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紫苏子为唇形科植物紫苏Perilla frutescens （L.） Britt. 的干燥成熟果实，将其按照标准汤剂的主要质量指标加工即为紫苏子配方颗粒. 将其炒制并按标准汤剂的主要质量指标加工，即为炒紫苏子配方颗粒. 目前紫苏子和炒紫苏子配方颗粒标准有对照特征图谱，一般只对迷迭香酸进行了定量，有些成分由于无法获得标准品不能很好的进行定量[1]. 且传统蒸发光检测器来进行定量利用光散射程度来估计分析物的含量，颗粒散射光的能力取决于其大小，导致校准曲线复杂[2]. 电雾式检测器CAD实现同时对多种化合物的定量，对没法获得标准品的化合物的定量具有显著的优势，在中药材上得到了一些应用和关注[2-4]. 因此，建立精确快速有效的成分测定方法，实现对多成分的含量测定对紫苏子、炒紫苏子配方颗粒的质量控制具有重要意义.
本文利用电雾式检测器（CAD），建立了一种有效的定性定量方法，对不同批次紫苏子配方颗粒和炒紫苏子配方颗粒的成分进行分析和比较，以期为紫苏子配方颗粒质量标准的研究以及紫苏子和炒紫苏子的利用提供科学依据。
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Vanquish高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司, 美国），包括Dual Pump CN双三元泵、Split Sampler CT自动进样器、Column Compartment H柱温箱、Charged Aerosol Detector H电雾式检测器（CAD）；ME204T万分之一天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；TGL-16M离心机 （湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；KQ-250DB超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）.
迷迭香酸（批号：11187-201505，纯度98.5%）购自中国食品药品检定研究院；色谱级乙腈（上海星可高纯溶剂有限公司）；色谱级三氟乙酸（北京迈瑞达科技有限公司）；分析级甲醇（天津市致远化学试剂有限公司）；屈臣氏饮用水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；紫苏子配方颗粒（编号为S1-S10）分别购自华润三九医药股份有限公司、广东一方制药有限公司、中国中医科学院西苑医院、首都医科大学附属北京中医医院、北京中医药大学东直门医院；炒紫苏子配方颗粒（编号为S11-S20）分别购自江阴天江药业有限公司、华润三九医药股份有限公司、北京中医药大学东直门医院、首都医科大学附属北京中医医院(表1).
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色谱柱：赛默飞Acclaim Polar Advantage II C18（4.6 mm× 250 mm, 5 μm）色谱柱；柱温为25 ℃，流速为0.7 mL·min−1，进样体积15 μL，流动相：0.1% 三氟乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱，分析泵梯度洗脱条件：0—25 min：20%→55% A，25—26 min：55%→95% A，26—31 min：95% A。梯度补偿泵梯度采用Chromeleon 7.2软件自动计算；CAD采集频率5Hz，过滤常数3.6s，蒸发温度35 ℃.
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精密称取迷迭香酸对照品适量，加甲醇溶解，配制成每1 mL中含有迷迭香酸84.71 μg的迷迭香酸对照品溶液.
分别取紫苏子、炒紫苏子配方颗粒适量，研细，称取0.5 g置于具塞锥形瓶. 加入40%甲醇25 mL，密塞，称定质量. 超声处理20 min，冷却，加40%甲醇补足减失质量，摇匀，离心，取上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得.
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称取迷迭香酸对照品加甲醇溶解，配制成1 mL中含有迷迭香酸225 μg的对照品母液. 加甲醇稀释，得迷迭香酸质量浓度为5.60、28.12、56.25、84.71、112.50、225.00 μg·mL−1的对照品溶液，按1.2节条件测定. 以峰面积为因变量、质量浓度为自变量，得迷迭香酸回归方程为y = 0.0571x+0.3014（r=0.9991），线性范围为5.60—225.00 μg·mL−1.
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取炒紫苏子配方颗粒样品S15适量，按1.3节方法制备供试品溶液，按1.2节条件连续进样6次，迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、3’-脱羟基迷迭香酸-3-O -β-D-葡萄糖苷、迷迭香酸峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.35%、1.19%、1.40%，表明仪器精密度良好.
取炒紫苏子配方颗粒样品S15共6份，按1.3节方法制备供试品溶液，按1.2节色谱条件测定，计算迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、3´-脱羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、迷迭香酸的平均含量分别为4.739、0.706、5.553 mg·g−1，RSD分别为0.43%、1.27%、0.47%，表明该方法重复性良好.
取炒紫苏子配方颗粒样品S15适量，按1.3节方法制备供试品溶液，分别于制备后0、4、8、10、12、24 h按1.2节色谱条件测定，计算迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、3´-脱羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、迷迭香酸峰面积的RSD分别为1.30%、1.75%、1.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定.
