自20世纪人类首次合成塑料以来，其广泛使用在给我们生活带来便利的同时，也带来了严峻的环境问题，这其中就包括微塑料污染。微塑料指的是粒径<5 mm的塑料颗粒和碎片[1-2]，绝大部分来源于环境中大的塑料垃圾的物理、化学以及生物的降解[3-4]。纳米聚苯乙烯(nanopolystyrene, nanoPS)，作为一种常见的微塑料，广泛应用于日常生产生活中，比如作为添加剂加入到日常洗护用品中或作为药物载体等[5]。因为其使用广泛且难以降解，nanoPS可能会通过食物链富集到人体中，对人类的健康构成威胁[6-7]。
有研究指出微塑料暴露会造成生物体生长发育的抑制、子代数的减少、运动能力的减弱以及氧化损伤等[8-9]。此外，其也会对生物体的代谢产生干扰。比如，高浓度nanoPS急性暴露会导致秀丽线虫体内葡萄糖含量显著降低[10]。0.5 μm或1.0 μm聚苯乙烯微塑料短暂暴露线虫5～10 min后，会导致线虫咽部抽动速率显著升高[11]。50 nm或100 nm聚苯乙烯微塑料暴露线虫72 h后，会导致线虫摆头频率和身体弯曲速率显著降低[12]。斑马鱼体内能量、糖脂以及氨基酸代谢在高浓度nanoPS暴露后也都受到了不同程度的影响[13]。然而，目前环境中微塑料的总体浓度还比较低(≤1 μg·L-1)[14]，因此低浓度长期暴露可能更接近于真实情况，值得更多的关注。
糖代谢是自然界最基本的代谢过程之一，具体可分为合成代谢和分解代谢[15]。合成代谢主要负责储存能量以及合成一些抗逆物质比如海藻糖[16-17]，而分解代谢主要负责为正常生命活动比如运动提供能量[18-19]。虽然目前已有一些研究表明微塑料会对生物体的糖代谢产生影响，但结果还存在一些不一致的地方。比如，微塑料暴露15 d后罗非鱼体内葡萄糖含量显著升高；但在成年斑马鱼体内，聚苯乙烯微塑料暴露21 d后葡萄糖含量却显著降低[20-21]。此外，微塑料对生物体内糖原、海藻糖以及其他一些二糖及多糖合成的影响目前还没有看到相关报道。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，由于具有培养成本低、生命周期短、存活率高、对环境污染物敏感等特点，是最常用来研究污染物长期暴露对生命活动影响的模式生物之一[22]。此外，线虫也是土壤生态系统的重要组成部分，尤其是在农田土壤中，线虫在维护农业生态中起重要作用。塑料大棚及地膜的使用造成土壤微塑料污染，对土壤微生态可能存在一定的不利影响。所以，线虫也可用来评价微塑料的生态毒性[23]。
本研究旨在从合成代谢和分解代谢的角度综合研判nanoPS液体连续暴露对秀丽线虫葡萄糖代谢的影响，并进一步探究相关机制。实验中通过使用相应试剂盒检测了nanoPS液体连续暴露后线虫体内与葡萄糖代谢密切相关的代谢物质含量，包括葡萄糖、糖原、海藻糖、丙酮酸、ATP以及柠檬酸，并通过荧光定量PCR测定了一些糖原和海藻糖合成、糖酵解以及三羧酸循环过程中一些关键基因的表达。此外，还通过使用转入了GFP质粒的大肠杆菌喂食线虫测定了nanoPS液体连续暴露后线虫的摄食情况，从食物摄入的角度解释了nanoPS液体连续暴露后线虫体内葡萄糖含量变化的原因。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 实验材料
本研究只用到了一种线虫品系，即野生型N2，购买自线虫遗传中心(CGC)。实验中所用到的2种nanoPS(普通和绿色荧光nanoPS)均购自天津倍思乐色谱技术开发中心(苯乙烯占比在95%以上)。
1.2 nanoPS的表征
普通nanoPS用来研究其长期暴露对线虫的毒性效应，包括对线虫运动能力以及葡萄糖代谢的影响；而绿色荧光nanoPS用来研究线虫对其的摄入、排出及其在线虫体内的分布，没有进行任何毒性效应的研究。
通过透射电镜(JEM-2010，JEOL)观察nanoPS的形貌并测量真实粒径。具体操作步骤如下：首先用S medium缓冲液(液体暴露所用缓冲液)将nanoPS母液稀释至5 mg·L-1，再超声20 min，使其分散均匀。然后吸取10 μL分散好的样品准确滴到电镜专用铜网上，并用吸水纸擦去多余的水分。待铜网上的样品完全干燥后，进行电镜拍照。
通过拉曼光谱仪(XploRA INV，HORIBA)检测nanoPS的物质组成。具体操作步骤如下：首先用超纯水将nanoPS母液稀释至5 mg·L-1，再超声20 min，使其分散均匀。然后吸取5 μL分散好的nanoPS液体加入到样品池中，并关掉房间内所有灯光。调整设备参数，同时移动探测器使之与样品保持合适的距离，一切准备就绪后开始进行拉曼光谱的扫描。
