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溴系阻燃剂因其具有环境持久性、生物蓄积性和生物毒性等而被禁止使用[1]。与溴系阻燃剂相比，有机磷阻燃剂(organophosphorus flame retardants，OPFRs)具有较好的润滑、阻燃、增塑效果而被广泛应用，成为溴系阻燃剂的替代品[2]。有机磷阻燃剂作为一种人工合成的工业有机添加剂[3-4]，广泛应用在各种商业及工业领域中，如电子设备，建筑材料，纺织品，油漆，家具等[5-7]。OPFRs主要以物理形式添加到材料中，在使用过程中通过挥发、磨损和溶解等方式进入环境[8]，导致OPFRs广泛存在于水[9]、灰尘[10]、空气[11]和沉积物[12]等各种介质中。毒理学研究表明，多种OPFRs具有致畸、致癌、致突变风险以及神经毒性作用，即使暴露在低浓度下，长期积累也会对人体造成潜在危害[13]。现阶段，针对多种OPFRs的检测方法较少，因此，研究水体中OPFRs的污染特征并采用科学的方法对其进行检测和风险评价具有重要意义。
本研究筛选出环境中含量较高的27种OPFRs作为研究对象，通过优化固相萃取前处理条件、高效液相色谱-串联质谱仪和气相色谱-质谱联用仪的参数，建立了27种OPFRs的定性和定量分析方法，并对北京市潮白河流域地表水和地下水中OPFRs进行检测；同时，基于美国环境保护局(USEPA)推荐的健康风险评价模型对地表水和地下水中的OPFRs进行人体健康风险评价，旨在为地表水和地下水水体中OPFRs的检测及风险评价提供参考。
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本研究共检测出27种OPFRs标准品，包括10种烷基磷酸酯阻燃剂、3种氯代磷酸酯阻燃剂和14种苯基磷酸酯阻燃剂。
10种烷基磷酸酯阻燃剂包括磷酸三(2-乙基己基)酯(TEHP)、磷酸二(2-乙基己基)酯(BEHP)、磷酸三异丁酯(TiBP)、磷酸三丁酯(TnBP)、磷酸三丙酯(TnPP)、磷酸三异丙酯(TiPP)、磷酸三乙酯(TEP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBEP)、磷酸三己酯(THP)、磷酸三戊酯(TPeP)。3种氯代磷酸酯阻燃剂包括磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(TDCPP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)、磷酸三(2-氯异丙基)酯(TCPP)。14种苯基磷酸酯阻燃剂包括磷酸二苯基甲苯酯(MDPP)、磷酸叔丁基苯二苯酯(BPDP)、磷酸二苄酯(DBPP)、磷酸三邻甲苯酯(o-TTP)、磷酸三间甲苯酯(m-TTP)、磷酸三对甲苯酯(p-TTP)、磷酸三(3,5-二甲基苯基)酯(TDMPP)、磷酸异癸基二苯酯(IDPP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)、磷酸三苯酯(TPhP)、三苯基氧化膦(TPPO)、磷酸异丙基二苯酯(IDDP)、磷酸三(2-异丙基苯)酯(TIPPP)、磷酸三(二甲苯)酯(TXP)。
内标TnBP-d27和TPhP-d15购自上海甄准生物科技有限公司，纯度>99%，使用甲醇配制成标准储备溶液。甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、甲酸均是HPLC级，0.45 μm玻璃纤维滤膜购自上海安谱公司。HLB和MCX固相萃取柱(柱体体积为6 mL，柱填料质量为500 mg)购自美国Waters公司，Envi-18固相萃取柱(柱体体积为6 mL，柱填料质量为500 mg)购自美国Supelco公司。
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仪器与设备包括：高效液相色谱-串联质谱仪(LC-MS8040，日本岛津)、气相色谱(7890A)-质谱(5975C)联用仪(美国安捷伦)、固相萃取仪(Supelco-24位，美国Supelco公司)、旋转蒸发仪(RE-52AA，上海亚荣)和氮吹浓缩仪(KL512J，北京康林公司)。
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2021年4月，采集北京市潮白河4种地表水样品(编号为S1、S2、S3、S4)和4种地下水样品(编号为1#、2#、3#、4#，取自地下30 m)，置于棕色玻璃瓶内，避光运送至实验室进行前处理。准确量取经0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤后的水样2 L，并加入内标物TnBP-d27和TPhP-d15(500 ng·L−1)。
高效液相色谱-串联质谱仪检测样品固相萃取过程：HLB和MCX固相萃取柱使用前依次用5 mL乙腈、甲醇和超纯水进行活化，水样以5~10 mL·min−1的流速通过固相萃取柱。富集结束后，用10 mL的乙腈分两次洗脱，洗脱液经过16 g无水硫酸钠进行脱水，并于50 ℃下旋转蒸发和氮吹浓缩至0.5 mL，保存在4 ℃冰箱中待测。
气相色谱-质谱联用仪检测样品固相萃取过程：HLB和Envi-18固相萃取柱使用前依次用5 mL二氯甲烷、甲醇、超纯水进行活化，水样以5~10 mL·min−1的流速通过固相萃取柱。富集结束后，HLB固相萃取柱用二氯甲烷和甲醇混合液(体积比9∶1)10 mL分2次进行洗脱，Envi-18固相萃取柱用正已烷和二氯甲烷混合液(体积比7∶3)10 mL分2次进行洗脱。洗脱液经过20 g无水硫酸钠进行脱水，并于40 ℃下用旋转蒸发仪和氮吹仪浓缩至0.2 mL，保存在4 ℃冰箱中待测。
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LC-MS8040条件：高效液相色谱柱(C18柱，Inert Suatain C18 column，150 mm×4.6 mm，5 μm，Tokyo，Japan)；柱温40 ℃，进样体积10 μL，流动相为甲醇和含10 mmol·L−1甲酸的水溶液。梯度洗脱程序为：0~6 min，甲醇由80%升至95%，6~15 min，甲醇由95%降至80%。质谱条件选用正离子模式电喷雾离子源(ESI+)，多反应监测模式(MRM)，雾化气流速为3 L·min−1，干燥气流速为15.0 L·min−1，去溶剂温度为250 ℃，加热区温度为400 ℃。在ESI+模式下确定20种OPFRs的母离子，并在MRM模式下优化质谱参数，20种目标物的主要参数如表1所示。
高效液相色谱-串联质谱仪采用二级质谱，与气相色谱-质谱联用仪采用单级质谱相比具有更低的检测限。但是，磷酸三(2-乙基己基)酯和磷酸二(2-乙基己基)酯在上述梯度洗脱条件下有残留，磷酸叔丁基苯二苯酯未出峰，磷酸二苄酯检测限较高，而磷酸三邻甲苯酯、磷酸三间甲苯酯、磷酸三对甲苯酯3种同分异构体母离子和定量离子相同，出峰时间相同，无法区分，故不能检测，这7种OPFRs采用GC-MS进行检测。
GC-MS条件：HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为高纯氦气，流量为1.0 mL·min−1。进样口温度为280 ℃，进样量为1 µL，不分流进样。采用程序升温：初始温度40 ℃，保持2 min；以5 ℃·min−1升温至290 ℃，保持8 min，总运行时间为60 min。质谱条件为电子轰击离子源(EI)，选择离子监测模式(SIM)，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为280 ℃。7种OPFRs在GC-MS中的参数如表2所示。
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在实验过程中配制不同浓度梯度的混合标准溶液(0、10、40、100、200、400 ng·L−1)，用固相萃取柱富集后进行检测，以OPFRs峰面积作为横坐标，浓度作为纵坐标，绘制标准曲线。所有目标化合物在此范围内线性良好，可决系数(R2)均大于0.99。方法检出限(LODs)和方法定量限(LOQs)分别以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)进行计算。27种OPFRs的方法检出限为0.02~2.53 ng·L−1；定量限为0.06~8.43 ng·L−1；回收率为65.82%~108.48%；RSD为2.4%~10.6%，结果见表3。
