近年来，我国食品安全状况良好，单个农药残留符合食品中最大残留限量的规定，但是多种低浓度农药混合残留时有发生，形成“农药鸡尾酒”效应[1]。在豇豆、芹菜、韭菜和白菜等生蔬中常检出多种农药混合残留[2]，推测农药可通过饮食摄入在人体体内蓄积，对人体健康造成不利影响。不同农药组合间可能独立作用；也可能存在拮抗作用或协同作用，具有联合毒性效应。Fan等[3]的研究表明，多菌灵和毒死蜱在不同浓度配比以及不同效应水平范围内对斑马鱼胚胎致死率和致畸率表现出不同的联合作用模式。Garcia等[4]的研究表明，乙酰甲胺磷、多菌灵和代森锰锌的二元和三元组合对雄性幼鼠的生殖毒性具有拮抗作用。由此可见，在生蔬中农药残留种类繁多，组合方式复杂，评价农药联合作用模式和机制困难，给风险评估带来巨大挑战，而我国尚未制定多种农药残留的食品卫生标准[5]。因此，探明不同农药组合间的联合作用模式，对于有效评估食品中农药残留混合物的联合毒性效应具有重要意义。
多菌灵(carbendazim, CBZ)和苯醚甲环唑(difenoconazole, DFZ)是2种常用的杀菌剂，在生蔬中混合污染的情况也十分常见，Qin等[5]对中国中西部地区蔬菜和水果中杀菌剂类农药残留进行了风险评估，结果显示多菌灵和苯醚甲环唑是蔬菜和水果中最常见的农药。Zhang等[6]对中国上海的5种水果的农药残留进行检测和评估，发现超过56%的水果样品中含有2种以上农药残留，其中在桃子中检出多菌灵和苯醚甲环唑混合残留。多菌灵是广谱苯并咪唑类杀菌剂，通过与微管蛋白结合来抑制微观组装，从而干扰真菌细胞分裂过程中DNA的生物合成[7]。其毒性作用与内分泌干扰效应，诱导氧化应激，以及损害微管组装的稳定性有关，此外还具有生殖毒性，损害小鼠精子发生[3-4, 8]。苯醚甲环唑是广谱三唑类杀菌剂，其作用机理是干扰真菌中麦角甾醇的生物合成从而导致真菌细胞膜的形态和功能变化，最终抑制真菌的生长[9]。先前的研究表明，苯醚甲环唑对斑马鱼幼鱼和成鱼具有肝毒性，引起脂质代谢紊乱[10]，诱导氧化应激，促进细胞凋亡的作用[11]。已有一些研究报道多菌灵和苯醚甲环唑具有神经毒性[7, 12-14]，二者的联合神经毒性研究未见报道。因此，本研究的目的是探究多菌灵和苯醚甲环唑单独和复合暴露对人神经瘤细胞母细胞(SK-N-SH)细胞活力的影响，使用联合指数法评估混合物的联合毒性作用，并进一步探究了农药单药和混合物对活性氧蓄积的影响，为不同农药间的联合毒性评估提供数据支撑。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 材料
1.1.1 试验细胞株
人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)，购自中国科学院细胞库，培养在含有10%(V∶V)胎牛血清(FBS)、1%(V∶V)GlutaMAXTM Supplement、1%(V∶V) 丙酮酸钠 (100 mmol·L-1)、1%(V∶V)MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100×)的MEM基础培养基中，培养条件为37 ℃、5% CO2(V∶V)和饱和湿度。
1.1.2 试验试剂
多菌灵标准品，纯度为98.24%，购自美国MedChemExpress公司；苯醚甲环唑标准品，纯度为98.24%，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；MEM培养基、GlutaMAXTM Supplement、丙酮酸钠 (100 mmol·L-1)、MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100×)、胰蛋白酶(0.05% Trypsin-EDTA)购自美国Gibco公司，4 ℃保存；胎牛血清购自以色列BI，-20 ℃保存；二甲基亚砜(DMSO；纯度≥99.5%)购自美国Sigma公司；MTT购自Yojanbio公司；CM-H2DCFDA探针购自美国Invitrogen公司；其他试剂均为分析纯。
1.1.3 试验仪器
3100型CO2培养箱购自美国ThermoFish公司；BX61光学显微镜购自日本Olympus公司；FACScalibur流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司、MK3和SpectraMax i3x多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司。
1.2 试验方法
1.2.1 染毒液的制备
