Agilent 7900型电感耦合等离子体质谱仪、Agilent 1260型高效液相色谱仪、LabTech EH20A plus 微控数显电热板、MileStone ETHOS A微波消解系统、THERMO GENPURE纯水机、日本Nikon TS100倒置显微镜、德国Innova CO-170 CO₂培养箱、高速离心机、水浴温控摇床、漩涡振荡仪等.

Se（Ⅵ）[GBW 10033, （41.5±1.3） μg∙g⁻¹]、Se（Ⅳ）[GBW 10032, （42.9±0.9） μg∙g⁻¹]、SeCys₂[GBW 10087, （44.2±1.0） μg∙g⁻¹]、MeSeCys[GBW 10088, （34.8±1.0） μg∙g⁻¹]、 SeMet[GBW 10034, （39.4±1.0） μg∙g⁻¹]、Se[GBW（E）080215, 100 μg∙mL⁻¹]标准溶液（均以Se计），均购自中国计量科学研究院；SeEt标准品的纯度为98%，购自加拿大TRC公司；蛋白酶XIV（P5147-1G）、脂肪酶（L3126-25G）、蛋白酶K（P6556-100MG）购自日本Sigma公司； 木瓜蛋白酶（P164463）、胃蛋白酶（P128678）购自北京百灵威科技有限公司； 柠檬酸、己烷磺酸钠、氨水、乙酸、氢氧化钠均为优级级；实验用水由THERMO GENPURE纯水机制得（>18.2 MΩ·cm）. 标准储备液及标准品置于4℃冷藏，混合标准溶液系列均由标准储备液及标准品以超纯水逐级稀释配制，所有工作溶液均当天配制. 色谱进样前所有样品经0.22 μm滤膜过滤.

丙二醛（MDA）试剂盒（A003-1）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（A001-3）、谷胱甘肽（GSHx）试剂盒（A005-1）均购自南京建成科技有限公司； MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（C0009s）购自南通碧云天生物技术有限公司； 小鼠肝实质细胞AML12购自中科院上海细胞库（SCSP-550）； 脂多糖（L6143-1MG）购自Sigma公司.

微波消解条件 消解功率1500 W，升温程序：由室温升至120 ℃，升温时间3 min，恒温3 min；120 ℃升至190 ℃，升温时间5 min，恒温40 min.

色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相：20 mmol∙L⁻¹柠檬酸，5.0 mmol∙L⁻¹己烷磺酸钠（pH=4.4，甲醇加入量1 %），等度洗脱，流速：1.0 mL∙ min⁻¹，进样量：20 μL.

ICP-MS条件 射频功率1550 W，蠕动泵速率0.4 r∙min⁻¹，雾化室温度2.0 ℃，载气流量1.09 L∙min⁻¹，等离子体气流量15 L∙min⁻¹，采样深度：8.0 mm，积分时间0.5 s，高氦碰撞反应池模式，流量6.0 mL∙ min⁻¹.

称取0.5000 g样品于消解罐内，加入6 mL 硝酸和2 mL过氧化氢溶液进行微波消解. 按照1.2条件微波消解. 消解结束后，冷却，打开消解罐，电热板上赶酸至近干，用超纯水洗涤消解罐 3 次，合并洗涤液，再用超纯水定容至25 mL，摇匀. 直接用 ICP-MS 测定硒总量. 同样方法做试剂空白试验.

（1）碱提取 称取0.1000 g样品于15 mL离心管内，加入10 mL 0.1 moL∙L⁻¹ 氢氧化钠溶液,放入超声波清洗器中90 ℃恒温超声30 min，冷却，在15000 r ∙ min⁻¹的条件下离心15 min后，调至pH 6.5，取两份3 mL样品溶液转移至A、B离心管. A管经15000 r ∙ min⁻¹离心15 min后，上清液经0.22 µm滤膜过滤，测定Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeCys_2.

（2）酶提取 将碱提取后的B离心管加入10 mL水、10 mg 蛋白酶XIV、10 mg脂肪酶、10 mg淀粉酶，涡旋3 min后置于37 ℃水浴温控摇床中，在150 r∙min⁻¹条件下振摇18 h，15000 r ∙ min⁻¹离心15 min后，上清液经0.22 µm滤膜过滤，得到待测液B，测定MeSeCys、SeMet、SeEt.