通过动态光散射仪(Zetasizer Nano ZSE，Malvern Instruments)检测nanoPS的水合粒径。具体操作步骤如下：首先设定仪器参数，然后准确吸取1 mL暴露前后100 μg·L-1处理组液体(对于暴露后的液体，先静置2～3 min，待线虫自然沉降后再吸取)加入到比色皿中并立即进行水合粒径的测定。
1.3 线虫的培养及nanoPS暴露
本研究中，所有线虫均避光培养于20 ℃恒温箱中，以大肠杆菌OP50为食。同步化后，将1 000条左右L1期幼虫暴露于含有不同浓度nanoPS以及80 μL浓缩大肠杆菌的S medium缓冲液中(暴露体系总体积为8 mL)，并放置于110 r·min-1、20 ℃的恒温摇床中持续暴露4 d或5 d(本实验中，液体连续暴露指的是从刚孵化的L1期幼虫开始持续暴露至刚开始产卵的成虫期，覆盖了线虫生长发育的主要阶段，一共暴露5 d。至于测定液体暴露4 d后的结果主要是为了对液体暴露5 d的结果进行一个补充和验证)。基于已有的研究结果和微塑料的环境浓度(≤1 μg·L-1)，同时由于本研究需要进行机制的探究，所以实验中选择的nanoPS浓度梯度为0、1、10和100 μg·L-1。
1.4 生物学终点检测
不同浓度nanoPS液体暴露5 d后，收集暴露完的线虫，M9缓冲液清洗3遍后，用于后续身体弯曲、排便周期、摆头以及咽部抽动等生物学终点的检测。关于身体弯曲频率的测定，首先将线虫转移至无菌的NGM板上恢复1 min，再通过显微镜直接计数20 s内线虫身体弯曲的次数。关于排便周期的测定，首先让线虫在提前接种了OP50的NGM板上爬行30 min，再通过显微镜直接计数线虫尾部肠道肌肉连续2次收缩的时间间隔。关于摆头频率的测定，先将线虫挑至滴有M9的NGM板上恢复1 min，再通过显微镜直接计数1 min内线虫头部摆动的次数。关于咽部抽动速率的测定，先将线虫转移至提前接种了OP50的NGM板上爬行30 min，再通过显微镜直接计数20 s内线虫咽部抽动的次数。所有生物学终点的检测每组均测定20条以上线虫。
1.5 食物摄入测定
不同浓度nanoPS液体暴露4 d或5 d后，取100条左右的线虫重新暴露于含有相同浓度梯度nanoPS以及足量转入了GFP质粒大肠杆菌的S medium缓冲液中1 h。暴露结束，M9缓冲液清洗3遍后，立即使用荧光显微镜拍照。最后，通过Image J这一软件统计照片中线虫身体的平均荧光强度。每组统计20条以上线虫。
1.6 微塑料摄入测定
不同浓度绿色荧光nanoPS (0、1、10和100 μg·L-1)液体暴露4 d或5 d后，收集暴露完的线虫，立即使用荧光显微镜拍照。最后，通过Image J这一软件统计照片中线虫身体的平均荧光强度。每组统计20条以上线虫。
1.7 微塑料在线虫体内的分布及恢复后的排出
先将L1期幼虫在NGM板上培养至L4期，再将L4期线虫暴露于含有10 mg·L-1绿色荧光nanoPS以及20 μL浓缩大肠杆菌的S medium缓冲液中24 h(选择暴露24 h是因为10 mg·L-1绿色荧光nanoPS暴露4 d或5 d后，线虫体内均未见明显的荧光聚集)。收集暴露完的线虫，M9清洗3遍后，立即使用荧光显微镜拍照。同时，选取100条左右的线虫转入到新的NGM板上恢复12 h。收集恢复完的线虫，M9清洗3遍后，立即使用荧光显微镜拍照。最后，通过Image J这一软件统计照片中线虫身体的平均荧光强度，并观察荧光在线虫体内的分布。每组统计20条以上线虫。
1.8 代谢物质含量测定
本研究中所有与葡萄糖代谢密切相关的代谢物质含量测定均按照相应试剂盒说明书进行。其中，测定线虫体内总蛋白含量所用试剂盒购自美国赛默飞公司；测定葡萄糖含量所用试剂盒购自上海荣盛公司；测定海藻糖、糖原、柠檬酸以及丙酮酸含量所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所；测定ATP含量所用试剂盒购自碧云天公司。ATP和柠檬酸含量由于前期预实验的结果与预期相差较大，测定的是nanoPS液体暴露4 d和5 d后线虫体内的含量；而其他代谢物质均测定的是nanoPS液体暴露5 d后线虫体内的含量。
1.9 糖原活体染色
为了直观地看到nanoPS液体连续暴露后线虫体内糖原含量的变化，可以通过碘对线虫体内的糖原进行活体染色。收集液体暴露5 d后的线虫，M9清洗3遍后，吸取100条左右的线虫滴到铺有琼脂的载玻片上，并将其倒扣在盛碘的玻璃瓶口上。通风橱中染色2 min后，立即在显微镜底下拍照。线虫体内糖原含量越高，染色后身体颜色也越深。