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采用美国环境保署(USEPA)提出的健康风险评价模型[14-15]，对北京市潮白河地表水和地下水中的OPFRs的健康风险进行评价。
人群通过饮用水摄入OPFRs 的日均暴露量(ADD)，计算方法[16]如式(1)所示。
式中：EADD为OPFRs的日均暴露量，ng·(kg·d)−1；c为水体中的OPFRs的浓度，ng·L−1；QIR 为日均饮水量，L·d−1；SAP 为饮水摄入量的吸收率，取 SAP 为100%；mBW为平均人体质量，kg。水中OPFRs的成人暴露风险计算参数引自《中国人群暴露参数手册(成人卷)：概要》[17]，儿童暴露风险指标来源于已有研究中的参数[18]。
危害商(HQ)表示人群通过饮用水摄入OPFRs的非致癌风险，计算方法如式(2)所示。
式中：RHQ为人群通过饮用水摄入OPFRs的非致癌风险值；NRfD为USEPA对每个OPFRs的参考剂量值, ng·(kg·d)−1，表示在单位时间、单位质量摄取的不会引起人体不良反应的污染物最大量，用无不良反应水平(NOVEL)除以安全系数(10 000)计算[19]。当RHQ>1时，表示存在非致癌健康风险；当RHQ<0.1时，认为非致癌风险较小或忽略不计。
人群通过饮用水摄入OPFRs的致癌风险(CR)计算方法如式(3)所示。
式中：HCR为人群通过饮用水摄入OPFRs的致癌风险值；CSFO为致癌斜率因子，ng·(kg·d)−1，用来评估与接触致癌物或潜在致癌物相关的致癌风险[20]。当HCR>1×10−6时，表示存在致癌风险；当HCR<1×10−6时，表示致癌风险可以忽略不计；当HCR为10−6~10−4时，具有潜在的致癌风险；当HCR>10−4时，则认为具有高致癌风险。
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目前，固相萃取柱包括OasisHLB、OasisMCX、Envi-18、C18、PEP等不同型号[21]。HLB和MCX固相萃取柱对于极性较强的物质萃取效果更好，并且MCX柱对碱性化合物具有较好的保留作用，Envi-18含有大量的十八烷基，含碳量大于17%，对弱极性物质有较好的富集效果。因此，选取HLB和MCX作为LC-MS/MS的前处理SPE柱，选取HLB和Envi-18作为GC-MS的前处理SPE柱。
HLB和MCX单个固相萃取柱以及两者串联之后的实验结果见图1。由图1可以看出，回收率分别为54.33%~93.40%、65.82%~102.14%、70.60%~110.27%，HLB柱串联MCX柱对OPFRs的萃取效果相对较好，其次是MCX固相萃取柱。单个MCX柱和两者串连起来的回收率相差不大，故本实验水样前处理选择MCX柱。
HLB和Envi-18单个固相萃取柱以及两者串联之后的GC-MS实验结果见图2。由图2可以看出，7种OPFRs的富集效果均较好，回收率分别为72.52%~88.29%、76.86%~94.90%、86.38%~108.48%。HLB和Envi-18串联后的回收率明显高于单个固相萃取柱，故选择HLB串联Envi-18用于水样前处理。
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本研究分别以等度洗脱(80%甲醇-水、90%甲醇-水、100%甲醇)和梯度洗脱作为流动相进行检测，结果如图3所示。100%甲醇等度洗脱与80%甲醇-水和90%甲醇-水等度洗脱相比，12种OPFRs的响应强度提高了2~4倍。采用0~6 min甲醇由80%升至95%，6~15 min甲醇由95%降至80%的梯度洗脱，7种OPFRs的响应强度比100%甲醇等度洗脱提高了2~4倍。通常，LC-MS/MS在正离子模式下，加酸可以提高其响应强度 [22]，因此，本研究探讨了含10 mmol·L−1甲酸的水溶液作为流动相进行梯度洗脱的实验效果，发现15种OPFRs的响应强度进一步提高了2~4倍，故选择甲醇和含10 mmol·L−1甲酸的水溶液作为流动相进行检测。
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在北京市潮白河流域地表水和地下水进行布点采样，采用表3中所列OPFRs检测方法对水样中的OPFRs进行了检测。除TIPPP、IDPP、BPDP和DBPP等4种物质未检出外，其余23种OPFRs均有检出，质量浓度为0~973.17 ng·L−1，测定结果如表4所示。地表水S1、S2、S3、S4的总质量浓度分别为1071.26、762.20、262.39和722.10 ng·L−1，其中S4的TEP(459.90 ng·L−1)质量浓度相对较高，其次是S1的TnPP(315.47 ng·L−1)和TiPP(298.41 ng·L−1)。在地下水1#、2#、3#、4#监测井中，OPFRs的总质量浓度分别为772.16、1 913.40、749.60、1 101.24 ng·L−1，其中1#(376.85 ng·L−1)和2#(973.17 ng·L−1)的TEHP质量浓度相对较高，其次是2#的TnPP(208.83 ng·L−1)。在8个采样点中，TEHP、TEP、TnPP、TiPP质量浓度相对较高，分别为23.04~973.17、7.48~459.90、29.30~315.47和10.34~298.41 ng·L−1。TnPP和TEP主要用于建筑材料中的阻燃剂，其易溶于水，极性强，辛醇水分配系数
(lgKow) 分别为1.87和0.80[23]，这可能导致其在水体中的质量浓度偏高。李栋等[24]对长江南京段水源水中13种OPFRs进行过检测，ƩOPFRs质量浓度为85.21~1 557.96 ng·L−1 。XING等[6]的检测结果表明，骆马湖地表水水样中12种 ƩOPFRs质量浓度为97.1~1 066.00 ng·L−1，此结果与本研究结果接近。 -
目前，有13种OPFRs能查到其RfD值，包括TEP、TnBP、TDCPP、TPHP、EHDPP、o-TTP、m-TTP、p-TTP、TCEP、TCPP、TBEP、TPPO和TEHP。有4种OPFRs能查到其SFO值，包括TCEP、TCPP和TnBP、TEHP [14]。年龄段和性别的不同导致人群通过饮用水摄入OPFRs的日均暴露剂量也不一样，男性略高于女性，男性儿童略高于女性儿童。按照男性儿童、男性成人、女性儿童、女性成人分别计算健康风险，计算参数如表5和表6所示。由式(1)~式(3)计算得出，13种OPFRs的非致癌风险值为0~6.17×10−4，4种致癌风险值为1.37×10−9~1.07×10−7。同时，以平均暴露(8个样点平均质量浓度)和高暴露(8个样点最大质量浓度)分别计算其致癌风险和非致癌风险。
由图4可知，男性儿童、男性成人、女性儿童、女性成人在平均暴露和高暴露条件下，OPFRs非致癌风险值(HQ)分别为6.41×10−6~1.99×10−4和1.61×10−5~6.17×10−4。在高暴露条件下，TBEP是非致癌风险最高的物质，按照男性儿童、男性成人、女性儿童、女性成人分类，分别为6.07×10−4、6.17×10−4、5.95×10−4、5.30×10−4；在平均暴露条件下，TnBP非致癌风险值相对较高，分别为3.93×10−4、3.99×10−4、3.84×10−4、3.43×10−4。TnBP极性较弱，其疏水性较高、吸附性较强，易吸附于悬浮物进入水体中，从而在水体中容易富集[25]。TBEP和TCPP非致癌风险值分别为1.32×10−4~1.54×10−4和1.22×10−4~1.42×10−4。TBEP主要作为橡胶制品中的改性剂和增塑剂，在我国地表水中检测频率较高，具有一定的生殖毒性，会对激素受体基因表达产生一定的干扰[13]。虽然氯代有机磷阻燃剂对人体的非致癌风险值小于阈值，但是其具有神经毒性、内分泌干扰性、致癌性等多种毒性，对人体健康有着较高的危害，已被WHO列为致癌物之一 [26-27]，并且在环境中不易降解、污水处理厂无法有效去除、环境中持续时间更长 [28]。在平均暴露和高暴露条件下，非致癌风险值小于风险阈值，表明北京潮白河地表水和地下水中OPFRs对人体非致癌风险较低。但是，OPFRs在环境中会通过皮肤、灰尘、呼吸等方式进入体内，同时OPFRs之间可能具有毒性加和效应，仍然需要继续关注其不同途径的暴露情况[19]。