将多菌灵和苯醚甲环唑原药用DMSO溶解，配成一定浓度的标准储备液，分装200 μL PCR管并储存于-20 ℃下。试验时使用含5%(V∶V)胎牛血清的MEM培养基稀释至所需浓度。
1.2.2 试验设计与剂量选择
使用0(0.1% DMSO溶剂对照组)、0.335、1.674、8.369、16.737、41.843、83.686、209.216、261.52和523.04 μmol·L-1的多菌灵工作液，以及0(0.1% DMSO溶剂对照组)、0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、40、60和80 μmol·L-1的苯醚甲环唑工作液分别染毒处理SK-N-SH细胞24 h，测定细胞活力，计算2种农药的IC50值。采用等毒性配比法，设置多菌灵和苯醚甲环唑的混合物，以0(0.1% DMSO溶剂对照组)、1.31、2.62、5.24、10.48、16.77、20.96、41.92、83.84和104.8 μmol·L-1的多菌灵和苯醚甲环唑混合物染毒处理SK-N-SH细胞24 h后检测联合染毒后的细胞活力。
根据细胞活力测定计算得出多菌灵和苯醚甲环唑对SK-N-SH细胞的IC20分别为5.82 μmol·L-1和22.08 μmol·L-1，IC10分别为1.67 μmol·L-1和16.88 μmol·L-1。按照3×3析因设计进行多菌灵和苯醚甲环唑联合染毒(表1)后测定活性氧(ROS)生成。
1.2.3 MTT法测定细胞活力
取处于对数生长期的细胞，待细胞常规消化后，将细胞悬液稀释到合适密度，用排枪吸取150 μL至96孔板中，使每孔为15 000个细胞，培养至细胞融合度达到70%。取多菌灵和苯醚甲环唑工作液染毒24 h后，每孔加入15 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)于37 ℃准确孵育4 h。孵育4 h后，完全吸弃培养基，每孔加150 μL DMSO，在平板振荡器上混匀，使甲瓒结晶充分溶解。在10 min内用酶标仪在570 nm检测光密度(OD)值。通过下列公式计算细胞存活率：
Rv=(A1-A0)/(A2-A0)×100%
式中：Rv表示细胞存活率(%)；A0表示空白对照组吸光度值；A1表示试验组吸光度值；A2表示对照组吸光度值。
1.2.4 CM-H2DCFDA荧光探针检测ROS
取处于对数生长期的细胞消化并稀释，以密度为6×105 个·孔-1，体积为2 mL·孔-1接种于六孔板中，37 ℃培养箱培养24 h后，弃去原培养基，加入含5% FBS培养基稀释的农药或农药混合物1.3 mL，染毒处理24 h。将CM-H2DCFDA探针溶于8.6 μL DMSO中，配成10 mmol·L-1母液。用无血清培养基稀释成10 μmol·L-1工作液。在含有被单一农药或农药混合物处理后细胞的六孔板每孔加入1 mL配制好的CM-H2DCFDA工作液，37 ℃培养箱孵育20 min。每孔用1 mL PBS分别洗3次，以充分除去未进入细胞内的探针。加入200 μL胰酶消化，用1 mL无血清培养基终止消化。1 000 r·min-1离心5 min，弃掉上清。加入300 μL PBS，使用流式细胞仪，上机检测。
1.2.5 数据统计
采用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行统计和分析，试验结果都用均数±标准差
表示。细胞活力数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05表示具有统计学意义上的显著差异。采用Graphpad 8.0计算IC50值，并绘制细胞活力曲线。使用CompuSyn软件计算CI值，分析联合作用效应。对于ROS数据，采用析因设计的方差分析，检验水准为α=0.05，判断2种农药是否具有相互作用，若发现二者存在相互作用关系，再通过边际均值图来判断相互作用的类型。当均值图中显示2条曲线相互平行，则证明二者不存在交互作用，是相加作用；当边际均值图中显示随着染毒浓度的增加，2条曲线相互远离，则说明多菌灵和苯醚甲环唑对细胞ROS生成存在协同作用；随着染毒浓度的增大，2条曲线相互靠近，则说明多菌灵和苯醚甲环唑对细胞ROS生成存在拮抗作用。
表1 试验用联合染毒剂量
Table 1 Experimental combined concentration
多菌灵/(μmol·L-1) Carbendazim/(μmol·L-1)苯醚甲环唑/(μmol·L-1)Difenoconazole/(μmol·L-1)01.675.8216.8816.88+1.6716.88+5.8222.0822.08+1.6722.08+5.82