1.10 实时荧光定量PCR
收集1 000条左右nanoPS液体暴露5 d后的线虫，M9清洗3遍后，使用Trizol裂解线虫并提取总RNA。浓度标定后，立即使用相应试剂盒反转成cDNA并进行后续的荧光定量。本研究中RNA反转以及荧光定量PCR所用试剂盒均购自北京全式金公司，使用的内参基因是act-1，具体的引物序列如表1所示。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
基因Gene引物序列(5’～3’)Primer sequences (5’～3’)act-15’ CTCTTGCCCCATCAACCATG 3’5’ CTTGCTTGGAGATCCACATC 3’tps-15’ CTTTGCAATTAACGCCGCAC 3’5’ TATCGATCCAGACGAGAGTC 3’tps-25’ ACTCACAGGGATCGTACAAA 3’5’ ACCTCTTATAGGCCTGAAGC 3’gob-15’ TACGCTAGAGGAAATGAATGAC 3’5’ ATGCCAAATGTGGTTCCTC 3’gsy-15’ GTCTCTTCGTCGAACATCTC 3’5’ ACAGATGACAGGAATTCTGGA 3’gpd-25’ CTCCATCGACTACATGGTCTACTTG 3’5’ AGCTGGGTCTCTTGAGTTGTAGAC 3’pyk-15’ CAAAGAAGCCGAAGCAGCAG 3’5’ AGATGTGGCAGCGATAGCAA 3’pyk-25’ ATGTGCAACCCAGATGCTCG 3’5’ CCATCCAAGACAGCGTTTGC 3’pfk-1.15’ TATGGTCCGTGTGCCACTTC 3’5’ TCTCTGGAAACTGCGTCCAC 3’aco-25’ TGGGATCGTCAGGATGTGAA 3’5’ ACGTCCGGAGATGGCCATA 3’cts-15’ CTCGACAACTTCCCAGATAACC 3’5’ GGTACAGGTTGCGATAGATGATAGC 3’idha-15’ GCTTATGCACGCGAACAAAG 3’5’ AATCTCGTGCTCAATTCCAG 3’
1.11 数据统计分析
所有实验结果均重复3次以上，数据处理与分析使用的是Prism 8。所有数据均表示为平均值±标准误(Means±SEM)，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)来统计组间差异。P<0.05、P<0.01表示差异显著。
2 结果(Results)
2.1 nanoPS的理化性质
透射电镜的结果表明，这2种nanoPS均呈较为规则的球形，且在S medium缓冲液中分散均匀，无明显聚集(图1(a)和(b))。粒径统计结果显示，普通和绿色荧光nanoPS的真实粒径分别为(88.2±4.9) nm和(68.3±2.6) nm(图1(c))，均<100 nm，属于纳米级聚苯乙烯微塑料。拉曼谱图结果表明，这2种微塑料均含有3个基本完全一致的特征峰(图2)，且这些特征峰均对应于聚苯乙烯标品的特征峰，证明这2种微塑料的物质组成确实就是聚苯乙烯。在这其中，1 001.2 cm-1处的峰对应的是苯环的呼吸振动；而1 638.33 cm-1和1 634.39 cm-1处的峰对应的是苯环中碳原子的不对称拉伸振动[24-25]。此外，水合粒径结果显示，连续暴露5 d后，100 μg·L-1处理组液体中微塑料的水合粒径相较于暴露前只是稍有增大(暴露前后纳米聚苯乙烯的水合粒径分别为(129.0±1.6) nm和(159.1±2.5) nm)(图3)，但增加的部分明显小于1个或更多纳米聚苯乙烯的尺寸。水合粒径的略微增加更多可能是纳米聚苯乙烯材料表面吸附或结合了蛋白质等生物大分子所导致。因此，在液体连续暴露的这5 d时间内纳米聚苯乙烯微塑料没有发生明显的团聚或沉淀现象。
图1 纳米聚苯乙烯(nanoPS)的形貌和粒径
注：(a)普通nanoPS的形貌；(b)绿色荧光nanoPS的形貌；(c)2种nanoPS的粒径统计。
Fig. 1 Morphology and particle size of nanopolystyrene (nanoPS)
Note: (a) The morphology of virgin nanoPS; (b) The morphology of green fluorescent nanoPS; (c) Particle size of these two nanoPS.