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取已知迷迭香酸含量的炒紫苏子配方颗粒样品S15共6份，分别加入等量对照品，按1.3节方法平行制备供试品溶液6份，按1.2节色谱条件测定，计算迷迭香酸平均加样回收率为101.26%，RSD为1.10%，说明方法准确可靠.
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分析紫苏子配方颗粒电喷雾检测器的结果可知，紫苏子配方颗粒和炒紫苏子配方颗粒特征图谱主要有3个峰. 通过超高效色谱四极杆串联飞行时间质谱联用技术，对紫苏子配方颗粒和炒紫苏子配方颗粒特征图谱中的峰1和峰2进行鉴定，峰1的分子离子峰 [M-H]- m/z 521.1318，根据其特征碎片以及文献报道[4]，推断其特征碎片 [M-H-Glu]- m/z 359.0790，中性丢失162Da葡萄糖，峰1被鉴定为迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷. 峰2的分子离子峰[M-H]- m/z 505.1357，根据其特征碎片中性丢失162Da葡萄糖，特征离子[M-H-Glu]- m/z 343.0848以及文献报道[3-4]，最后峰2被鉴定为3´-脱羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷.
以迷迭香酸对照品分别计算迷迭香酸、迷迭香酸3-O-β-D-葡萄糖苷、3´-脱羟基迷迭香酸3-O-β-D-葡萄糖苷含量（表2）. 并对所得数据用SPSS软件进行成对样本t检验，结果见表3.
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本试验建立了一种HPLC-CAD法，可同时测定紫苏子炒紫苏子中迷迭香酸、迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、3’-脱羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷. 该方法简单可靠，液相色谱峰分离度好，能同时实现没有标准品的化合物的定量，本研究还对10批次紫苏子和炒紫苏子进行了含量测定，通过配对t检验分析表明：化合物 3´-脱羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷在炒紫苏子中显著的高于紫苏子 （t = -2.933，P
= 0.017） . 迷迭香酸、迷迭香酸-3-O-β-D -葡萄糖苷的含量未呈现出明显的差异，但从样品的平均值来看，炒紫苏子配方颗粒比紫苏子配方颗粒分别高出11.8%、29.2%. 配对样本t检验使用Cohen's d 值表示效应量大小（差异幅度大小）.
基于电雾式检测器的紫苏子及炒紫苏子配方颗粒多成分含量测定
Determination multi-components contents of Perilla Frutenscens seed and fried seed formulations based on charged aerosol detector
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摘要: 建立一种快速、灵敏的电雾式检测器（CAD）方法，同时测定紫苏子及炒紫苏子配方颗粒中多成分的含量. 依照中药配方颗粒的制备要求，利用Acclaim Polar Advantage II C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）- 0.1%三氟乙酸水（B），梯度洗脱，分析泵梯度洗脱条件：0—25 min：20%→55%A，25—26 min：55%→95%A；采用Chromeleon 7.2梯度补偿泵，流速为0.7 mL·min−1，进样体积15 μL. 研究表明，通过CAD检测器可以同时检测紫苏子、炒紫苏子的3种特征性成分，无样品基质干扰，r大于0.999，精密度相对偏差（RSD）分别为1.35%（迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷）、1.19%（3-脱羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷）、1.40%（迷迭香酸）. 通过对10批不同紫苏子和炒紫苏子配方颗粒含量分析，炒紫苏子的3个特征性酚酸类成分含量高于紫苏子含量，其中炒紫苏子中3-去羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷含量显著高于紫苏子（P = 0.017）. 本方法简便、快速，能同时对紫苏子及炒紫苏子配方颗粒指纹图谱中无标准品的特征性成分进行定量测定.Abstract: To establish a rapid and sensitive CAD method for simultaneous determination of multiple components in the formulation particles of perilla seeds and their fried products. The Acclaim Polar Advantage II C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used for analysis. Acetonitrile as eluent A, 0.1% trifluoroacetic acid in water as eluent B, and the gradient elution conditions were as follows: 0—25 min:20%—55%A; 25—26 min: 55%—95% A, at a flow rate of 0.7 mL·min−1 and injection volume of 15 μL. A chromeleon 7.2 gradient compensation pump was used in this method. Three characteristic components of perilla seeds and fried perilla seed could be detected simultaneously by CAD detector, without sample matrix interference, r was greater than 0.999, and the relative deviation (RSD) of precision were 1.35% (rosmarinic acid-3-O-β-D-glucoside), 1.19% (3’-dehydroxy rosine-3-O-β-D-glucoside), and 1.40% (rosmarinic acid), respectively. The results showed that the content of three characteristic components in the fried perilla seeds was higher than that in the perilla seeds, and the content of 3’-dehydroxy rosine-3-O-β-D-glucoside in the fried perilla seeds was significantly higher than that in the perilla seeds (P=0.017). The method is simple, rapid and can be used for the quantitative determination of the characteristic components in the fingerprint of perilla seed formula granules.
