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硫酸二甲酯是重要的化工原料，在药物合成中常做为甲基化试剂[1-3]，例如，在泮托拉唑钠原料药合成工艺中即用到该试剂。但硫酸二甲酯是潜在的致癌物质，作用与芥子气相似，急性毒性类似光气，其毒性比氯气大15倍，可以破坏DNA结构[4-5] ，属于高毒类物质，因此在药物合成过程中需严格控制其含量。由于硫酸二甲酯的致癌致畸性，欧盟将其列入第八批需授权物质候选清单，被人用药物注册技术要求国际协调会指南ICH M7[6]分类为3类基因毒性杂质，在1999年被国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）[7]划分为2A类致癌物。因此，检测药物中残留的硫酸二甲酯含量对于控制临床用药的安全性具有非常重要的意义。
据报道，硫酸二甲酯的相关检测方法主要有气相色谱法[8-9]、气质联用法[10-15]、液相方法[16]、液质联用法[17]。张耕[8]采用气相色谱检测工作场所中硫酸二甲酯含量，需进行柱前衍生化，衍生化试剂、分散剂等对其衍生化效率均有影响，检测限为120 ng·mL−1。采用液相色谱法[16]检测化学合成丹皮酚中的硫酸二甲酯残留量同样需要衍生化，其效率影响检测准确度。药品中的硫酸二甲酯含量亦可以采用衍生化后顶空气相色谱法检测[9]，但需要考察衍生化条件，操作步骤繁琐。有学者[10]采用气相色谱-质谱联用法检测化妆品中硫酸二甲酯含量，回收率仅为22.2%—55.8%。目前报道的气质联用[11-14]检测二甲酯含量的检测限在µg·mL−1水平，灵敏度低。液相色谱质谱联用方法检测灵敏度高，无需样品衍生化，但硫酸二甲酯的保留较弱，保留时间不到1 min，且检测成本高。因此，亟需一种操作简单、灵敏度高、成本低廉的硫酸二甲酯检测方法。
室温下硫酸二甲酯在碱水中易水解为硫酸单甲酯，利用这一化学性质，本文建立采用离子色谱检测泮托拉唑钠原料药中硫酸单甲酯的方法，以达到通过硫酸单甲酯的含量获得硫酸二甲酯含量的目的，为有效控制药品中硫酸二甲酯含量提供技术支撑。该方法准确、灵敏度高、精密度好、成本低廉、操作简便快速，不仅可以测定泮托拉唑钠中硫酸二甲酯的含量，也适用于其他原料药和制剂中硫酸二甲酯含量的检测。
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ICS-6000离子色谱仪，配电导检测器（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；On-Guard RP样品前处理小柱（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多）；Milii-Q Reference A+型超纯水仪（密理博（中国）有限公司）。
硫酸单甲酯（AOCS，纯度：99%）；硫酸二甲酯（萨恩化学技术有限公司，纯度：99%）；1000 µg·mL−1硫酸根离子单元素标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心）；1000 µg·mL−1磷酸根离子单元素标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心）；1000 µg·mL−1氯离子单元素标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心）；1000 µg·mL−1碳酸根离子单元素标准溶液（北京北方伟业计量技术研究院）；50%氢氧化钠（FISHER）；30 mmol·L−1氢氧化钾（KOH淋洗液发生器，075778，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；泮托拉唑钠原料药（自制）。
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色谱柱Dinex IonPacTM AS11-HC，保护柱Dinex IonPacTM AG11-HC，淋洗液30 mmol·L−1氢氧化钾，电导检测器，阴离子抑制器，电流75 mA，淋洗液流速1.0 mL·min−1，进样量25 μL，柱温40 ℃，池温35 ℃。
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硫酸根离子、碳酸根离子、氯离子、磷酸根离子标准溶液：准确量取各离子单元素标准溶液（1000 µg·mL−1）1 mL，分别置于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
硫酸二甲酯溶液：精密称取硫酸二甲酯2.5 mg置于25 mL小烧杯中，加5 mL氢氧化钠溶液（50 mmol·L−1）溶解，转移至 25 mL容量瓶中，反复冲洗烧杯3次，冲洗液转移至同一容量瓶，加50 mmol·L−1氢氧化钠溶液至刻度，摇匀；然后，准确量取2.5 mL，置25 mL容量瓶中，用50 mmol·L−1氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀。