图2 nanoPS的物质组成
注：(a)普通nanoPS的拉曼谱图；(b)绿色荧光nanoPS的拉曼谱图。
Fig. 2 Material composition of nanoPS
Note: (a) The Raman spectroscopy of virgin nanoPS; (b) The Raman spectroscopy of green fluorescent nanoPS.
图3 nanoPS的水合粒径
注：(a)暴露前100 μg·L-1处理组液体中nanoPS的水合粒径；(b)暴露5 d后100 μg·L-1处理组液体中nanoPS的水合粒径。
Fig. 3 Hydrated particle sizes of nanoPS
Note: (a) Hydrated particle size of nanoPS in 100 μg·L-1 treatment group before exposure; (b) Hydrated particle size of nanoPS in 100 μg·L-1 treatment group after 5 d exposure.
2.2 nanoPS暴露对线虫运动能力的影响
液体暴露5 d后，与对照组相比，100 μg·L-1处理组线虫身体弯曲频率显著降低、排便周期显著延长(图4(a)和(b))。此外，10 μg·L-1和100 μg·L-1处理组线虫摆头频率和咽部抽动速率均显著降低(图4(c)和(d))。上述结果表明，nanoPS液体连续暴露后，线虫运动能力受损，活力变差。此外，咽部抽动速率与线虫的摄食能力密切相关，咽部抽动速率降低表明暴露后线虫摄食也受到了一定的影响；而排便周期的延长表明线虫清除体内代谢废物及污染物的能力减弱。
图4 nanoPS暴露对线虫运动能力的影响
注：(a)液体暴露5 d后线虫的身体弯曲频率；(b)液体暴露5 d后线虫的排便周期；(c)液体暴露5 d后线虫的头部摆动频率；(d)液体暴露5 d后线虫的咽部抽动速率；与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Fig. 4 Effects of exposure to nanoPS on the locomotion behaviors of nematodes
Note: (a) Body bends after 5 d liquid exposure; (b) Defecation cycle after 5 d liquid exposure; (c) Head thrashes after 5 d liquid exposure; (d) Pharyngeal pumping rates after 5 d liquid exposure; comparing with the control group, *P<0.05, **P<0.01.
2.3 nanoPS暴露对线虫摄食的影响
液体暴露5 d后，线虫咽部抽动速率降低，表明其主动摄食能力减弱。为了直观地看到暴露后线虫的摄食情况，使用转入了GFP质粒的大肠杆菌OP50喂食线虫。液体暴露4 d后，只有最高浓度(100 μg·L-1)处理组线虫体内的平均荧光强度显著减弱(减弱了17.0%，P<0.01)(图5(a))，表明只有该处理组线虫的摄食显著减少。液体暴露5 d后，除了最高浓度处理组，10 μg·L-1处理组线虫体内平均荧光强度也显著减弱(图5(b))，表明这2个处理组线虫的摄食均显著减少。且由图5(b)可知，微塑料的浓度越高，食物摄入减少的幅度越大。
图5 nanoPS暴露对线虫摄食的影响
注：(a)液体暴露4 d后线虫摄食情况；(b)液体暴露5 d后线虫摄食情况；与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Fig. 5 Effects of exposure to nanoPS on food intake of nematodes
Note: (a) Nematode’s food intake after 4 d liquid exposure; (b) Nematode’s food intake after 5 d liquid exposure; comparing with the control group, *P<0.05, **P<0.01.
