LCMS-8050-液相色谱质谱联用仪（日本SHIMADZU公司）；AdVantageXL-70真空冷冻干燥机（美国SP SCICENTIFIC公司）；Milli-Q 超纯水制备仪(美国Millipore公司)；标准试验筛（40目）；Sigma 3K-15型离心机（美国Sigma公司）；N-EVAP112氮吹仪（美国organomation公司）；Milli-Q纯化系统（美国Millipore公司）；Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1×100 mm，1.7 µm，美国Waters公司）；C₁₈、中性氧化铝分散固相粉末（均购于上海安谱实验科技股份有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）、甲醇（色谱纯，上海Anpel公司）、甲酸（色谱纯，美国Dikma公司）、乙酸、乙酸钠、氯化钠（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）。

喷布特罗（99.7%）、克伦特罗（99.6%）、托拉塞米（99.1%）以及可的松（98.5 %）标准物质均购自北京曼哈格生物科技有限公司；丙酸睾酮（99.9%）、睾酮（99.3%）、氯噻嗪（99.3%）以及甲基泼尼松龙（99.3%）标准物质均购自广州硕谱生物科技有限公司。

本研究以火腿肠为基质，以8种兴奋剂为加标物质，制备不同浓度水平的食源性兴奋剂质控品。参考各药物限量及日常阳性样品检出浓度，确定喷布特罗浓度水平为6.5 μg·kg⁻¹，克伦特罗浓度水平为3.5 μg·kg⁻¹，睾酮浓度水平为15 μg·kg⁻¹，丙酸睾酮浓度水平为15 μg·kg⁻¹，甲基泼尼松龙浓度水平为7 μg·kg⁻¹，可的松浓度水平为10 μg·kg⁻¹，氯噻嗪浓度水平为15 μg·kg⁻¹，托拉塞米浓度水平为20 μg·kg⁻¹。制备过程如下所示：

（1）标准溶液配制

取8种兴奋剂药物各0.01 g（精确至10 mg），置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成浓度为1 mg·mL⁻¹的各化合物标准储备液，置于-18℃避光保存。移取各化合物储备液1 mL，用水溶解，分别配制成浓度为10 μg·mL⁻¹标准中间溶液，于4℃保存。

（2）基质的筛选与制备

本研究以火腿肠（购自河北石家庄某超市）为基质。以张海超等^[7]的检测方法对火腿肠样品中兴奋剂进行检测。结果均为未检出，作为制备质控品空白基质。将其倒入均质机中充分绞碎。加入一定体积的10 μg·mL⁻¹标准工作液，以500 r·min⁻¹，搅拌5 h。

（3）真空冷冻干燥

将混匀样品平铺于冷冻干燥盘，平铺厚度0.5 cm左右，-40℃下预冷冻30 min，打开真空泵，使干燥箱箱体压力至26.6 Pa，冷冻干燥24 h。冻干完成后的样品转移至粉碎机中，充分打碎混匀，过40目筛。将过筛后的样品按照检测方法进行均匀性检验，检验合格后按每袋5 g进行真空分装，若未混合均匀则需继续进行混合，直至样品均匀性符合要求。共制备252 袋质控样品。

取冻干质控品1.25 g（精确至0.001 g），加入3.75 mL超纯水复溶，振荡涡旋，静置30 min，使其恢复至匀浆。加入0.2 mol·L⁻¹乙酸钠（pH 5.2）溶液8 mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液50 µL，涡旋混匀，于37°C下水浴16 h。样品酶解后冷却至室温，加入20 mL乙腈、5 g氯化钠，均质1 min，10000 r·min⁻¹离心5 min。取10 mL乙腈层至另一离心管中，加入10 mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡1 min弃去正己烷层，再加入10 mL乙腈饱和正己烷重复操作1次。取上清液6 mL置于50 mg C₁₈和300 mg中性氧化铝的另一离心管中，涡旋振荡2 min，10000 r·min⁻¹高速5 min。准确移取5 mL上清液于10 mL离心管中，40℃氮吹至干，用1 mL甲醇-水（1∶1，V/V）溶液溶解残渣。经0.22 μm滤膜过滤，用液相色谱-串联质谱仪测定。冻干样品结果以复溶后质量进行计算，并保留三位有效数字。液相条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（1.7 μm，2.1 mm× 100 mm）；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0—1 min，5%B；8.00 min—9.00 min，90%B；9.00 min—9.50 min，90%B—95%B；9.50 min—11.00 min，95%B；11.00 min—11.01 min，95%B—5%B；11.01 min—13.00 min，5%B；柱温35℃，进样体积5 μL。质谱条件：电喷雾电离源；正离子扫描模式以及负离子扫描模式；多反应监测；离子源温度300℃；碰撞气：氩气；干燥气：氮气；雾化气流速3.0 L·min⁻¹。质谱参数见表1所示。

据《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行统计分析，依照给定显著水平（α = 0.05）计算相应检验统计量F值，若F值小于临界值F_α，表明样品间及样品内无显著性差异，样品是均匀的。

据《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》，考察质控样品在不同环境温度下对其稳定性的影响。采用独立样本t检验法，与初始测量数据进行比较分析，若在显著性水平α = 0.05，t值小于临界值t_α，说明两组之间无显著差异，在对应条件下样品是稳定的。