2 结果(Results)
2.1 多菌灵和苯醚甲环唑单独染毒24 h后对细胞活力的影响
采用MTT法，探究多菌灵和苯醚甲环唑分别对SK-N-SH细胞的细胞活力的影响。多菌灵和苯醚甲环唑对细胞存活率的剂量-反应曲线如图1所示，随着浓度的升高，多菌灵和苯醚甲环唑对细胞存活率的抑制作用增强。计算得出多菌灵和苯醚甲环唑的IC50值分别为48.96 μmol·L-1和34.88 μmol·L-1。
图1 不同浓度多菌灵(a)和苯醚甲环唑(b)单独染毒24 h后的细胞存活率
Fig. 1 Effects of 24 h single exposure to carbendazim (a) and difenoconazole (b) on cell viability
2.2 多菌灵和苯醚甲环唑联合染毒24 h后对细胞活力的影响
如图2(a)所示，多菌灵与苯醚甲环唑联合染毒处理SK-N-SH细胞24 h后，计算得出IC50值为34.92 μmol·L-1。采用联合指数(CI)联合作用评价模型，评价混合物的联合作用模式。CI值是定义药物组合联合作用模式的一种数学工具，当CI<1时，药物组合表现为协同作用；当CI>1时，药物组合表现为拮抗作用；当CI=1时，药物组合表现为相加作用。如图2(b)所示，多菌灵和苯醚甲环唑在混合物效应水平不同时表现出不同的联合作用模式，在混合物的效应水平为0～50%时，CI>1，多菌灵和苯醚甲环唑表现为拮抗作用；在混合物的效应水平为50%～100%时，CI<1，多菌灵和苯醚甲环唑表现为协同作用。
图2 多菌灵与苯醚甲环唑联合染毒对细胞存活率的影响及其联合作用模式
注：(a) 多菌灵与苯醚甲环唑联合染毒24 h细胞存活率；(b) 多菌灵与苯醚甲环唑的细胞存活率联合作用模式图；CI表示联合指数。
Fig. 2 Effects of combined exposure to carbendazim and difenoconazole on cell viability and the mode of action of their combined effects
Note: (a) Cell viability of SK-N-SH cells after exposure to mixture of carbendazim and difenoconazole for 24 h; (b) Interaction profile plots of carbendazim and difenoconazole on cell viability; CI stands for combination index.
2.3 多菌灵和苯醚甲环唑及其混合物对SK-N-SH细胞形态的影响
使用光学显微镜观察多菌灵和苯醚甲环唑单独和联合暴露后SK-N-SH细胞形态的变化。由图3可知，用苯醚甲环唑的IC50浓度(34.88 μmol·L-1)处理细胞24 h后，细胞密度降低，漂浮细胞增多，细胞体积变小；用多菌灵IC50浓度(48.96 μmol·L-1)处理细胞24 h，以及用多菌灵和苯醚甲环唑混合物IC50浓度(48.96 μmol·L-1多菌灵+34.88 μmol·L-1苯醚甲环唑)处理细胞24 h，细胞形态变化更为显著，由神经细胞的树枝状变为圆形，细胞膜皱缩，凹陷，细胞体积变小。这些结果表明，多菌灵和苯醚甲环唑单独和联合处理后细胞形态发生改变，发生了细胞损伤。
图3 多菌灵IC50浓度和苯醚甲环唑IC50浓度及其混合物的IC50浓度处理24 h后的SK-N-SH细胞形态
注：(a) 对照组；(b) 48.96 μmol·L-1多菌灵处理组；(c) 34.88 μmol·L-1苯醚甲环唑处理组；(d) 48.96 μmol·L-1多菌灵和34.88 μmol·L-1苯醚甲环唑联合处理组。
Fig. 3 Morphological changes of SK-N-SH cells after 24 h exposure to carbendazim, difenoconazole and their mixture at IC50 concentration
Note: (a) Control group; (b) 48.96 μmol·L-1 carbendazim treatment group; (c) 34.88 μmol·L-1 difenoconazole treatment group; (d) Combined treatment group.