2.4 nanoPS的摄入、排出及其在线虫体内的分布
nanoPS液体连续暴露后，线虫的运动能力和摄食均受到了显著的不利影响，表明在暴露的过程中应该有微塑料颗粒进入到了线虫体内并对线虫造成了一定的毒害。为了探究液体连续暴露过程中线虫对nanoPS的摄入，使用绿色荧光nanoPS液体暴露线虫4 d或5 d。液体暴露4 d后，线虫体内未见明显的微塑料积累；液体暴露5 d后，10 μg·L-1和100 μg·L-1处理组线虫身体的平均荧光强度均显著高于对照组(分别升高了14.0%和18.5%，P值均<0.01)(图6(a))，表明线虫确实摄入了一定量的nanoPS。此外，由图6(a)可知，露5 d后对照组线虫身体的平均荧光强度明显高于液体暴露4 d后的对照组，这主要是因为随着线虫的生长发育，其体内的自发荧光也不断增强[26]。
为了观察微塑料在线虫体内的分布及恢复后的排出，使用高浓度(10 mg·L-1)绿色荧光nanoPS急性暴露线虫24 h。结果如图6(b)，线虫不仅摄入了大量微塑料，且微塑料在线虫体内主要分布在肠道的尾部。此外，急性暴露完的线虫短暂恢复12 h后，对照组和实验组线虫身体的平均荧光强度又回到了同一水平(图6(b))，表明短暂恢复后线虫可以将其体内摄入的微塑料排出。
图6 nanoPS的摄入、排出及其在线虫体内的分布
注：(a)低浓度连续暴露后线虫对nanoPS的摄入；(b)高浓度急性暴露后线虫对nanoPS的摄入及恢复后的排出；与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Fig. 6 Ingestion, excretion of nanoPS and its distribution in nematodes
Note: (a) Ingestion of nanoPS by nematodes after low-dose and consecutive exposure; (b) Ingestion of nanoPS by nematodes after high-dose and acute exposure and the excretion of nanoPS after recovery; comparing with the control group, *P<0.05, **P<0.01.
2.5 nanoPS暴露对线虫体内糖原和海藻糖合成的影响
前面的结果表明nanoPS液体连续暴露后线虫摄食减少，而生物体食物摄入多少与其体内的代谢状态密切相关，因此暴露后线虫体内的代谢过程包括葡萄糖代谢应该也受到了一定的影响。nanoPS液体暴露5 d后，最高浓度(100 μg·L-1)处理组线虫体内葡萄糖含量降低了21.8% (P<0.05)(图7(a))，而糖原含量升高了2.5倍(P<0.01)(图7(b))。同时，碘染糖原的结果也表明，暴露后100 μg·L-1处理组线虫身体的颜色明显深于对照组(图8)，表明其体内糖原含量明显高于对照组。此外，糖原合成的关键基因gsy-1的表达在暴露后也显著上调(图7(d))。综上所述，nanoPS液体连续暴露后线虫体内葡萄糖代谢确实受到了一定的影响，由葡萄糖合成糖原的代谢过程增强。
图7 nanoPS暴露对线虫体内葡萄糖合成代谢的影响
注：(a)液体暴露5 d后线虫体内葡萄糖含量；(b)液体暴露5 d后线虫体内糖原含量；(c)液体暴露5 d后线虫体内海藻糖含量；(d)液体暴露5 d后线虫体内与糖原和海藻糖合成相关基因的表达；与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Fig. 7 Effects of exposure to nanoPS on glucose anabolism in nematodes
Note: (a) Glucose content of nematodes after 5 d liquid exposure; (b) Glycogen content of nematodes after 5 d liquid exposure; (c) Trehalose content of nematodes after 5 d liquid exposure; (d) Expression of genes related to glycogen and trehalose synthesis in nematodes after 5 d liquid exposure; comparing with the control group, *P<0.05, **P<0.01.
图8 nanoPS液体暴露5 d后碘染糖原结果
Fig. 8 Iodine staining for glycogen after 5 d liquid exposure to nanoPS
而海藻糖含量在暴露后呈剂量依赖降低，虽然变化不显著(图7(c))。同时，海藻糖合成的关键基因tps-1、tps-2以及gob-1的表达也都显著下调(图7(d))，表明nanoPS液体连续暴露后线虫体内由葡萄糖合成海藻糖的代谢过程减弱，只是受影响程度较轻。
2.6 nanoPS暴露对线虫体内糖酵解过程的影响
除了糖原和海藻糖合成，nanoPS液体持续暴露对线虫体内葡萄糖分解代谢包括糖酵解和三羧酸循环是否也产生了一定的影响，值得进一步验证。nanoPS液体暴露5 d后，与对照组相比，100 μg·L-1处理组线虫体内丙酮酸含量降低了55.3% (P<0.05)(图9(a))。同时，一些糖酵解过程关键基因包括gpd-2、pyk-1、pyk-2和pfk-1.1的表达也都显著下调(图9(b))。在这其中，pyk-1和pyk-2负责丙酮酸的合成。上述结果表明，nanoPS液体持续暴露后线虫体内糖酵解过程减弱，丙酮酸产生量降低。
图9 nanoPS暴露对线虫体内糖酵解的影响
注：(a)液体暴露5 d后线虫体内丙酮酸含量；(b)液体暴露5 d后线虫体内与糖酵解相关基因的表达；与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Fig. 9 Effects of exposure to nanoPS on glycolysis in nematodes
Note: (a) Pyruvate content of nematodes after 5 d liquid exposure; (b) Expression of genes related to glycolysis in nematodes after 5 d liquid exposure; comparing with the control group, *P<0.05, **P<0.01.
