哈尔滨蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素的污染现状

近年来，抗生素在医疗卫生、养殖业、畜牧业和农业等领域广泛应用，通过各种途径进入到土壤中，造成严重的土壤环境污染。据统计，在2013年，我国大约使用了162 000 t抗生素，其中约52%作为兽药用于动物生产、治疗疾病或饲料添加剂等[1-2]。然而，抗生素在动物肠道内吸收较弱，代谢不完全，30%～90%的抗生素以原型通过粪尿排出，导致动物粪尿中抗生素含量普遍较高，是环境中抗生素重要来源[3]。据报道，我国规模化养殖场每年畜禽粪便产量高达17.3亿t，80%以上的粪便没有经过综合处理就用于农业生产，尤其是蔬菜种植[4]。研究发现，抗生素可以被植物吸收进入组织[5]。Hu等[6]报道，有机蔬菜中抗生素残留量约为普通蔬菜的4倍，主要原因就是有机蔬菜基地以畜禽粪尿作为肥料，造成抗生素污染。因此，对于蔬菜基地土壤中抗生素残留的研究更有意义。

喹诺酮类抗生素具有难水解、难挥发的特点，不断在土壤中沉积，与土壤有较好的亲和力，不易转移[7]。喹诺酮类抗生素流入土壤后吸附能力很强，其吸附力大于大环内酯类和磺胺类等多种抗生素。并且此类抗生素降解条件比较苛刻，在紫外线条件下更易降解[8]。广东省东莞市蔬菜基地中喹诺酮类抗生素的检出率均在90%以上，浓度总含量范围为1.92～160.45 μg·kg-1[9]。吴小莲等[10]在珠江三角洲地区蔬菜基地土壤研究中发现喹诺酮类抗生素检出率相对于四环素类抗生素高。本课题组前期研究了哈尔滨蔬菜基地四环素污染状况，发现所选城区蔬菜基地土壤中均检测出四环素类抗生素的残留[11]。因此，本文建立超声辅助提取法(sonication assisted extraction, SAE)、固相萃取(solid phase extraction, SPE)、超高效液相色谱-紫外检测(ultra-high performance liquid chromatography-ultraviolet, LC-UV)结合质谱检测(mass spectrometry, MS)法，对哈尔滨双城、五常、呼兰和平房4个寒冷气候地区蔬菜基地中喹诺酮类抗生素残留情况进行研究。同时，对其生态风险进行评估，为哈尔滨蔬菜基地土壤中抗生素污染治理提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 土壤样品采集和处理

选取哈尔滨双城、五常、呼兰和平房蔬菜基地作为研究地区，于2015年冬季(1—2月)期间，前往并进行采样。采集了4个地区的土壤样品，分别标记为双城：样品Ⅰ，五常：样品Ⅱ，呼兰：样品Ⅲ，平房：样品Ⅳ。多点位采集表层土壤(0～20 cm)样品，组成混合样，按四分法缩减，冷冻干燥后粉碎过60目筛，避光处保存待用。

1.2 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪(Waters 2695-2996，美国Waters公司)；超声波清洗机(JP-030ST，深圳市洁盟清洗设备有限公司，中国)；Waters Symmetry ShieldTM色谱柱(美国沃特世科技公司)；低速台式离心机(TDL80-2B，济南博鑫生物技术有限公司，中国)。

环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)、洛美沙星(lomefloxacin, LOM)和诺氟沙星(norfloxacin, NOR)均购自中国药检所(纯度>96.0%)。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自山东禹王实业有限公司化工分公司；甲醇为分析纯，购自天津市富宇精细化工有限公司；乙腈(分析纯)、甲酸(色谱纯)、磷酸二氢钾(分析纯)，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)为分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂；磷酸为分析纯，购自天津市天力化学试剂有限公司；乙酸为色谱纯，购自天津市耀华化学试剂有限责任公司。

1.3 土壤样品预处理方法

用称量纸称取5.00 g土壤样品和5.00 g EDTA依次放入50 mL锥形瓶中，加入10 mL配制好的乙腈-磷酸盐缓冲液(l∶l，V∶V)，摇晃5 min，超声15 min后放置在工作台静置、过滤、离心(4 000 r·min-1 10 min)，收集上清。锥形瓶底部留有残渣，反复提取2次，合并上清。将提取液旋转蒸发，待体积减半过净化小柱。将5 g C18填料加入小柱，震荡压实。分别使用甲醇、乙腈-磷酸盐缓冲液和高纯水(1∶1∶1，V∶V∶V)仔细清洗。待净化样品过净化小柱后使用高纯水去除杂质，紧接着加入甲醇洗脱，将洗脱液在50 ℃下蒸发至干后加入甲醇溶解，定容至1 mL，待检测。