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表 1 20批紫苏子配方颗粒、炒紫苏子配方颗粒样品信息
Table 1. Sample information of twenty batches of Perilla seed formula particles and fried Perilla seed formula particles
样品 编号 厂家 批号 样品 编号 厂家 批号 紫苏子
配方颗粒S1 广东一方制药有限公司 A1061291 炒紫苏子
配方颗粒S11 江阴天江药业有限公司 21066934 S2 广东一方制药有限公司 0071811 S12 江阴天江药业有限公司 2110084101 S3 华润三九医药股份有限公司 2112001C S13 江阴天江药业有限公司 2110085101 S4 华润三九医药股份有限公司 2112002C S14 江阴天江药业有限公司 2110086101 S5 华润三九医药股份有限公司 2010001C S15 华润三九医药股份有限公司 2006001W S6 中国中医科学院西苑医院 20220501 S16 华润三九医药股份有限公司 2006002W S7 首都医科大学附属北京中医医院 20220502 S17 华润三九医药股份有限公司 2006003W S8 首都医科大学附属北京中医医院 20220503 S18 北京中医药大学东直门医院 20220601 S9 北京中医药大学东直门医院 20220401 S19 北京中医药大学东直门医院 20220602 S10 北京中医药大学东直门医院 20220402 S20 首都医科大学附属北京中医医院 20220603 
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表 2 紫苏子和炒紫苏子配方颗粒3种成分含量测定
Table 2. Three components contents of perilla seeds and fried perilla seeds
样品 编号 迷迭
香酸3´-脱羟基迷迭香酸-
3-O-β-D-葡萄糖苷迷迭香酸-
3-O-β-D-葡萄糖苷样品 编号 迷迭
香酸3´-脱羟基迷迭香酸-
3-O-β-D-葡萄糖苷迷迭香酸-
3-O-β-D-葡萄糖苷紫苏子
配方颗粒S1 8.23 0.59 5.70 炒紫苏子
配方颗粒S11 6.21 0.54 5.23 S2 8.27 0.63 5.58 S12 8.94 1.09 8.59 S3 6.85 0.61 5.38 S13 9.32 1.04 8.95 S4 6.75 0.62 5.28 S14 5.64 0.38 4.07 S5 8.72 0.49 6.05 S15 5.55 0.71 4.74 S6 8.36 0.45 5.90 S16 8.07 0.54 5.64 S7 5.12 0.19 3.73 S17 8.42 0.57 5.87 S8 5.10 0.22 3.65 S18 6.14 0.57 5.32 S9 4.89 0.20 3.60 S19 8.80 1.06 8.51 S10 4.98 0.21 3.60 S20 8.09 0.52 5.69 平均值 6.73 0.42 4.85 平均值 7.52 0.70 6.26
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表 3 配对t 检验分析、效应量
Table 3. Paired t-test analysis and effect amount
名称 平均值差值 标准偏差 t p Cohen's d 紫苏子迷迭香酸 配对 炒紫苏子迷迭香酸 −0.791 2.41914 −1.034 0.328 0.327 紫苏子3´-脱羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷 配对 炒紫苏子3´-脱羟基迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷 −0.281 0.30296 −2.933 0.017* 0.927 紫苏子迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷 配对 炒紫苏子迷迭香酸-3-O-β-D-葡萄糖苷 −1.414 2.13761 −2.092 0.066 0.661
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[1] 王永奇, 邢福有, 刘凡亮, 等. 紫苏子镇咳、祛痰、平喘作用的药理研究 [J]. 中南药学, 2003, 1(3): 4. doi: 10.3969/j.issn.1672-2981.2003.03.002 [2] XU X Y, WANG S M, WANG H M, et al. Simultaneous quantitative assays of 15 ginsenosides from 119 batches of ginseng samples representing 12 traditional Chinese medicines by ultra-high performance liquid chromatography coupled with charged aerosol detector [J]. Journal of Chromatography A, 2021, 1655(11): 462504. [3] MARCELA H, DALIBOR Š, FRANTIŠEK Š et al. UHPLC coupled with charged aerosol detector for rapid separation of steviol glycosides in commercial sweeteners and extract of stevia rebaudiana [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2021, 207(5): 114398. [4] 杜靓, 杨夏, 孙晓丽. HPLC法测定中药材紫苏子中迷迭香酸的含量 [J]. 中国处方药, 2015, 13(10): 31-32. doi: 10.3969/j.issn.1671-945X.2015.10.020 -