（1）分组与处置：以（0（正常组）、0.01、0.1、1、10 μmol∙L⁻¹）的硒代蛋氨酸、硒酸根、亚硒酸根（均以Se计）处理脂多糖诱导的AML12细胞48 h，MTT实验测定细胞活力. 将AML12细胞随机分为5组：正常组（不加任何药物刺激）、模型组（加10 μg∙ml⁻¹ LPS刺激），硒代蛋氨酸低浓度组、硒代蛋氨酸中浓度组、硒代蛋氨酸高浓度组，每组细胞培养48 h. 实验重复3次.

（2）细胞活力测定：按照上述分组与处置将细胞培养48 h后，加入200 μL二甲基亚砜孵育4 h，后加入20 μL的MTT溶液，在酶标仪620 nm处测定细胞吸光值（DO值）, DO值即为细胞活力.

（3）细胞上清液中SOD、GSHx活性及MDA含量：按照上述分组与处置将细胞培养48 h后，收集上清液，并分别严格按照试剂盒说明书检测SOD、GSHx活性及MDA含量.

结果采用SPSS 20软件进行统计分析，计量资料结果以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析、组间两两比较采用t检验，P<0.05说明差异具有统计学意义.

以1 µg∙L⁻¹的硒标准溶液进行碰撞池气体流量优化，随着He流量增加，⁷⁸Se的灵敏度出现先升高后下降的趋势，在氦气流量达到6.0 mL∙ min⁻¹时⁷⁸Se灵敏度最高，最终确定碰撞池气体氦气的最佳流量为6.0 mL∙ min⁻¹.

本实验室前期研究已确定硒形态分离的相关色谱参数，具体研究已发表^[7]. 优化后色谱柱选用Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 µm），流动相20 mmol∙L⁻¹柠檬酸和5.0 mmol∙L⁻¹己烷磺酸钠（pH=4.4，甲醇加入量1 %），等度洗脱，流速1.0 mL∙min⁻¹，进样量20 μL. 分离色谱图见图1.

结合硒形态分析相关文献^{[8 − 13]}，以富硒葛粉为样品，考察水提法、醇提法、酸提法和碱提法提取硒形态效果，其中水提法只对Se（Ⅳ）的提取效果较明显，其他形态提取效率低；醇提法和水提法的提取效率相近；酸提法与前二者相比，Se（Ⅵ）的提取效率反而下降且基线波动大，提取效果极差；碱提法对一些水溶性硒蛋白中硒形态具有较高的提取效率，如Se（Ⅳ）. 考察木瓜蛋白酶、蛋白酶XIV、胃蛋白酶、蛋白酶K对样品中硒形态提取效果的影响. 蛋白酶XIV提取Se（Ⅳ）、SeMet效率更高，因此蛋白酶XIV是较优选择. 综上，本研究拟定碱提取和酶提取相结合的提取方法. 但由于蛋白酶XIV在中性条件下活性最强. 因此，硒形态提取分两步进行，先碱提取，提取液中和后，采用蛋白酶XIV伴以水浴摇床辅助提取.

考察不同温度对提取效果的影响，分别进行室温（25 ℃）、60 ℃、90 ℃超声提取提取30 min，121 ℃提取30 min，结果显示60 ℃超声时Se（IV）的提取量是室温条件下的1.5倍；升高温度到90 ℃，Se（IV）的提取效率显著提高，约为60 ℃提取量的一倍，121 ℃时硒形态之间发生转化. 因此选择90 ℃，超声30 min为碱提取条件.

酶在高温条件下结构易被破坏，活性降低或失活，其最佳提取温度为37 ℃，提取率高且不会破坏活性. 且酶解时间的长短会对提取效果造成影响，时间过少会导致硒形态不能完全提取，时间过长又会导致硒形态之间发生一定的转变. 为考察酶解时间对葛粉中硒形态提取效果的影响，分别进行37 ℃水浴酶解4 h、6 h、8 h和18 h，酶解时间为4 h、6 h、8 h时，有机硒形态中仅有SeMet检出，而酶解时间18 h时不仅检出SeMet，还检出大量的SeEt. 许多植物为避免硒中毒，会通过甲基化的方式转变硒的储存形式^[14]，因此存在SeEt. SeEt 为 SeMet的衍生物. 结果与已有研究结果一致^[15]. 前期在探讨无机硒提取效果时，采取醇提法时，也同时出现了SeMet、SeEt. 葛粉中检出SeEt，这与富硒大蒜、富硒西兰花的检出结果一致^[14,16]. 有研究表明^{[17 − 18]}，植物基质中含有丰富的酚类物质，Se（Ⅳ）与植物中黄酮类、酚酸类或鞣质类等酚类化合物发生相互作用含量逐渐下降，而SeMet, SeCys₂, SeMeSeCys 以及 Se（Ⅵ））等则是稳定的. 本研究将采用先提取无机硒，后提取有机硒的两步法，既保证了无机硒形态和有机硒形态的提取率，又可以避免长时间酶解导致Se（Ⅳ）含量逐渐下降. 考虑到葛粉中含有少量淀粉及脂肪，本实验选择蛋白酶XIV、脂肪酶、淀粉酶各10 mg混合加入，37 ℃水浴提取18 h为酶提取条件.