如图5所示，在平均暴露和高暴露条件下，OPFRs致癌风险值分别为5.24×10−9~2.32×10−8和1.00×10−8~1.07×10−7，其致癌风险值明显低于致癌(CR)风险阈值(1.0×10−6)。在高暴露条件下，TEHP较其他3种OPFRs致癌风险值最高，为9.18×10−8~1.07×10−7，其次是TnBP，为3.10×10−8~3.60×10−8。由此可知，在高暴露条件下，虽然致癌风险值和非致癌风险值小于风险阈值，但是TEHP致癌风险值已经达到1×10−7，需要对其进行重点监控[29]。
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1)在27种OPFRs中，有20种OPFRs采用LC-MS/MS进行检测，定量限为0.08~1.04 ng·L−1，回收率为65.82%~110.27%；有7种OPFRs采用GC-MS进行检测，回收率为86.38%~108.48%，定量限为1.31~8.43 ng·L−1。27种OPFRs检测方法线性关系良好，可决系数(R2)均大于0.99，RSD为2.4%~10.6%。
2)在8种水样中，除TIPPP、IDPP、BPDP和DBPP未检出外，其余23种OPFRs均有不同程度检出。其中TEHP、TEP、TnPP、TiPP质量浓度相对较高，分别为23.04~973.17、7.48~459.90、29.30~315.47和10.34~298.41 ng·L−1。
3) 13种OPFRs的非致癌风险值为0~6.17×10−4，4种OPFRs致癌风险值为1.37×10−9~1.07×10−7，OPFRs产生的人体健康风险处于较低水平。在高暴露条件下，TBEP非致癌风险值为6.17×10−4， TEHP致癌风险值为1×10−7，非致癌风险和致癌风险均处于较低水平。
水体中27种有机磷阻燃剂(OPFRs)的检测及风险评价
Determination and risk assessment of 27 organophosphorus flame retardants (OPFRs) in water
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摘要: 有机磷阻燃剂(organophosphorus flame retardants，OPFRs)具有致畸、致癌、致突变风险以及神经毒性作用。为了更好地研究其存在水平和健康风险，建立了固相萃取与高效液相色谱-串联质谱仪和气相色谱-质谱联用仪检测水体中27种OPFRs的分析方法，并对OPFRs进行了健康风险评价。20种OPFRs采用MCX固相萃取柱预处理和LC-MS/MS进行检测，以甲醇和含10 mmol·L−1的甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，7种OPFRs采用HLB串联Envi-18固相萃取柱进行预处理并利用GC-MS进行检测。检测结果表明，27种OPFRs的检出限为0.02~2.53 ng·L−1；定量限为0.06~8.43 ng·L−1；回收率为65.82%~108.48%。2021年4月份，采集北京市潮白河地表水和地下水8个水样并检测其OPFRs。实测结果表明：除磷酸三(2-异丙基苯)酯、磷酸异癸基二苯酯、磷酸叔丁基苯二苯酯、磷酸二苄酯外，其余23种OPFRs均有不同程度检出，质量浓度为0~973.17 ng·L−1；磷酸三(2-乙基己基)酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯、磷酸三异丙酯含量相对较高，分别高达973.17、459.90、315.47、298.41 ng·L−1。采用USEPA模型对水样中的OPFRs进行了健康风险评价， 13种OPFRs的非致癌风险值为0~6.17×10−4，4种OPFRs致癌风险值为1.37×10−9~1.07×10−7；在高暴露条件下，OPFRs的非致癌风险值为1.61×10−5~6.17×10−4，致癌风险值为1.00×10−8~1.07×10−7，均低于风险阈值。上述结果说明，水体中OPFRs产生的健康风险处于较低水平。此次采集的潮白河地表水和地下水水中OPFRs的致癌风险和非致癌风险均处于较低水平。本研究结果可为地表水和地下水水体中OPFRs的检测及风险评价提供参考。
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关键词:
- 有机磷阻燃剂(OPFRs) /
- 高效液相色谱-串联质谱仪 /
- 气相色谱-质谱联用仪 /
- 固相萃取 /
- 风险评价
Abstract: Organophosphorus flame retardants (OPFRs) have been demonstrated to be teratogenic, carcinogenic, mutagenic and neurotoxic. In order to better study its existing level and health risks, the analytical methods with solid-phase extraction (SPE) pretreatment followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) were developed to determine 27 OPFRs in the surface and ground water, and their health risk assessment was performed. Twenty OPFRs were determined by MCX cartridge pretreatment coupled by LC-MS/MS method, and gradient elution was performed using methanol and 10 mmol·L−1 formic acid as the mobile phases in the positive mode. Seven OPFRs were determined by GC-MS method with HLB and Envi-18 double cartridge pretreatment. The results showed that the detection limit (LODs), quantitation limit (LOQs) and recoveries for the 27 OPFRs were 0.02~2.53 ng·L−1, 0.06~8.43 ng·L−1, and 65.82%~108.48%, respectively. In April 2021, eight samples from the surface and ground water in Chaobai River, Beijing were collected, and the concentrations of 27 OPFRs in these samples were analyzed. in which only 4 kinds of OPFRs, namely Tri-(2-isopropyl phenyl) phosphate(TIPPP), Isodecyl diphenyl phosphate(IDPP), Tertbutyl phenyl diphenyl phosphate(BPDP) and Dibenzyl phosphate(DBPP) were undetectable, the rest of 23 OPFRs was detected with the concentration range of 0~973.17 ng·L−1, and relative high concentrations for Tris (2-ethylhexyl) phosphate(TEHP), Tri-ethyl phosphate(TEP), Tri-propyl phosphate(TnPP), Tri-isopropyl phosphate(TiPP) were 973.17, 459.90, 315.47, 298.41 ng·L−1, respectively. The health risks posed by OPFRs in Chaobai River water environment were evaluated using the USEPA health risk assessment model. The non-carcinogenic