硫酸单甲酯标准溶液：精密称取硫酸单甲酯2.5 mg置于25 mL小烧杯中，加5 mL氢氧化钠溶液（50 mmol·L−1）溶解，转移至 25 mL容量瓶中，反复冲洗烧杯3次，冲洗液转移至同一容量瓶，加50 mmol·L−1氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；然后，再准确量取2.5 mL置于25 mL容量瓶中，加50 mmol·L−1氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液配制：准确量取硫酸根离子、碳酸根离子、氯离子、磷酸根离子（1000 µg·mL−1）各0.1 mL、硫酸二甲酯（100 µg·mL−1）1 mL，置于10 mL容量瓶中，加50 mmol·L−1氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
标准曲线溶液配制：准确量取硫酸单甲酯标准溶液适量，用50 mmol·L−1氢氧化钠溶液稀释制得浓度分别为0.015、0.06、0.2、1、5 µg·mL−1的系列对照品溶液。
样品配制：精密称取待测药物250 mg，置于50 mL容量瓶中，用50 mmol·L−1氢氧化钠溶液溶解并定容至刻度，摇匀。
使用离子色谱检测时，为去除药品及其杂质等有机物的干扰，将上述溶液经活化（依次采用10 mL甲醇、水冲洗）的On-Guard RP样品前处理小柱过滤后，用离子色谱测定硫酸单甲酯的含量。
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在离子色谱仪上采集硫酸单甲酯数据，按公式（1）计算硫酸二甲酯含量。
式中，W对：硫酸单甲酯对照品称样量（mg）；W供：供试品称样量（mg），A对：硫酸单甲酯对照品峰面积，A样：供试品中硫酸单甲酯峰面积，硫酸单甲酯分子量：112.11， 硫酸二甲酯分子量：126.13，1000000：单位换算成µg·g−1
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据报道[10,18]，硫酸二甲酯在50℃或者碱水中易迅速水解成硫酸和甲醇，反应式为：
因此，可采用离子色谱仪检测硫酸根离子浓度从而计算硫酸二甲酯含量。取硫酸二甲酯适量，用50 mmol·L−1氢氧化钠溶解，振摇，过滤后进样记录色谱图；取25 μL硫酸根单元素标准溶液进样，记录色谱图。结果显示，硫酸二甲酯水解产物的保留时间与硫酸根离子的保留时间不一致（图1b、d）。推测可能硫酸二甲酯并未水解为硫酸根，而是经不完全水解生成硫酸单甲酯，其水解方程式如下：
为验证上述推测，将硫酸二甲酯在室温下用50 mmol·L−1氢氧化钠溶解，其水解产物与硫酸单甲酯对照品的保留时间一致（图1c、d）。由图1可知，硫酸二甲酯在上述条件下已完全水解为硫酸单甲酯，而并未生成硫酸。将反应温度提高至50 ℃，结果显示仍然没有硫酸根离子产生，证明了硫酸二甲酯在选定的水解条件下完全水解为硫酸单甲酯（图1d），且水解条件简便、迅速，因此巧妙利用这一反应，通过检测硫酸单甲酯含量的方式计算硫酸二甲酯含量。根据DERECK和SARAH软件预测结果显示，从硫酸二甲酯到硫酸单甲酯，化合物毒性降低，提高了试验操作的安全性。
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根据文献[10]，硫酸二甲酯在碱液中无需加热，水解迅速，故仅需考察NaOH浓度对反应的影响。分别考察了10、20、30、40、50、60 mmol·L−1的6个不同浓度下硫酸二甲酯的水解结果（图2）。由图2可知，相同时间内，随着碱浓度的增大，硫酸二甲酯的水解程度增大，在50 mmol·L−1时完全水解为硫酸单甲酯，因此选择50 mmol·L−1的NaOH溶液对硫酸二甲酯进行水解。
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在建立方法的过程中，把常见的氯离子、碳酸根离子、磷酸根离子与硫酸单甲酯同时进行分离，避免常见阴离子的干扰。结果如图3所示。
为了达到良好的分离效果，分别考察了不同柱温、流速、淋洗液浓度对硫酸二甲酯色谱行为的影响，优化色谱条件。
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考察了不同柱温下4种常见干扰离子与硫酸单甲酯的色谱行为，结果如图3所示。当柱温为25 ℃和30 ℃时，硫酸单甲酯和碳酸根离子不能很好地分离（峰2和3）。随着柱温的升高，各离子之间分离度增大，在40 ℃时，各离子之间分离度已经满足检测要求，而当柱温升至45 ℃时，磷酸根的保留时间太长（峰5），影响检测效率。同时，综合考虑色谱柱的使用寿命，选择柱温为40 ℃。