2.7 nanoPS暴露对线虫体内三羧酸循环的影响
至于三羧酸循环，nanoPS液体暴露4 d或5 d，最高浓度(100 μg·L-1)处理组线虫体内柠檬酸含量均显著升高(分别升高了45.0%和85.9%，P值均<0.05)(图10(a))。液体暴露4 d后，ATP含量呈剂量依赖升高，但变化不显著；液体暴露5 d后，除了最低浓度(1 μg·L-1)处理组，其他处理组线虫体内ATP含量均显著升高(图10(b))。此外，一些三羧酸循环关键基因包括aco-2、idha-1和cts-1的表达在暴露后也都显著增强(图10(c))。在这其中，aco-2编码的是顺乌头酸酶，负责催化柠檬酸转变为异柠檬酸；idha-1编码的是异柠檬酸脱氢酶，负责催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸；而cts-1编码的是柠檬酸合酶，负责催化乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸。上述结果表明，nanoPS液体持续暴露后线虫体内三羧酸循环过程增强。
图10 nanoPS暴露对线虫体内三羧酸循环的影响
注：(a)液体暴露4 d或5 d后线虫体内柠檬酸含量；(b)液体暴露4 d或5 d后线虫体内ATP含量；(c)液体暴露5 d后线虫体内与三羧酸循环相关基因的表达；与对照组相比，* P<0.05，**P<0.01。
Fig. 10 Effects of exposure to nanoPS on TCA cycle in nematodes
Note: (a) Citric acid content of nematodes after 4 d or 5 d liquid exposure; (b) ATP content of nematodes after 4 d or 5 d liquid exposure; (c) Expression of genes related to TCA cycle in nematodes after 5 d liquid exposure; comparing with the control group, *P<0.05, **P<0.01.
3 讨论(Discussion)
随着全球越来越多的地区包括南北极都检测出了微塑料的存在，其已成为当下最受关注的环境污染物之一。虽然目前环境中微塑料的浓度还不是很高，但随着大量塑料垃圾源源不断地降解，微塑料浓度在未来相当长一段时间内还将持续增加。已有的一些结果表明，微塑料暴露会造成生物体代谢的紊乱，包括氨基酸、胆汁酸以及能量代谢等[10, 27]。本研究主要关注的是贴近于环境浓度的nanoPS液体连续暴露对线虫体内葡萄糖代谢的影响，结果发现不论是合成代谢，还是分解代谢，在暴露后均受到了不同程度的影响。
已有的研究结果表明微塑料可以被多种生物摄入，并在其体内的不同器官发生富集。例如，聚苯乙烯微塑料可以被斑马鱼摄入并长期存在于鳃、肝脏以及肠道中[28]。青鳉可以摄入多种不同粒径的nanoPS并通过血液循环转移至多个器官[29]。然而，这些被生物体摄入的微塑料能否被及时排出，却很少有人关注。本研究结果表明线虫不仅可以摄入nanoPS，并且短暂恢复(12 h)后可以将其排出。
很多研究都指出微塑料暴露会对生物体的摄食产生一定的影响。比如，牡蛎会摄入更多的微藻以补偿其在暴露后由于消化系统受损而导致的能量摄入减少[30]。聚苯乙烯微塑料暴露会降低黑鲪对于水箱中食物的敏感性[31]。本研究中，我们也发现，nanoPS液体连续暴露后，线虫的食物摄入显著减少。生物体的摄食情况与其体内的代谢状态密切相关，由于暴露后线虫摄食减少，其体内的代谢过程包括糖代谢应该也受到了一定的影响。海藻糖，作为一种重要的抗逆物质，nanoPS液体连续暴露后其含量呈降低趋势。相反，糖原含量却在暴露后显著升高，同时糖原合成关键基因的表达也明显上调，表明暴露后线虫体内由葡萄糖合成糖原的代谢过程增强。虽然在大多数情况下，糖原只是作为一种动物多糖储备能量，但在一些特定的环境中，糖原也能发挥一定的抗逆作用。比如，在高糖摄入的情况下，糖原可以提高线虫的抗氧化能力[32]。除此之外，在缺氧以及高渗的环境中，线虫也倾向于储存更多的糖原[33]。综上所述，应该是糖原，而非海藻糖，在线虫应对nanoPS液体连续暴露引发的毒性效应过程中发挥着重要作用。
除了葡萄糖合成代谢，微塑料也会对生物体内糖酵解以及三羧酸循环产生影响。比如，聚苯乙烯微塑料暴露会导致斑马鱼肝脏中能量代谢受抑制以及ATP含量降低[28]。此外，不论是成年斑马鱼，还是幼年斑马鱼，其体内一些与糖酵解相关基因的表达在暴露后也都显著下调[13, 21]。本研究结果也表明，nanoPS液体连续暴露后，线虫体内糖酵解过程减弱，这与上述结果一致。然而，暴露后，线虫体内柠檬酸以及ATP含量却显著升高，意味着三羧酸循环过程增强。柠檬酸有利于线虫抵抗重金属诱导的氧化损伤[34]，因此其含量的升高可能与线虫应对微塑料暴露导致的氧化损伤有关。而暴露后线虫运动能力减弱(图4)，ATP消耗量减少，这应该是ATP含量升高的一个重要原因。在糖酵解过程减弱、丙酮酸含量降低的情况下，线虫体内三羧酸循环却增强，表明进入到三羧酸循环的氨基酸或脂质代谢产物可能有所增加，从而进行一定的补充。
综上所述，nanoPS液体连续暴露后，线虫体内确实摄入了一定量的微塑料，并对线虫造成了一系列的不利影响，包括运动能力的下降、摄食的减少以及葡萄糖含量的降低。此外，线虫体内一些与葡萄糖密切相关的代谢过程包括糖原和海藻糖的合成、糖酵解以及三羧酸循环均受到了不同程度的影响。本研究结果首次从合成代谢和分解代谢的角度较为全面地评估了微塑料液体连续暴露对生物体糖代谢的影响，并部分揭示了相关的机制，也为后续的研究提供了一个新的思路和方向。
[1] Thompson R C, Olsen Y, Mitchell R P, et al. Lost at sea: Where is all the plastic? [J]. Science, 2004, 304(5672): 838
[2] Wright S L, Kelly F J. Plastic and human health: A micro issue? [J]. Environmental Science & Technology, 2017, 51(12): 6634-6647
[3] Rillig M C. Microplastic in terrestrial ecosystems and the soil? [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(12): 6453-6454
[4] Andrady A L. Microplastics in the marine environment [J]. Marine Pollution Bulletin, 2011, 62(8): 1596-1605