按《标准物质定值的通用原则及统计学原理》相关要求，将冻干质控品随机送往10家实验室，每家实验室平行测定4次，汇总各家实验室数据。对汇总数据采用SPSS 26.0统计软件进行正态性分析，采用格拉布斯法（Grubbs检验）分析10家实验室测定结果平均值中最大值与最小值是否为离群值，采用科克伦等精度检验法（Cochran）对实验室内变异进行考察，对最大标准差进行检验。经检验合格后，最终测定结果平均值作为该质控样品的参考值。

经统计软件SPSS 26.0对各组数据进行方差齐性检验，数据均服从方差齐性检验要求（P＞0.05）；经单因素方差分析表明，测试组中组内自由度为10，组间自由度为9，质控样品中的喷布特罗（F = 1.253）、克伦特罗（F = 1.399）、丙酸睾酮（F = 1.590）、睾酮（F = 1.044）、可的松（F = 1.766）、甲基泼尼松龙（F = 2.543）、氯噻嗪（F = 2.140）、托拉塞米（F = 1.811）的均小于F临界值（F_{0.05（9，10）}= 3.020）。添加的8种兴奋剂在火腿肠中混合均匀。

按稳定性验证的相关要求，冻干质控品在常温（25℃）和高温（37℃）两个条件下存放15 d，每5天测量1次，均与初始测量值进行比较。对各组数据进行正态性检验，结果表明各组数据均服从正态分布（P＞0.05）；经过t检验统计分析，发现0—15 d，常温（25℃）保存环境中，8种兴奋剂的t值范围在0.09—2.03之间，均小于t临界值（2.07）；高温（37℃）保存环境，8种兴奋剂的t值范围在0.29—11.06之间，第5天除甲基泼尼松龙（t = 1.11）、氯噻嗪（t = 1.51）、睾酮（t = 0.29）、丙酸睾酮（t = 0.92）之外，其余兴奋剂t值均大于t临界值（2.07），第10天8种兴奋剂的t值均大于t临界值（2.07）。结果显示，该兴奋剂质控样品在常温（25℃）条件存放15天，稳定性良好；而在高温（37℃）条件下存放15 d，随着时间推移，均出现不同程度降解。表明该质控样品在春秋冬季可采用常温运输，夏季高温环境下应采用低温运输。

将分装的质控品放置在低温（-20℃）条件下6个月，每2个月随机抽取6袋质控品平行测定2次，考察该质控品长期稳定性。所有兴奋剂药物的t值范围在0.182—2.005之间，均小于t临界值（2.07）。结果表明该质控样品在低温（−20℃）下，可保存6个月。

选取10家实验室，按照相关检测方法检测质控品中目标物含量。汇总各实验室测量数据。经分析发现各组数据P值均在0.141—0.725之间（P ＞ 0.05），数据服从正态分布。经格拉布斯检验，质控品中8种兴奋剂实验室数据值的G值在0.185—1.829之间，均＜ G_0.05（2.290），各实验室数据均不存在异常值；经科克伦等精度检验，各组数据C值在0.150—0.302之间，均＜ C_{（0.05, 10, 4）}（0.3733），表明各实验室数据精度良好，无随机误差过大的实验室。2.4兴奋剂质控品不确定度评定

据《测量不确定度评定与表示》对质控品不确定度进行评定。分析质控品从制备到定值过程中产生的不确定度；汇总对质控样品影响较大的不确定度来源以及置信水平P = 95%，包含因子k = 2的扩展不确定度U_P。本质控样品不确定度来源有4个方面：均匀性（u_bb）、长期（u_lts）和短期（u_sts）稳定性以及定值测定（u_char）。由于质控品是协同定值，短期稳定性存在实验室的测量数值中，故短期稳定性不确定度（u_sts）为0。不确定度分析结果见表2。

据《测量不确定度评定与表示》，本质控品在置信区间P = 95%，k = 2条件下，定值表示结果：喷布特罗（5.69±0.412）μg·kg⁻¹、克伦特罗（2.96±0.270）μg·kg⁻¹、丙酸睾酮（12.7±1.642）μg·kg⁻¹、睾酮（12.6±1.633）μg·kg⁻¹、可的松（9.85±1.145）μg·kg⁻¹、甲基泼尼松龙（5.92±0.534）μg·kg⁻¹、氯噻嗪（13.2±1.721）μg·kg⁻¹以及托拉塞米（17.5±2.341）μg·kg⁻¹.

将制备的兴奋剂质控品随机编号成考核盲样，采用农业部1025号公告-18-2008和农业部1031号公告-1-2008两个标准方法进行检测，用于实验室8名检测人员的喷布特罗、克伦特罗、丙酸睾酮、睾酮的操作水平考核。结果显示，8份考核盲样共32个检测项目回收率在70.8%—104.2%，回收率＞ 80% 有30个项目，正确率为93.7%。

本研究建立的多种食源性兴奋剂质控品制备方法，以火腿肠为制备基质，添加喷布特罗、克伦特罗、丙酸睾酮等8种兴奋剂标准物质，采用冷冻干燥技术制得不同含量的兴奋剂冻干粉质控样品，并采用单因素方差分析、t-检验、Grubbs检验以及Cochran检验考察质控品特性值。该方法制备流程简单，具备一套系统化分析验证流程，并将统计学分析方法较好的运用于质控样品评价体系及性能验证。本方法研制的质控品中各药物具备良好的均匀性，在低温环境中可长期保存，并运用于实验室日常检测、实验室能力验证以及快速检测等领域。