risk values of 13 OPFRs were in the range of 0~6.17×10−4, whereas the carcinogenic risk values of 4 OPFRs were in the range of 1.37×10−9~1.07×10−7. At the high exposure concentrations, the non-carcinogenic risk values of the above 13 OPFRs were in the range of 1.61×10−5~6.17×10−4, the carcinogenic risk values of 4 OPFRs were in the range of 1.00×10−8~1.07×10−7, they were below the low risk threshold, indicating that the health risk caused by OPFRs in Chaobai River surface and ground water was at a low level. The carcinogenic risk and non-carcinogenic risk of OPFRs in Chaobai River surface water and groundwater collected are at a low level. This study can provide a reference for the detection and risk assessment of OPFRs in surface water and groundwater. -
我国是全球最大的锰资源消耗和进口国，截至2020年，我国约有矿床230座，锰矿石探明储量约2.1×109 t[1]。自2017年以来，诸多中小锰矿区纷纷停产、停业，遗留了大量锰尾矿渣[2]，经侵蚀、风化和自然雨水淋溶后，尾矿渣中所含重金属元素进入周边的地表水、地下水、土壤等，造成大范围的植被破坏和水土流失，对矿区周边的生态环境和人畜健康造成严重的危害[3-4]。植物修复作为一种绿色原位土壤修复技术，通过植物根系吸收、挥发、转化、固定或降解重金属和有机污染物，具有成本低、效果好、生态学价值高等特点，已逐步成为修复重金属污染场地的重要手段之一[5-6]。
锰矿植物修复研究主要涉及两类植物，一类是以草本居多的超富集植物：如商陆(Phytolacca americana)[7]、莎草(Cyperus rotundus)[8]和铁杆蒿(Artemisia sacrorum)[9]等，另一类是以木本为主的耐性或抗性植物，这类植物对重金属的富集虽不及超富集植物，但对污染物具有很强的耐受性或抗性，代表植物有夹竹桃(Nerium oleander)、栾树(Koelreuteria paniculata)和泡桐(Paulownia tomentosa)等[10]。目前发现的锰的超富集植物大多数是草本植物，存在个体矮小、生物量小和生长周期短等缺陷，重金属富集的总量少，对水土的保持能力弱，在大规模工程应用中有较大的局限性。木本植物生物量大、生长速度快、生长周期长，并且具有发达的根系网络，能快速、高效地恢复地表的植被覆盖，减少水土流失，在吸收、积累重金属的同时还能在一定程度上钝化、固定重金属，尤其适用于较大矿区的重金属污染治理与生态恢复工程[11-12]。
锰矿渣颗粒较细、结构松散、透气性和持水性能差，养分也极易流失，普通植物很难在尾矿中生存[13-14]。本实验室前期进行了大量木本植物和改良剂的筛选工作，发现栾树和凹凸棒＋蘑菇渣复合改良剂用于修复锰尾矿重金属污染具有明显优势[15]。目前，对栾树等耐性植物的相关研究主要集中在植物自身对重金属的生理响应机制[16-18]，而对根际环境的影响机制研究很少。根际是植物-土壤-微生物进行物质交换和信息传递的热区，根际土壤性质和微生物是影响植物修复效果的2个重要因素[19]。土壤肥力和其他理化性质对于植物的生长起到决定性的作用，土壤微生物可通过自身的解毒机制降低重金属的毒性，一方面促进根系分泌物对重金属的生物固化，改善土壤微环境、优化植物根际并提高重金属的可利用度，另一方面微生物通过分泌铁载体、有机酸等物质促进植株的生长发育，提高金属耐受性和吸收量[20-21]。
鉴此，本研究以湖南省某锰尾矿区矿渣作为基质，以栾树(Koelreuteria paniculata)为供试植物，以有机蘑菇渣(spent mushroom compost, SMC)与无机凹凸棒粉(attapulgite, ATP)为改良材料，构建中试模拟矿山实验装置，探究改良矿渣下栾树对锰矿渣的植物修复效果和根际微环境响应，旨在为锰尾矿区的生态修复提供科学数据和技术经验。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
栾树(Koelreuteria paniculata)购自浏阳柏加苗木基地，均为高约80 cm的1 a生苗。蘑菇渣(金针菇)购自湖南省某农业基地，主要成分有米糠、麦麸和玉米芯，实验前测得其基本化学特征(表1)。凹凸棒矿粉购自甘肃省某凹凸棒矿区，主要成分为含水镁铝硅酸盐，pH在8左右。锰矿渣取自湘潭市某锰矿尾矿库，Mn、Pb、Zn、Cu、Cd含量较高，均值分别为10 425、3 324、5 861、135、38.21 mg·kg−1。
表 1 蘑菇渣的化学特征Table 1. Chemical characteristics of spent mushroom compostpH 有机质/% TN/(g·kg−1) TP/(g·kg−1) TK/(g·kg−1) 重金属质量分数/(mg·kg−1) Mn Pb Zn Cu Cd 7.25±0.01 52.32±0.25 6.36±0.02 3.05±0.03 8.36±0.01 532±6.22 29±0.61 169±2.42 25±0.28 0.41±0.01 | Show Table
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1.2 中试系统实验设计
模拟矿山玻璃中试装置定制于长沙市红星百货市场，内部长、宽、高为100、100和80 cm，上下均设置导流管，用以引导降雨后形成的表流和潜流，防止雨水在装置内的累积。将锰矿渣或其与改良剂充分混匀后，于2021年1月下旬加入装置，使基质高度达到80 cm。各装置均添加自来水30 L，用塑料薄膜掩盖，活化2个月后测得各装置中基质基本理化性质。设置1个对照组和2个实验组，CK：100%尾矿，无植物；S0：90%尾矿+5%蘑菇渣+5%凹凸棒，无植物；S1：90%尾矿＋5%蘑菇渣+5%凹凸棒，选取长势一致的栾树幼苗于21年3月下旬进行种植，每个装置6株。设置3个平行。
各装置模拟野外环境，只接受自然雨水，定期除草，不额外添加肥料。植物种植前定义为实验前期，前3个月为植物生长稳定期，第6个月定义为中期，第9个月定义为末期。在植物生长各周期，对土壤理化性质和植物生长指标等进行动态监测，实验末期收集植物和土壤基质，处理后进行数据的收集整理与分析。该中试实验于2021年1月至2021年12月在中南林业科技大学苗圃内开展，实验区属亚热带季风气候，气候温和，年平均降雨量约1 500 mm。实验期间，S1组各装置中栾树均正常存活和生长，其根系几乎深入了整个装置的各个土层，尤其是土壤中、上层中的根系十分发达。
1.3 样品处理和分析
1)土壤理化性质及重金属测定。采用重铬酸钾氧化-分光光度法测定有机质含量；采用pH酸度计测定土壤pH；采用三氯化六氨合钴浸提-分光光度法测定阳离子交换量；土壤基质含水率和容重分别采用烘干法和环刀法测得。土壤全氮采用凯氏法测定，速效氮采用扩散皿法；土壤总磷采用碱溶-钼锑抗分光光度法，有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法；土壤总钾采用氢氧化钠熔融-火焰原子吸收分光光度法，速效钾采用浸提比色法。参照关松荫的方法[22]，采用3、5-二硝基水杨酸比色法测定土壤蔗糖酶活性，脲酶通过苯酚-次氯酸钠比色法测得；碱性磷酸酶使用试剂盒进行测定(索莱宝生物科技有限公司)；采用欧共体BCR四步法测定土壤重金属形态。
2)植物生长指标测定。用卷尺测量从土壤表面到植株顶端的距离；栾树根系生长状况用根系扫描仪测定(Win RHIZO PRO 2013, Canada)；采收的植物分为根、茎和叶3部分，在105 ℃下干燥30 min，然后在75 ℃下干燥至恒重，测定其生物量干重。