[5] Hanna S K, Montoro Bustos A R, Peterson A W, et al. Agglomeration of Escherichia coli with positively charged nanoparticles can lead to artifacts in a standard Caenorhabditis elegans toxicity assay [J]. Environmental Science & Technology, 2018, 52(10): 5968-5978
[6] Kim H M, Lee D K, Long N P, et al. Uptake of nanopolystyrene particles induces distinct metabolic profiles and toxic effects in Caenorhabditis elegans [J]. Environmental Pollution, 2019, 246: 578-586
[7] Setälä O, Fleming-Lehtinen V, Lehtiniemi M. Ingestion and transfer of microplastics in the planktonic food web [J]. Environmental Pollution, 2014, 185: 77-83
[8] Farrell P, Nelson K. Trophic level transfer of microplastic: Mytilus edulis (L.) to Carcinus maenas (L.) [J]. Environmental Pollution, 2013, 177: 1-3
[9] Chen Q Q, Gundlach M, Yang S Y, et al. Quantitative investigation of the mechanisms of microplastics and nanoplastics toward zebrafish larvae locomotor activity [J]. Science of the Total Environment, 2017, 584-585: 1022-1031
[10] Gambardella C, Morgana S, Ferrando S, et al. Effects of polystyrene microbeads in marine planktonic crustaceans [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2017, 145: 250-257
[11] Fueser H, Mueller M T, Traunspurger W. Rapid ingestion and egestion of spherical microplastics by bacteria-feeding nematodes [J]. Chemosphere, 2020, 261: 128162
[12] Liu Q Y, Chen C X, Li M T, et al. Neurodevelopmental toxicity of polystyrene nanoplastics in Caenorhabditis elegans and the regulating effect of presenilin [J]. ACS Omega, 2020, 5(51): 33170-33177
[13] Wan Z Q, Wang C Y, Zhou J J, et al. Effects of polystyrene microplastics on the composition of the microbiome and metabolism in larval zebrafish [J]. Chemosphere, 2019, 217: 646-658
[14] Al-Sid-Cheikh M, Rowland S J, Stevenson K, et al. Uptake, whole-body distribution, and depuration of nanoplastics by the scallop Pecten maximus at environmentally realistic concentrations [J]. Environmental Science & Technology, 2018, 52(24): 14480-14486
[15] Watts J L, Ristow M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans [J]. Genetics, 2017, 207(2): 413-446
[16] Holt S J, Riddle D L. SAGE surveys C. elegans carbohydrate metabolism: Evidence for an anaerobic shift in the long-lived dauer larva [J]. Mechanisms of Ageing and Development, 2003, 124(7): 779-800
[17] Depuydt G, Xie F, Petyuk V A, et al. LC-MS proteomics analysis of the insulin/IGF-1-deficient Caenorhabditis elegans daf-2(E1370) mutant reveals extensive restructuring of intermediary metabolism [J]. Journal of Proteome Research, 2014, 13(4): 1938-1956
[18] Krabbendam I E, Honrath B, Dilberger B, et al. SK channel-mediated metabolic escape to glycolysis inhibits ferroptosis and supports stress resistance in C. elegans [J]. Cell Death & Disease, 2020, 11(4): 263
[19] Gebauer J, Gentsch C, Mansfeld J, et al. A genome-scale database and reconstruction of Caenorhabditis elegans metabolism [J]. Cell Systems, 2016, 2(5): 312-322