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考察淋洗液在0.8、1.0、1.2 mL·min−1的3个流速时各离子的分离效果，结果如图4所示。5种离子分离度均较好，因此采用色谱柱推荐流速1.0 mL·min−1。
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考察淋洗液氢氧化钾浓度分别为25、30、35 mmol·L−1时各离子的分离效果，结果见图5。淋洗液浓度为25 mmol·L−1时，各离子分离效果最佳，但磷酸根离子保留时间为23.1 min，分析时间长。淋洗液浓度为30 mmol·L−1时，各离子分离效果良好，保留时间适中，因此，选用淋洗液浓度为30 mmol·L−1。
综上，硫酸单甲酯的检测条件为柱温40 ℃，淋洗液为30 mmol·L−1氢氧化钾溶液，流速为1.0 mL·min−1。
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采用优化后参数采集数据，以硫酸单甲酯的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，在0.015—5 µg·mL−1范围内，硫酸单甲酯呈良好的线性关系，线性方程为y=0.0583x-0.0027，相关系数r为0.9998。当信噪比为10.1时的定量限浓度为0.015 µg·mL−1，信噪比为4.5时的检测限浓度为0.007 μg·mL−1，
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取供试品（泮托拉唑钠）250 mg，精密加入一定体积的标准溶液，按1.3节制备供试品溶液，作为低（0.04 µg·mL−1）、中（0.08 µg·mL−1）和高（0.12 µg·mL−1）三水平回收率溶液，每个加标水平重复3次，计算回收率和RSD值，低、中、高3个浓度的回收率在87.5%—98.5%之间，符合要求。取定量限浓度溶液连续进样6次，峰面积的RSD值为6.5%，保留时间的RSD值为0.08%，显示进样精密度良好，结果见表1。
根据ICH关于致突变药品终生用药限量规定，按照终身服药毒理学关注阈值（TTC）为1.5 μg·d−1，最大日服用量是80 mg·d−1，计算硫酸二甲酯的限度是18.75 µg·g−1，由表2结果可知，所测的201101、201201、201202、201203批次的泮托拉唑钠样品中硫酸二甲酯含量虽有检出，但均小于限度，且经工艺优化后，200512、200619、200708批次的样品均未检出硫酸二甲酯。
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采用离子色谱法检测原料药中硫酸单甲酯含量，建立的硫酸单甲酯的检测方法灵敏度高，操作方便简单，成本低廉，可用于药品中基因毒性杂质硫酸二甲酯含量的检测与计算，为控制药品质量提供技术支撑，对用药安全具有重要意义。
离子色谱法检测泮托拉唑钠原料药中硫酸二甲酯
Determination of dimethyl sulphate in pantoprazole sodium active pharmaceutical ingredient by ion chromatography
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摘要: 建立了一种准确测定泮托拉唑钠原料药中残留硫酸二甲酯含量的离子色谱方法。利用硫酸二甲酯可以完全水解为硫酸单甲酯的反应，样品经氢氧化钠溶液溶解后，采用离子色谱法，以氢氧化钾为淋洗液，阴离子抑制器条件下，采用电导检测器检测硫酸单甲酯含量，经计算实现准确测定硫酸二甲酯含量的目的。硫酸单甲酯的检测限低至7 ng·mL−1，在15 ng·mL−1—5 μg·mL−1范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）为0.9998，低、中、高浓度的加标回收率在87.5%—98.5%之间，定量限浓度溶液连续进样6次，相对标准偏差（RSD）为6.5%。该方法准确、灵敏度高、精密度好、成本低、操作简便快速，不仅可用于泮托拉唑钠原料药中硫酸二甲酯的含量测定，同时也为其他原料药和制剂中硫酸二甲酯含量测定提供了参考依据。Abstract: This study aimed to develop a strategy for the determination of dimethyl sulphate in pantoprazole sodium Active Principal Ingredient (API) employing ion chromatography (IC). API samples were first dissolved in sodium hydroxide solution. Then, methyl hydrogen sulphate was determined by IC in electric conductivity detector mode under the anion