3)土壤微生物多样性测定。在实验末期采集各装置中土壤，土壤微生物多样性检测委托上海欧易生物医学科技有限公司进行。使用Trimmomatic软件进行去杂。采用Vsearch软件，根据序列相似性将其归为多个OTU，序列相似度大于或等于97%被归为一个OTU单元。使用QIIME软件包挑选出各个OTU的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。16S使用Silva(version138)数据库比对，ITS使用Unite数据库比对。物种比对注释使用BLAST软件。
1.4 数据分析方法
一般实验数据运用Excel 2021进行处理；数据方差分析和显著性检验利用SPSS 22.0软件完成，数据均为3次重复实验的平均值±标准差(n=3)；一般制图采用Origin 2019b软件完成，微生物数据绘图运用欧易云平台完成。
2. 结果与讨论
2.1 实验前后不同处理下基质理化性质差异
从各基质基本理化性质差异(表2)来看，改良剂加入后锰矿渣pH从7.46显著提升到了7.62(P<0.05)。改良矿渣含水率比原矿渣高出约10%，孔隙度高出约9%，同时总氮、总磷、有机质含量和阳离子交换量均有提升，增幅分别为190%、36%、2.5%和43%。矿渣中总钾的含量较高，达到了10.07 g·kg−1，改良剂的加入略微降低了其含量。从各处理间基质主要营养元素有效态含量(图1)比较来看，改良剂的加入对基质有效磷、速效氮和速效钾提升较大，分别比CK提升了124.5%、271.2%和43.1%。从各处理间的基质酶活性(图1)来看，相较于CK组，S0和S1土壤蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的活性得到了极显著的提升(P<0.01)。实验的前期、中期和末期3个阶段中CK组3种土壤酶活性始终处于最低水平，显著低于S1组和S0组(P<0.05)，实验中期和末期呈现S1处理显著高于S0处理的变化趋势(P<0.05)。在3个实验阶段中，S1组和S0组土壤有效磷、速效氮和速效钾含量均在不同程度上高于CK处理组。由此可以看出，添加改良剂后锰矿渣理化性质与肥力条件得到优化。同时，栾树的生长一定程度增强了改良矿渣的水土保持能力，使得营养元素不易随径流流失，增强了其保肥和持水能力。
表 2 实验前后各基质的基本理化性质差异Table 2. Basic physicochemical properties of each substrate处理组 pH 含水率/% 容重/(g·cm−3) 孔隙率/% TP/(g·kg−1) TN/(g·kg−1) TK/(g·kg−1) 有机质/% CEC/(cmol·kg−1) CKb 7.46±0.02a 25.33±1.22a 1.57±0.04a 40.82±1.26b 0.33±0.003a 0.16±0.01a 10.07±0.02a 2.03±0.01a 17.99±0.69a CKa 7.38±0.02b 15.55±0.54b 1.50±0.02b 43.23±0.49a 0.32±0.001a 0.14±0.01b 8.47±0.06b 1.99±0.01b 17.65±0.30a S0b 7.62±0.02a 35.02±1.23a 1.34±0.04a 49.66±1.49a 0.45±0.003a 0.47±0.01a 9.82±0.09a 4.58±0.06a 25.69±0.28a S0a 7.55±0.01b 21.06±1.14b 1.27±0.02a 52.00±0.66a 0.25±0.010b 0.33±0.01b 8.60±0.08b 4.33±0.07b 22.43±0.36b S1b 7.62±0.03b 34.68±1.15a 1.34±0.01a 49.33±0.34b 0.44±0.010a 0.47±0.01a 9.82±0.05a 4.52±0.03a 25.67±0.15b S1a 7.74±0.01a 28.40±1.32b 1.22±0.02b 54.01±0.60a 0.35±0.006b 0.30±0.01b 8.00±0.10b 3.87±0.07b 26.45±0.44a | Show TableDownLoad:
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图 1 不同阶段土壤酶活性和氮、磷、钾有效态含量Figure 1. Changes in soil enzyme activity and available phosphorus, nitrogen and potassium content at three stages2.2 不同处理下基质中重金属去向分析
比较实验前、后各基质中重金属含量变化(表3)可以发现，改良剂的加入使得单位质量的矿渣中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd等重金属的含量呈不同程度的下降，同时各处理在实验后基质中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd的含量均显著下降(P<0.05)，但不同处理组之间的下降幅度有所差异。S1处理基质中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd含量下降幅度要显著低于S0处理(P<0.05)，同时，S1处理在实验前基质中Mn、Pb和Zn含量均低于CK处理的情况下，在实验后Mn、Pb和Zn的含量仍不同程度高于CK处理。
表 3 各基质重金属质量分数Table 3. Content of heavy metal of each substrate重金属 项目 重金属质量分数/(mg·kg−1) CK S0 S1 Mn 实验前 10 910±194.7a 9 448±34.2a 9 453±28.0a 实验后 8 422±12.1b 7 528±20.1b 8 849±34.0b Pb 实验前 3 340±39.2a 3 029±21.4a 3 053±28.5a 实验后 2 612±4.5b 2 320±5.0b 2 738±24.0b Zn 实验前 4 239±13.1a 3 822±6.8a 3 830±13.6a 实验后 3 247±35.6b 3 050±21.2b 3 428±33.4b Cu 实验前 143±3.2a 134±2.1a 135±1.1a 实验后 134±2.2b 124±1.4b 125±2.4b Cd 实验前 34.27±0.40a 30.07±0.15a 29.60±0.26a 实验后 30.50±1.28b 22.93±0.06b 25.27±0.04b 注：同种重金属实验前后不同字母表示不同处理下基质重金属质量分数显著差异(P<0.05)。 | Show TableDownLoad:
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在实验后对栾树根、茎、叶各组织干样中重金属含量进行检测(表4)，可以发现栾树各组织中Mn和Zn的含量较高，在230~1 100 mg·kg−1，说明栾树对其有一定的富集能力，但远未达到超富集植物的标准。而栾树各组织中Pb、Cu和Cd含量较低，在0.5~160 mg·kg−1，表明栾树对这几种重金属的富集能力一般。
表 4 栾树根、茎、叶中的重金属含量Table 4. Heavy metal content in roots stems, and leaves of Koelreuteria Paniculata重金属 重金属质量分数/(mg·kg−1) 根 茎 叶 Mn 922.3±16.8 357.5±33.7 1 116.5±2.8 Pb 10.3±0.1 1.3±0.1 163.4±9.8 Zn 295.7±20.2 237.5±6.5 234.6±0.6 Cu 27.0±1.5 7.4±0.4 16.9±0.3 Cd 0.55±0.13 0.61±0.04 0.81±0.03 | Show TableDownLoad:
