等. 3种氨基糖苷类抗生素对大肠杆菌的联合抑制作用特点[J]. 生态毒理学报，2022, 17(5): 307-318

Hong J H, Zhang J, Luo Z Z, et al. Characteristics of combined inhibitory effects of three aminoglycoside antibiotics on Escherichia coli [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2022, 17(5): 307-318 (in Chinese)

文章编号： 1673-5897(2022)5-307-12

中图分类号： X171.5

文献标识码： A

Received 27 January 2022

accepted 26 March 2022

通讯作者简介：张瑾(1978—)，女，博士，教授，主要研究方向为环境污染监测、复合污染化学与生态毒理学研究。