1.4 标准品溶液的制备

精密称取CIP标准品10 mg，置10 mL棕色瓶中，加入纯甲醇定容至刻度，混匀，得到1 g·L-1的储备液，同样方法配制ENR、LOM和NOR标准溶液，冰箱-18 ℃避光保存，备用。在1 g·L-1储备液的基础上加入纯甲醇稀释得到不同浓度的标准溶液。

1.5 检测条件

色谱柱Waters Symmetry ShieldTM(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温25 ℃，流速0.8 mL·min-1；CIP、ENR和LOM的流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈；NOR的流动相A为0.1%乙酸溶液，流动相B为乙腈；进样量为20 μL。洗脱程序如表1所示。

电离模式为电喷雾离子源(electrospray ionzation, ESI)，扫描方式为负离子扫描，检测模式为多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)，干燥气N2，干燥气温度35 ℃，干燥气流速10 L·min-1，雾化气压力30 psi，毛细管电脉压-4 500 V。其他质谱条件如表2所示。

1.6 质量控制与质量保障

目标抗生素采用内标法定量，CIP、ENR在5～1 000 μg·L-1线性范围内线性关系良好，LOM、NOR在5～600 μg·L-1的浓度范围内线性关系良好，相关系数≥0.9994。4种喹诺酮类抗生素精密度、重现性良好，回收率范围为68.1%～80.2%，回收率良好，相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)均≤10%。

1.7 生态风险评估

采用风险商(risk quotient, RQ)对哈尔滨蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素的暴露风险进行评估，RQ计算公式如下：

式中：MEC为抗生素实测有效应浓度(minimal effective concentration)；PNEC为抗生素预测无效应浓度(predicted no effect concentration)，其值与敏感物种、毒性数据等相关。当RQ>1时，表明存在较高风险；当0.1soil)缺乏相关数据，根据欧盟技术指导文件(technical guidance document on risk assessment, TGD)，利用已有研究中抗生素的PNECwater的数值(表3)，通过平衡法换算得到PNECsoil值，公式如下：

式中：Ksoil-water为有机物土壤-水分配系数，其值由下式计算确定：

式中：Fwater-soil和Fsolid-soil分别为水相和固相在土壤中的体积系数，本文采用TGD中标准环境定义值，分别为0.2和0.6；Kpsoil为固相-水相分配系数，TGD中推荐采用0.02倍的Koc作为其值；RHOsoil为固相密度，本文采用TGD推荐值2 500 kg·m-3。

Koc可通过辛醇-水分配系数(Kow)估算求得，如公式(4)，该式对logKoc估算误差符合正态分布，平均误差为0.48个对数单位。本文采用的抗生素logKow值如表3所示。

2 结果(Results)

2.1 分析方法的优化

2.1.1 样品提取方法及提取剂的选择

由于乙腈极性适中，对各个类型的抗生素均具有良好的溶解能力，因此，乙腈体系是应用最广泛的提取剂，试验选取乙腈∶磷酸盐缓冲液(1∶1，V∶V)，提取效果最佳，杂质干扰小，回收率较高，故采用该比例作为提取剂体系。

2.1.2 样品提取时间的选择

考察提取时间为5、10、15和20 min时样品抗生素提取含量，如图1所示。结果表明，15 min时，土壤中各抗生素的提取量明显高于5、10和20 min的提取量，因此适宜提取时间为15 min。

2.1.3 样品提取温度的选择

考察温度10、20、30和40 ℃对样品提取含量的影响。结果表明，提取温度为40 ℃时土壤中各抗生素的提取量比10、20和30 ℃的明显增加(图2)，因此适宜提取温度为40 ℃。

2.1.4 样品提取溶剂量的选择

考察乙腈-磷酸盐缓冲液提取溶剂量5、10、15和20 mL对样品提取含量的影响。结果表明，提取溶剂量为10 mL和15 mL时，土壤中各抗生素的提取量有比较明显的提高，从经济环保的角度考虑(图3)，选取的最适提取溶剂量为10 mL。

2.2 土壤中喹诺酮类抗生素残留种类的测定

通过质谱检测结果发现，每块蔬菜基地样品中检测出的喹诺酮类抗生素种类不同，样品Ⅰ中检测出CIP；样品Ⅱ中检测出CIP和NOR；样品Ⅲ中检测出CIP、ENR、LOM和NOR；样品Ⅳ中检测出CIP和ENR。

2.3 土壤中喹诺酮类抗生素残留含量的测定及生态风险评估

如图4所示，4种抗生素保留时间依次为CIP 8.5 min，NOR 12.8 min，LOM 13.84 min，ENR 14.78 min。由图4可知，双城、五常、呼兰和平房4个蔬菜基地中喹诺酮类抗生素残留种类，各峰分离度良好，蔬菜基地中喹诺酮类抗生素残留量及RQ值如表4所示。