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通过各处理基质中重金属的去向(表5)可以发现，栾树对基质中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd的吸收总量占比非常小，在0.001%~0.026%，而不同处理中几种重金属随径流的流失量比例差异明显，普遍在6%~23%，大量的重金属会随雨水径流流失。S1处理中Mn、Pb、Zn 3种重金属的径流流失量比例显著低于(P<0.05)锰矿渣(CK)和改良锰矿渣(S0)，较CK处理分别下降约6%、11%和13%，较S0处理分别下降约4%、13%和10%。各处理基质中Cu的径流流失量比例均无显著差异(P>0.05)。另外值得注意的是，改良剂的加入使得S0处理中Cd的径流流失量比例显著高于CK处理(P<0.05)。
表 5 各处理基质中重金属占比Table 5. Distribution of heavy metal of each substrate重金属 处理组 重金属占比/% 基质留存量 植物吸收量 径流流失量 Mn CK 77.216±1.50c — 22.784±1.50a S0 79.686±0.50b — 20.314±0.50b S1 93.608±0.60a 0.004±0.00 16.495±0.59c Pb CK 78.213±1.01b — 21.786±1.01a S0 76.589±0.40b — 23.411±0.40a S1 89.691±1.62a 0.001±0.00 10.308±1.62b Zn CK 76.586±1.02c — 23.414±1.02a S0 79.814±0.69b — 20.186±0.69b S1 89.487±0.73a 0.003±0.00 10.510±0.73c Cu CK 93.503±1.35a — 6.497±1.35a S0 92.324±1.76a — 7.676±1.76a S1 92.809±1.93a 0.006±0.00 7.394±1.93a Cd CK 88.949±3.05a — 11.051±3.05b S0 76.331±0.60b — 23.669±0.60a S1 85.372±2.07a 0.026±0.00 14.625±2.07b 注：同列不同字母表示不同处理下该种重金属总量显著差异(P<0.05)；利用实验前、后各基质中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd的含量和基质容重分别求得实验前、后重金属的总量，相减得到各装置中损失的重金属的量(主要包括植物吸收量和径流流失量)，实验后装置中重金属总量记为基质留存量。S1处理中栾树对不同重金属的吸收总量由根、茎、叶各部分的干重及其重金属含量求得，径流流失量(重金属随表流和潜流雨水的流失总量)利用实验前基质重金属总量减去植物吸收量和基质留存量求得，所有数据均利用百分比进行归一化处理。 | Show TableDownLoad:
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在实验后对各处理基质中重金属形态进行分析(图2)，可以直观地看出，CK和S0处理之间Mn、Pb、Zn3种重金属各形态分布占比总体差异较小。S1处理与CK和S0处理对比，最显著的差异反映在重金属残渣态比例的提高上，S1处理中Mn、Pb、Zn重金属残渣态的比例比S0处理分别高出5.73%、13.52%和6.47%，比CK处理分别高出4.98%、12.81%和6.01%。同时可以发现，S1处理中Cd的残渣态和可还原态较CK处理均显著升高(P<0.05)。各基质中Cu绝大部分以残渣态和可氧化态存在，可交换态和可还原态比例不足5%。上述结果表明，栾树的种植和改良剂的添加在实验后可以显著提高锰矿渣中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd的残渣态比例(P<0.05)，减少矿渣中这几种重金属随雨水径流的流失量，对矿渣中重金属的流失达到了较好的拦截效果。
图 2 各基质Mn、Pb、Zn、Cu和Cd不同形态分布Figure 2. Distribution proportions of heavy metals Mn、Pb、Zn、Cu and Cd of each substrate2.3 不同处理下基质中微生物群落的多样性
3个处理组的9个土壤样本细菌和真菌分别注释得到了17 543个和1 563个可操作单元(OTUs)，样本生物覆盖率均在96%以上，测试结果能够反映样本真实情况，测序合理。主坐标轴分析(PC0A)(图3)中同组土壤样本均很好地聚类在一起，各样本组内相似性好，组间区分度高。各处理组基质细菌群落结构在门水平上差异不大，主要优势种群有变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、单芽孢菌门(Gemmatimonadota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)。各处理组基质中真菌门水平群落结构差异非常明显，3组土壤真菌主要由担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)和壶菌门(Chytridiomycota)组成。其中，担子菌门在3组间存在显著差异(P<0.01)，在CK、S0和S1处理中占比分别为9.06%、76.18%和51.66%。另外2个分布差异较大的是子囊菌门和接合菌门，子囊菌门在3组中占比分别为60.13%、18.71%和28.21%，接合菌门占比分别为23.10%、3.11%和2.00%。土壤微生物群落α多样性指数分析结果(表6)表明，细菌方面：对于chao1指数和observed-species指数，S0和S1处理群落物种数量无显著差异(P>0.05)，均显著多于CK处理(P<0.05)。由simpson指数可以看出，各处理间物种丰富度无显著差异(P>0.05)；真菌方面：CK和S1处理群落物种数量无显著差异(P>0.05)，均显著多于S0组(P<0.05)，且S0组物种丰富度显著低于其他2个处理(P<0.05)。S0和S1处理细菌群落α多样性无显著差异(P>0.05)，在真菌群落上差异显著(P<0.05)。
表 6 土壤微生物群落α多样性指数Table 6. α diversity index of soil bacterial community微生物 处理组 chao1指数 goods_coverage指数 observed_species指数 Simpson指数 细菌 CK 3 890.44±561.08b 0.982 0±0.002 4a 2 860.30±468.34b 0.967±0.034 8a S0 6 353.55±458.40a 0.969 9±0.002 4b 4 816.40±387.44a 0.995±0.000 2a S1 6 845.26±372.30a 0.966 7±0.001 2b 5 057.53±486.56a 0.995±0.000 8a 真菌 CK 380.34±30.25b 0.999 39±0.000 22a 338.30±41.05a 0.88±0.06a S0 326.59±59.23b 0.998 84±0.000 23b 224.27±39.14b 0.67±0.12b S1 477.47±31.41a 0.99859±0.000 01b 392.03±37.15a 0.77±0.07a | Show TableDownLoad:
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2.4 基质微生物群落、重金属以及环境因子间的相关性
由细菌优势属丰度热图(图4(a))可以看出，各处理间优势属差异较为明显。S1处理丰富度较高的属有变形菌门下的CCD24、Bacteriap25和Acidibacter属以及酸杆菌门下的Subgroup_7属。斯皮尔曼相关性分析((图4(b))显示，S1处理独有的优势属CCD24与bacteriap25聚类，与基质蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶和pH存在极显著正相关关系(P<0.01)。Acidibacter和Subgroup_7在S0与S1组中均为优势属。Subgroup_7与基质蔗糖酶、脲酶和pH显著正相关(P<0.05)，有研究表明，酸杆菌门下subgroup_7属丰度往往与土壤pH呈正相关关系[23]，这与本研究的结果是一致的。Acidibacter属被认为是具有分解蛋白质和摄取环境周围酸性物质的有益菌菌属[24]，其与基质碱性磷酸酶、有机质、总氮和pH呈显著正相关性(P<0.05)，Nitrospira(硝化螺旋菌属)是土壤中的潜在有益菌，可促进土壤化学循环，保持土壤肥力[25]，其与图中所有环境因子均呈正相关性，但不显著(P>0.05)。此外，CK处理中独有的优势属Sulfurifustis和S0134_terrestrial_group与基质酶活性和pH呈不同程度显著(P<0.05)或极显著负相关(P<0.01)。