使用超纯水将6种硒形态的混合标准液逐级稀释，配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、200、500 µg∙L⁻¹的混合标准液系列，以各浓度色谱峰面积对应质量浓度绘制标准工作曲线，相关系数均大于0.9998. 以色谱峰信噪比Ｓ/Ｎ为３∶１时所对应的浓度计算检出限，得出Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeCys₂、MeSeCys、SeMet、SeEt的检出限0.017—0.053 mg·kg⁻¹.

对富硒葛粉中6种硒形态进行加标回收试验，Se（Ⅵ）、SeCys₂、MeSeCys的加标浓度分别为0.1、0.5、2 mg·kg⁻¹，Se（Ⅳ）、SeMet、SeEt的加标浓度分别为0.5、2.5、10 mg·kg⁻¹. 6种硒形态的加标回收率均在71.2%—117.3%之间,相对标准偏差（n=6）均在10%以下.

将本研究建立方法用于测定市面上销售的富硒葛粉，并用国家标准GB/T 5009.93-2017 电感耦合等离子体质谱法测定总硒含量. 结果显示总硒含量为2.26 mg·kg⁻¹，对富硒葛粉进行硒形态分析，最终测出富硒葛粉中主要成分为：Se（IV）占30.8%，SeMet（以SeMet和SeEt之和计）占40.1%，SeCys₂占3.39%，MeSeCys占2.64%. 6种硒形态的总提取率为76.9 %. 由于分析过程中出现多个未知硒形态峰，以当前已有的硒形态标准物质无法对其进行定性定量分析，计划在今后实验中运用HPLC-MS-MS对未知硒形态深入研究. 富硒葛粉中主要成分为Se（IV）、SeMet，因此在研究硒形态的抗氧化功能时，选取常见无机硒形态Se（IV）、Se（Ⅵ）以及有机硒形态SeMet，考察三种硒形态对脂多糖诱导的AML12细胞氧化损伤的影响.

采用0、0.01、0.1、1、10 μmol·L⁻¹ SeMet处理脂多糖（LPS）诱导的AML12细胞48 h后，0.01、0.1、1 μmol∙L⁻¹ SeMet均能提高AML12细胞活力，且0.1、1 μmol∙L⁻¹ SeMet具有显著性（P<0.05），而10 μmol∙L⁻¹ SeMet显著降低AML12细胞活力（P<0.01）. 0.01、0.1、1、10 μmol∙L⁻¹ Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）均显著降低AML12细胞活力（P<0.01）. 因此，本研究选择0.01、0.1、1 μmol∙L⁻¹ SeMet作为后续研究剂量.

如表1所示，与正常组比较，模型组中MDA含量上升（P<0.01），SOD及GSHx活性皆显著降低（P<0.01）；与模型组比较，硒代蛋氨酸3个剂量实验组中MDA含量显著降低（P<0.01），SOD及GSHx活性都显著提高（P<0.01）.

使用Agilent ZORBAX SB-Aq 反相色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），流动相体系为20 mmoL∙L⁻¹的柠檬酸和2.5 mmoL∙L⁻¹的己烷磺酸钠，0.1 moL∙L⁻¹的NaOH溶液在90 ℃下提取样品30 min，加入蛋白酶XIV、脂肪酶、淀粉酶，37 ℃水浴酶解18 h，运用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS）快速分离六种硒形态. 6种硒形态的检出限为0.017—0.053 mg∙kg⁻¹，标准曲线的相关系数均在0.9998以上. 该前处理方法测定样品的加标回收率均在71.2 %—117.3 %之间，相对标准偏差均在10 %以内.

分析富硒葛粉中主要硒形态对脂多糖（LPS）诱导的AML12细胞氧化损伤的影响，与模型组相比，1 μmol·L⁻¹硒代蛋氨酸处理组脂多糖诱导的AML12细胞活力显著上升，丙二醛（MDA）含量显著下降，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHx）活性显著增加. 结果提示，硒代蛋氨酸对LPS诱导的AML12细胞氧化损伤具有保护作用，可增强植物的抗氧化损伤能力.