2.4 多菌灵和苯醚甲环唑及其混合物对SK-N-SH细胞ROS生成的影响
采用3×3析因设计测定多菌灵和苯醚甲环唑单独和联合作用对SK-N-SH细胞ROS生成的影响。采用CM-H2DCFDA探针，在染毒处理24 h后，使用流式细胞仪测定ROS生成量，结果如图4(a)所示，根据流式细胞仪测定数据，绘制柱状图(图4(b))。结果显示，不同浓度的多菌灵和苯醚甲环唑单独和联合处理都能使SK-N-SH细胞内ROS生成增加。当苯醚甲环唑浓度为0时，多菌灵各处理组与对照组差异显著，显著促进细胞ROS生成；当苯醚甲环唑为低浓度(IC10，16.88 μmol·L-1)时，多菌灵各处理组与对照组差异不显著(P>0.05)；当苯醚甲环唑为高浓度(IC20，22.08 μmol·L-1)时，多菌灵高剂量组与对照组差异显著(P<0.05)，显著促进ROS生成。通过估算边际均值，进行简单联合效应分析，如图4(c)所示，多菌灵和苯醚甲环唑对SK-N-SH细胞ROS生成存在联合作用效应，当苯醚甲环唑在试验低浓度(16.88 μmol·L-1)时，两曲线相互靠近，表现为拮抗作用；当苯醚甲环唑在试验高浓度(22.08 μmol·L-1)时，两曲线相互远离，表现为协同作用。
图4 多菌灵(CBZ)和苯醚甲环唑(DFZ)及其混合物处理24 h后SK-N-SH细胞内活性氧(ROS)生成
注：(a) 流式细胞术检测不同处理24 h后SK-N-SH细胞ROS生成量；(b) 不同处理组间ROS生成量比较；(c) 联合作用模式图。
Fig. 4 Reactive oxygen species (ROS) generation of SK-N-SH cells after 24 h exposure to carbendazim (CBZ), difenoconazole (DFZ) and their mixture
Note: (a) ROS production of SK-N-SH cells detected by flow cytometry; (b) Comparison of ROS generation between different treatment groups; (c) Interaction profile plots.
3 讨论(Discussion)
3.1 多菌灵和苯醚甲环唑及其混合物对SK-N-SH细胞活力的影响
生蔬中的农药残留会对人体健康产生负面影响，多种农药已由试验证明具有神经毒性危害。哺乳动物神经毒性症状包括引发恶心呕吐、食欲不振、抽搐和运动障碍，严重者出现麻痹瘫痪；通过神经-内分泌轴(如下丘脑-垂体-性腺轴)可以推测，农药在改变神经系统中一些酶或细胞因子活性后可能影响全身脏器功能和免疫反应[15-16]。已有一些研究报道多菌灵和苯醚甲环唑具有神经毒性，Yoon等[13]的研究显示多菌灵暴露使非洲爪蛙的大脑发育异常并强烈抑制非洲爪蛙胚胎神经组织胚层诱导；朱俭勋等[12]经试验发现50～200 μg·mL-1的多菌灵染毒48 h后能够显著抑制鼠源神经细胞PC12增殖并诱导细胞凋亡；而Ezeoyili等[7]的研究则证实多菌灵暴露能抑制非洲鲶鱼大脑乙酰胆碱酯酶活性，干扰神经信号传递。同样，苯醚甲环唑被发现能显著降低试验虹鳟脑中的芳香化酶活性，造成动物性行为和生殖能力受损，雌性幼龄动物性分化紊乱，影响动物的脑损伤修复[14, 17-18]；Jimenez等[19]发现苯醚甲环唑暴露后使鱼类脑中胆碱酯酶活性略有下降。此外，研究表明多菌灵和苯醚甲环唑对动物还存在肝毒性[20-23]、生殖毒性[8, 24-27]、免疫毒性[28]和胚胎毒性[29-32]等严重毒害作用。
关于不同农药间的联合神经毒性效应此前已有部分报道，Fu等[33]经试验发现毒死蜱和克百威联合暴露对SK-N-SH细胞活力下降具有协同作用，另外，毒死蜱和氯氰菊酯联合暴露能以剂量和时间依赖性方式诱导SH-SY5Y细胞凋亡[34]。本研究结果显示多菌灵和苯醚甲环唑单独和复合暴露会使神经细胞SK-N-SH细胞活力下降，并发现二者对细胞活力影响的联合效应模式与混合物效应水平有关。在混合物效应水平为0～50%时，多菌灵和苯醚甲环唑表现为拮抗作用；混合物的效应水平为50%～100%时，多菌灵和苯醚甲环唑表现为协同作用。而细胞活力指标与ROS蓄积表现出相同的趋势，均表现出在低浓度范围内，苯醚甲环唑和多菌灵表现出拮抗作用；高浓度范围内二者表现出协同作用，推测氧化损伤是导致细胞活力降低的主要原因。此外，我们的研究结果也与Fan等[3]的研究结果一致，表明在不同浓度范围下，农药的联合作用模式不同。