由表4可知，被检测出来的CIP、ENR、LOM和NOR的RQ值均≥1，说明喹诺酮类抗生素处于高风险水平，对哈尔滨蔬菜基地土壤生态环境有严重的潜在风险。其中，CIP在双城、五常和平房区最为突出，RQ值分别高达20.30、23.08和22.40。ENR在呼兰区最为突出，RQ值为30.39。

3 讨论(Discussion)

喹诺酮类抗生素作为生产量和使用量均较高的人畜共用药，经常在环境中被检出。喹诺酮类抗生素进入生物体内仅有少部分被机体吸收利用，大部分以原形及代谢产物的形式排出，在环境中累积，易引起细菌耐药，威胁人体健康[12]。本次实验选择高寒地带哈尔滨，选取4个具有代表性的区域，如乳业发达的双城、水稻种植区五常、人口密集的呼兰和周边企业较多的平房这4个区域的蔬菜基地土壤样本。研究结果显示，哈尔滨蔬菜基地土壤中均存在喹诺酮类抗生素残留，对周围环境及居民具有潜在的健康影响。

常用的土壤抗生素提取方法主要为超声辅助提取法(SAE)和加速溶剂萃取法(accelerated solvent extraction, ASE)等方法。SAE通过空化作用使分子运动加快，将超声波的能量传递到土壤样品中，加快溶解速度[13]。ASE是在较高的温度和压力下，用有机溶剂萃取固体或半固体的自动化方法。与ASE相比，SAE具有操作简单，可同时提取多种样品的优点，目前已被广泛应用于药物残留、天然药物成分提取和医疗化工等分析领域。因此，本实验采用SAE法提取喹诺酮类抗生素。超声不仅可以将土壤样品中残留的抗生素与提取液充分混合，还可以加快样品中抗生素脱附的速度。超声时间过短，容易混合不充分，脱附不彻底，超声时间过长会增加干扰物质。提取温度升高可以加速分子间的热运动，加快分子溶出，有利于提取抗生素，而温度过高，会导致抗生素分子被破坏反而不利于提取。提取液用量对提取效果会有一定的影响，用量少导致土壤中残留的抗生素提取不完全，提取量偏低；用量多虽然会使抗生素提取更完全，但是同时提取的杂质也会变多，干扰较大。根据实验结果，本实验选取超声时间为15 min、提取温度40 ℃和提取液用量为10 mL为最佳。

本研究中哈尔滨地区CIP、ENR、LOM和NOR检出率分别为100%、50%、25%和50%，喹诺酮类抗生素自身吸附能力强、半衰期长的特点是其检出率高的主要原因，导致其极易在土壤表层累积。同时CIP是喹诺酮类抗生素中的高效抗菌药，用量大且使用广泛，因此出现检出率100%的现象[14-15]。由喹诺酮类抗生素残留量检测结果可知，CIP不仅在4个蔬菜基地均有检出，同时双城、五常和平房地区土壤样品中CIP浓度及呼兰地区土壤样品中ENR浓度均超过了兽药国际协调委员会规定的生态毒害效应触发值(100 μg·kg-1)[16]。生态风险评估结果显示，被检测出的喹诺酮类抗生素风险商(RQ)值均高于1，表现出高度风险。CIP生态风险等级排序依次为五常23.08>平房22.40>双城20.30>呼兰3.58。呼兰地区ENR风险评估RQ值最高，为30.39。双城养殖业发达，作为哈尔滨主要的畜牧区，饲养大量奶牛，兽用抗生素的大量使用是周边土壤中残留超标的主要原因[17]。五常为哈尔滨地区的水稻种植区，施加未经处理的畜禽粪便作为有机肥，同时用含有未经降解的抗生素的水源灌溉也是土壤抗生素残留的重要原因[18]。平房区分布较多的制药企业，制药废水中的抗生素无法完全降解是土壤含量超标的原因[19]。呼兰区坐落于哈尔滨松花江北岸，借助地理环境的优势，当地开发大量鱼塘，ENR作为水产养殖专用抗生素，因此在呼兰区蔬菜基地土壤中出现ENR超标的现象[20]。本次试验选取的土壤样品为1—2月的冬季土壤样品，哈尔滨冬季气温低至-30 ℃，受气候条件及低温的影响，土壤结构、水分含量及微生物活性均会影响抗生素的降解，因此哈尔滨冬季土壤抗生素浓度会高于其他季节[21]，类似地，Hu等[22]研究发现冬季抗生素残留量与夏季相比较多，冬季环境风险较高。

本研究结果表明：(1)本实验选取的4个哈尔滨蔬菜基地土壤中存在喹诺酮类抗生素残留；(2)哈尔滨蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素残留超标可能由于冬季气温低、抗生素降解速度慢造成的；(3)双城、五常和平房地区土壤样品中CIP的浓度及呼兰地区土壤样品中ENR的浓度均超过生态毒性效应触发值(100 μg·kg-1)，具有潜在生态风险；(4) CIP、ENR、LOM和NOR在土壤环境中的RQ值均≥1，对生态环境存在较高风险。

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