图 4 基质细菌群落在属水平上相对丰度差异及其与环境因子相关性分析Figure 4. Difference in bacterial community at genus level and correlation analysis of environmental factors在真菌 top15 优势属中(图5(a))，各处理间的差异十分明显，CK 处理中丰度较高的达到了 11 个，S0 处理丰富度较高的仅有子囊菌门下的 Thermomyces (嗜热真菌属)。斯伯尔曼相关性分析结果表明(图5(b))，S1组中丰富度较高的优势属分别为子囊菌门下 Neurospora (脉孢菌属)和 Thermomyces (嗜热真菌属)以及担子菌门下的 Guehomyces (低温酵母属)和 Coprinus (鬼伞属)，这 4 个优势属聚类在一起，与基质蔗糖酶、脲酶、碱性碱性和 pH 在 P<0.01 或P<0.05 水平上呈显著正相关，与基质总氮、总磷和有机质含量呈不同程度的正相关关系(P>0.05)。
图 5 基质真菌群落在属水平上相对丰度差异及其与环境因子相关性分析Figure 5. Difference in fungal community at genus level and correlation analysis of environmental factors为了进一步探究导致不同处理下装置系统对重金属的拦截效果产生差异的因素，我们对各处理下基质中 Mn、Pb、Zn、Cu、Cd 流失量的百分比与基质理化性质进行了皮尔逊(Pearson)相关性分析，结果如图6 所示。可以发现，Mn、Pb、Zn 随雨水径流的流失量与基质 pH、蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶活性呈不同程度显著负相关(P<0.05)和极显著负相关关系(P<0.01，P<0.001)，与基质总氮、总磷和有机质含量等呈负相关关系(P>0.05)。同时可以发现，Cu 的流失量与图中所有环境因子均无显著相关性(P>0.05)。Cd 的流失量与基质总氮显著正相关(P<0.05)，与有机质含量极显著正相关(P<0.01)，但与基质总磷量含量表现出显著的负相关性(P<0.05)。上述数据表明，pH 和土壤酶活性的提升能够显著减少锰矿渣中 Mn、Pb、Zn 随雨水径流的流失、Cd 的流失与基质不同营养元素含量表现出不同程度的正、负显著相关性，而基质理化性质的改变对 Cu的流失量影响不大。
图 6 基质重金属流失量与环境因子相关性分析Figure 6. Correlation analysis of environmental factors and loss of heavy metals in substrate3. 讨论
3.1 改良剂的加入和栾树的生长对锰矿渣肥力和持水性的提升
锰尾矿渣中Mn、Pb、Zn、Cu和Cd等重金属含量均远超背景值，土壤易板结，保水能力差，可供植物利用的有效态的氮、磷、钾含量低，是限制植物在锰尾矿渣中正常生长的主要因素[26]。实验前，蘑菇渣和凹凸棒改良剂的加入使得矿渣的氮、磷、钾总量及其有效态含量、有机质、土壤阳离子交换量和含水率均得到不同程度的提升。本研究中蘑菇渣和凹凸棒改良剂的加入可改善锰矿渣的土壤结构和肥力。这与前人的研究结果一致[27-28]。土壤中蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的活性能够很好地反映土壤肥力和质量[29]，在实验的中期和末期，各处理下基质中3种土壤酶活性差异显著，表现出S1>S0>CK的趋势。同时，S1和S0处理的土壤氮、磷、钾有效态均能保持在明显高于CK处理的水平。不难看出，改良剂的加入和栾树的生长在整个实验阶段较好地维持了矿渣的肥力，提高了其持水能力。
值得注意的还有2点：第一，相较于有栾树生长的S1处理，实验过程中S0处理(改良锰矿渣)中氮、磷、钾元素和有机质的流失量偏大，表明单纯改良剂的加入能在短时间内提升矿渣肥力，但植物的生长是维系土壤肥力的重要因素，而栾树地下部发达的根系和地上部植被的覆盖能对矿渣水土的保持产生了积极作用，进而减少矿渣中水分和营养元素的流失；第二，锰矿渣和改良锰矿渣中的K元素极易流失，在长期的修复过程要注意钾肥的补充。
3.2 栾树对改良矿渣中重金属的拦截作用
凹凸棒是一种镁铝硅酸盐矿物，作为土壤修复改良剂被广泛使用[30]，有研究表明，其能显著提高土壤pH，降低Pb、Cd、Cr等重金属的生物有效性，减少植物对重金属的吸收[31]。有机菌肥在为植物提供养分外，还能通过固定、吸附、络合、氧化等作用降低植物根际环境中重金属的毒性[32]。重金属在土壤中的形态包括可交换态、可还原态、可氧化态和残渣态。可交换态和可还原态的重金属较易被植物吸收，具有生物有效性。可氧化态和残渣态相对更稳定，难以被植物吸收和利用[33]。栾树对锰矿渣中重金属的吸收量极为有限，相较于随雨水径流流失的量几乎可以忽略不计，而锰矿渣中Mn、Pb、Zn等重金属随径流的流失量非常高，单纯改良剂的加入在实验周期内无法有效抑制重金属的流失，甚至显著增加了改良矿渣中Cd的流失量比例。但栾树的种植能明显增加矿渣中重金属的可氧化态和残渣态比例，显著减少矿渣中Mn、Pb、Zn等重金属的流失，这与MUTHANNA[34]等的研究结果相似，说明短时间内植物对基质重金属的吸收量非常有限，通过减少矿渣中重金属的流失来治理矿渣中重金属的扩散和污染将更为有效。凹凸棒和蘑菇渣改良剂的加入在实验前显著提升了锰矿渣的pH，但实验后S0处理中pH有所下降，而S1处理pH显著提升。S0处理在实验后Mn、Pb、Zn等重金属的形态较CK处理无显著的变化，而S1处理中Mn、Pb、Zn重金属残渣态的比例显著高于CK和S0处理。相关性分析结果表明，基质pH、蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的升高能够显著降低矿渣中Mn、Pb和Zn的流失。这是由于提升锰矿渣的pH会增强土壤对重金属离子的吸附能力，有助于降低重金属在土壤和植物中的迁移能力[35]。土壤中蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶的活性能够很好地反映土壤肥力和质量[29]，土壤酶活性的升高反映了改良矿渣肥力和土壤质量的提升，为栾树的生长提供了有利条件，栾树的生长所带来的水土保持作用进一步减少了矿渣中重金属随雨水的流失。
3.3 改良剂的加入和栾树生长对基质微生物群落结构的影响
土壤微生物对外界环境(植物种类、土壤结构、肥力、温度、湿度、酸碱度)的变化高度敏感。长期受重金属污染的土壤，根际微生物群落结构及多样性和丰度都会受到显著的影响[36-38]。不论是改良剂的加入还是栾树生长对锰矿渣微生物群落结构都有一定影响。改良剂的加入对锰矿渣中门水平下细菌物种群落结构的影响较小，但显著提升了细菌物种数量。在本研究中，纯矿渣和改良矿渣中变形菌门都是绝对的优势种群，这与BOUSKILL[39]等的研究结果一致。变形菌门是土壤中分布最广，最普遍的一个细菌门，在矿山径流、被重金属污染的水体及其沉积物和重金属污染土壤中都有丰富的存在[40]，改良剂加入后，细菌门水平上，拟杆菌门和酸杆菌门等腐生型细菌相对丰度也大大提升，拟杆菌门为富营养菌，相对丰度在高有机质水平下增加，且具有溶磷作用[41]，酸杆菌门被证明能够适应重金属污染等极端生存条件[42]。细菌属水平上，S1处理独有的优势属CCD24和bacteriap25与基质蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶和pH存在极显著正相关关系(P<0.01)，与总氮、总磷以及有机质含量等土壤肥力指标也存在正相关关系。这表明，改良剂的加入带来的丰富营养元素和对土壤结构的改善为上述细菌种群的生长提供了有利条件，促进了他们的生长和繁殖，增强它们的活动水平。