3.2 多菌灵和苯醚甲环唑及其混合物对SK-N-SH细胞形态的影响
细胞形态变化能够最直观地显示药物处理引起的细胞损伤程度，在宋远超[35]的研究中发现多菌灵处理能使睾丸支持细胞体积变小，而苯醚甲环唑暴露则能使人肝癌细胞形态发生明显裂解[36]。在本研究中发现多菌灵和苯醚甲环唑单独及联合暴露后使SK-N-SH发生细胞损伤。在苯醚甲环唑暴露后出现细胞密度降低，漂浮细胞增多，细胞体积变小；多菌灵单独暴露以及多菌灵和苯醚甲环唑混合暴露后细胞形态变化更为显著，细胞形状由树枝状变为圆形，细胞膜皱缩、凹陷，细胞体积变小，进一步验证了多菌灵和苯醚甲环唑的联合神经毒性。此外，多菌灵和苯醚甲环唑单独和复合暴露可以显著诱导SK-N-SH细胞ROS蓄积。ROS可以上调促凋亡蛋白，下调抗凋亡蛋白，诱导细胞凋亡[33, 37]。大量研究表明，苯醚甲环唑和多菌灵可以在体外和体内诱导氧化应激和凋亡[11-12, 30, 38]。结合细胞形态学变化，本研究推测ROS过量生成导致的细胞凋亡途径在多菌灵和苯醚甲环唑的联合神经毒性中发挥重要作用。
3.3 多菌灵和苯醚甲环唑及其混合物对SK-N-SH细胞ROS生成的影响
氧化应激是农药毒理学研究中最重要的机制之一，氧化应激的发生一般是由于ROS的过量产生或抗氧剂酶活性降低造成细胞中的DNA或蛋白质或脂质受损，引起广泛的细胞损伤并导致细胞死亡[39]。许多农药引发的神经毒性也被证明与氧化应激相关联，Zhao等[37]的试验显示拟除虫菊酯类农药氯氰菊酯暴露使草鱼出现移动缓慢、平衡力下降的神经损伤现象，并伴随着ROS含量升高。另外，除草剂百草枯和杀菌剂代森锰可通过诱导氧化应激引起大鼠神经干细胞增殖[40]；有机磷农药引起的多巴胺能神经元细胞死亡也与过量产生的ROS以及后续的氧化应激诱导信号传导途径激活的细胞凋亡有关[41]。
本研究结果显示，多菌灵和苯醚甲环唑单独和联合暴露均能促进SK-N-SH细胞内ROS产生，在复合暴露条件下，当混合物中2种农药浓度配比不同时，其对SK-N-SH细胞内ROS产生的联合作用模式表现不同，即苯醚甲环唑在试验低剂量(IC10，16.88 μmol·L-1)时和多菌灵表现出拮抗作用，在试验高剂量(IC20，22.08 μmol·L-1)时和多菌灵表现出协同作用。这一结果可能由于苯醚甲环唑和多菌灵在低剂量时诱导抗氧化酶代偿性增加，在高剂量时抑制抗氧化酶的表达，因此在不同浓度配比时，对ROS蓄积表现出不同的联合作用模式。如Jiang等[29]的研究表明，斑马鱼幼鱼暴露于4 μg·L-1多菌灵后过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶mRNA表达上升；而暴露于100 μg·L-1多菌灵则导致过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶mRNA表达下降。同样地，Mu等[42]在0.01 mg·L-1苯醚甲环唑处理组观察到斑马鱼胚胎过氧化氢酶活性增加，在1.0 mg·L-1处理组中观察到过氧化氢酶活性受到显著抑制。
本研究显示多菌灵和苯醚甲环唑对神经细胞具有毒性作用，二者联合染毒能降低SK-N-SH细胞活力，联合效应模式与混合物效应水平有关；同时，二者单独或联合处理均使SK-N-SH细胞形态发生改变，产生细胞损伤。此外，多菌灵和苯醚甲环唑处理均提高了SK-N-SH细胞内ROS水平，联合作用模式与二者浓度配比有关，这表明多菌灵和苯醚甲环唑单独和联合作用引起的神经毒性可能与氧化应激机制相关。前人研究显示，ROS产生过量会激活细胞凋亡途径[37, 41]，导致促凋亡蛋白(如Caspase-3等)表达升高和抗凋亡蛋白(如Bcl-2蛋白)表达降低[43]。因此，后续应进一步研究ROS过量生成导致的细胞凋亡途径是否在多菌灵和苯醚甲环唑的联合神经毒性中发挥作用，以更深层次地探究二者联合作用机制，为农药长期低剂量混合暴露风险评估提供试验依据。
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