suppressor by using KOH solution as the eluent. Due to that dimethyl sulphate hydrolyzes to equivalent mole of methyl hydrogen sulphate, the concentration of dimethyl sulphate could be obtained by analyzing the methyl hydrogen sulphate concentration. The limit of detection was 7 ng·mL−1. The assay was linear over the concentration range of 15 ng·mL−1 to 5 μg·mL−1 with a correlation coefficient (r) of 0.9998. The spiked recoveries were between 87.5% and 98.5% at three concentration levels (low, medium and high). The relative standard deviation (RSD) was 6.5% from six consecutive LOQ concentration analyses of the same sample. The method is accurate, sensitive, precise, and low cost with minimum sample preparation. It is not only a suitable approach for the determination of dimethyl sulphate in pantoprazole sodium API, but also a guideline for dimethyl sulphate quantification in other types of API and preparations.
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Key words:
- dimethyl sulphate /
- methyl hydrogen sulphate /
- ion chromatography /
- pantoprazole sodium
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图 2 不同NaOH浓度下硫酸二甲酯的水解结果
Figure 2. The results of dimethyl sulfate hydrolysis reaction in different concentration of sodium hydroxide
表 1 硫酸单甲酯回收率结果
Table 1. Results of recoveries and RSDs for methyl hydrogen sulphate
称样量/mg
Sample weight体积/mL
Volume峰面积
Peak area加入量/μg
Spiked测得量/μg
Result回收率/%
Recovery均值/%
AverageRSD/% 251.23 50 0.0018 2.079 2.047 98.5 93.2 3.7 250.71 50 0.0017 2.019 1.933 95.8 251.65 50 0.0020 2.416 2.275 94.2 250.71 50 0.0034 4.158 3.867 93.0 250.78 50 0.0033 4.038 3.753 92.9 251.75 50 0.0040 4.832 4.549 94.2 250.90 50 0.0048 6.237 5.459 87.5 251.51 50 0.0047 6.057 5.346 88.3 251.12 50 0.0060 7.248 6.824 94.2 
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表 2 泮托拉唑钠原料药中硫酸单甲酯检测结果及硫酸二甲酯计算结果
Table 2. Results of methyl hydrogen sulphate and dimethyl sulphate in pantoprazole sodium API
批号 201101 201201 201202 201203 200512 200619 200708 硫酸单甲酯/（µg·g−1） 6.61 6.40 5.20 6.63 ND ND ND 硫酸二甲酯计算量/（µg·g−1） 7.44 7.20 5.85 7.46 ND ND ND ND，未检出. ND, not detected.
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