[20] Hamed M, Soliman H A M, Osman A G M, et al. Assessment the effect of exposure to microplastics in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) early juvenile: Ⅰ. blood biomarkers [J]. Chemosphere, 2019, 228: 345-350
[21] Zhao Y, Bao Z W, Wan Z Q, et al. Polystyrene microplastic exposure disturbs hepatic glycolipid metabolism at the physiological, biochemical, and transcriptomic levels in adult zebrafish [J]. Science of the Total Environment, 2020, 710: 136279
[22] Leung M C, Williams P L, Benedetto A, et al. Caenorhabditis elegans: An emerging model in biomedical and environmental toxicology [J]. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology, 2008, 106(1): 5-28
[23] Lee S, Kim Y, Choi J. Effect of soil microbial feeding on gut microbiome and cadmium toxicity in Caenorhabditis elegans [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020, 187: 109777
[24] Yang Y H, Shao H M, Wu Q L, et al. Lipid metabolic response to polystyrene particles in nematode Caenorhabditis elegans [J]. Environmental Pollution, 2020, 256: 113439
[25] Xiao T T, Cai C Z, Peng L P, et al. Fabrication and characteristics of self-assembly nano-polystyrene films by laser induced CVD [J]. Applied Surface Science, 2013, 282: 652-655
[26] Shyu Y J, Hiatt S M, Duren H M, et al. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis [J]. Nature Protocols, 2008, 3(4): 588-596
[27] Jin Y X, Lu L, Tu W Q, et al. Impacts of polystyrene microplastic on the gut barrier, microbiota and metabolism of mice [J]. The Science of the Total Environment, 2019, 649: 308-317
[28] Lu Y F, Zhang Y, Deng Y F, et al. Uptake and accumulation of polystyrene microplastics in zebrafish (Danio rerio) and toxic effects in liver [J]. Environmental Science & Technology, 2016, 50(7): 4054-4060
[29] Kashiwada S. Distribution of nanoparticles in the see-through medaka (Oryzias latipes) [J]. Environmental Health Perspectives, 2006, 114(11): 1697-1702
[30] Sussarellu R, Suquet M, Thomas Y, et al. Oyster reproduction is affected by exposure to polystyrene microplastics [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(9): 2430-2435
[31] Yin L Y, Chen B J, Xia B, et al. Polystyrene microplastics alter the behavior, energy reserve and nutritional composition of marine jacopever (Sebastes schlegelii) [J]. Journal of Hazardous Materials, 2018, 360: 97-105
[32] Gusarov I, Pani B, Gautier L, et al. Glycogen controls Caenorhabditis elegans lifespan and resistance to oxidative stress [J]. Nature Communications, 2017, 8: 15868
[33] Frazier H N Ⅲ, Roth M B. Adaptive sugar provisioning controls survival of C. elegans embryos in adverse environments [J]. Current Biology, 2009, 19(10): 859-863
[34] Song S J, Han Y, Zhang Y, et al. Protective role of citric acid against oxidative stress induced by heavy metals in Caenorhabditis elegans [J]. Environmental Science and Pollution Research International, 2019, 26(36): 36820-36831