土壤真菌参与土壤有机矿化，分解土壤中植物残体和有机质，但多数真菌也能引起植物的病变[43]。改良剂加入后对锰矿渣真菌群落结构的影响巨大，门水平上锰矿渣(CK)中真菌群落绝对优势种群为子囊菌门，而改良矿渣(S0、S1)为担子菌门，子囊菌和担子菌是土壤中重要的分解者，子囊菌多营腐生，而担子菌对植物残体中的复杂的木质素和纤维素具有较强的分解能力[44]。蘑菇渣中主要成分米糠和麦麸等富含纤维素和木质素，充足的营养源使得担子菌门取代子囊菌门成为改良矿渣中绝对的优势种群。过多的子囊菌会引起植物根和茎的腐烂[43]，改良剂的加入显著降低了其在矿渣中的丰度从而减轻其对栾树根系的威胁。同时，无植物下的改良矿渣(S0)在实验后真菌丰富度和多样性显著降低，子囊菌门下Thermomyces(嗜热真菌属)大量繁殖，成为唯一的优势属，其在堆肥过程中对半纤维素的降解起到非常关键的作用，是堆肥中常见的真菌属[45]。这直接导致了改良锰矿渣中真菌群落结构平衡的破坏，营养元素在真菌的分解作用和雨水冲刷下大量流失。而栾树的生长有效避免了这一极端情形的发生，同时使得S1处理中子囊菌门丰度显著低于CK处理，并提高了如担子菌门和接合菌门(接合菌门对土壤中腐殖质分解起到重要作用[46])等有益菌的占比，有利于改良矿渣中有机质和营养元素的缓释，保持锰矿渣的肥力。
土壤微生物在维持土壤肥力、驱动土壤养分循环、稳定生态系统功能等方面发挥着重要作用，是维持土壤生产力的重要部分[47]。植物通过根系的分泌物影响微生物群落结构的组成，同时，土壤微生物群落的结构和多样性也影响了土壤生态系统的结构和功能[47]。总体来看，锰矿渣中Mn、Pb、Zn、Cu、Cd等重金属浓度非常高，且缺乏营养物质，改良剂的加入带来了丰富的营养物质，同时提升了矿渣的土壤质量。而土壤肥力和土壤质量的提升给原本处于弱势的微生物群落的生长和繁殖创造了条件，这是导致矿渣中微生物结构发生转变的主要原因。根际土壤中微生物群落结构的改变和栾树根系的作用使得矿渣的肥力达到了一种缓释的状态，栾树生长过程中植被和根系对矿渣水土的庇护和保持可巩固这一状况，从而形成一种良性循环。
4. 结论
1)蘑菇渣和凹凸棒改良剂的加入显著增强了锰矿渣的肥力和持水性，促进了改良锰矿渣肥力的保持和缓释，增强了栾树的抗逆性。2)栾树地下部发达的根系和地上部植被的覆盖对锰矿渣水土的保持具有积极作用，改良剂的加入和栾树的生长能显著提升锰矿渣中Mn、Pb和Zn的残渣态比例，显著降低这3种重金属在锰矿渣中的流失，提高了修复效率。3)改良剂的加入提高了锰矿渣中微生物多样性，门水平和属水平上腐生和富养菌等有益菌丰度和多样性均显著提升，微生物群落结构的这种改变改善了土壤质量，促进了栾树生长，对植物修复效率的提升具有重要意义。
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图 1 固相萃取柱对LC-MS/MS检测 OPFRs回收率的影响
Figure 1. Influence of LC-MS/MS SPE sorbent on the recoveries of the studied OPFRs
图 2 固相萃取柱对 GC-MS检测 OPFRs回收率的影响
Figure 2. Influence of GC-MS SPE sorbent on the recoveries of the studied OPFRs
图 3 流动相和流动相添加剂对OPFRs响应强度的影响
Figure 3. Influence of mobile phase and concentration of formic acid on the response-intensity of studied OPFRs
图 4 地下水和地表水中OPFRs非致癌风险值
Figure 4. Non carcinogenicity risk values of OPFRs in surface and groundwater water
图 5 地下水和地表水中OPFRs致癌风险值
Figure 5. Carcinogenicity risk values of OPFRs in surface and groundwater water
表 1 20种OPFRs的LC-MS/MS参数
Table 1. LC-MS/MS parameters of 20 OPFRs
化合物 出峰时间/min 母离子质荷比 定量离子质荷比 四极杆电压1 (Q1)/V 碰撞室电压(CE)/V 四极杆电压2 (Q3)/V 第1次 第2次 第3次 第1次 第2次 第3次 第1次 第2次 第3次 TEP 2.143 183.10 98.90 126.90 154.90 −20 −20 −14 −12 −19 −23 −30 TCEP 2.164 285.00 63.00 98.90 222.80 −19 −27 −23 −13 −26 −19 −25 TPPO 2.775 278.90 200.95 76.95 173.00 −19 −26 −48 −33 −23 −27 −12 TCPP 2.928 327.00 99.00 174.85 250.90 −15 −21 −13 −9 −18 −19 −28 TiPP 3.089 225.20 98.95 140.95 80.90 −17 −16 −10 −48 −19 −16 −30 TnPP 3.095 225.20 98.95 141.00 192.95 −16 −17 −10 −7 −18 −26 −13 IDDP 3.594 293.10 251.00 76.95 153.05 −14 −11 −41 −25 −26 −29 −29 TDCPP 3.778 430.90 98.90 208.90 210.85 −20 −29 −18 −17 −19 −23 −22 TPhP 4.198 327.10 77.00 151.90 214.90 −11 −45 −39 −28 −14 −28 −23 TiBP 4.593 267.20 98.95 155.00 80.85 −20 −15 −9 −55 −20 −11 −30 TnBP 4.594 267.20 98.95 154.95 211.10 −20 −21 −11 −9 −19 −30 −24 MDPP 4.833 341.10 152.00 165.00 90.90 −12 −34 −33 −36 −30 −30 −17 TBEP 4.954 399.30 199.00 299.15 45.00 −27 −16 −14 −25 −14 −22 −17 TPeP 6.683 309.30 99.00 169.00 239.00 −11 −20 −11 −9 −19 −12 −27 EHDPP 6.689 363.20 251.05 76.90 151.90 −18 −10 −49 −45 −18 −14 −26 IDPP 7.787 391.30 251.00 76.95 148.90 −14 −14 −45 −24 −28 −30 −30 TXP 8.240 411.20 104.95 179.05 194.00 −14 −34 −42 −31 −18 −19 −20 TDMPP 8.255 411.20 178.95 194.00 79.05 −28 −47 −30 −50 −18 −22 −14 TIPPP 8.414 453.30 327.00 411.10 369.10 −16 −30 −18 −22 −23 −21 −27 THP 8.540 351.30 99.10 182.95 267.15 −12 −20 −12 −10 −19 −21 −30
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表 2 7种OPFRs的 GC-MS参数
Table 2. GC-MS parameters of 7 kinds of OPFRs
化合物 出峰时间/min 基峰 定性峰1 定性峰2 BEHP 43.559 99 113 55 TEHP 43.566 99 113 57 BPDP 47.459 367 368 382 DBPP 48.373 91 92 277 o-TTP 45.352 165 368 179 m-TTP 46.273 368 367 165 p-TTP 47.577 368 367 107
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表 3 27种PPCPs的参数对比
Table 3. Parameter comparison of 27 PPCPs
化合物 可决系数R2 回收率/% 相对标准偏差RSD/% 检出限/(ng·L−1) 定量限/(ng·L−1) 检测方法 TDMPP 0.991 75.99 5.6 0.19 0.64 LC-MS/MS TCEP 0.996 81.37 3.5 0.28 0.93 LC-MS/MS TiBP 0.999 98.35 6.3 0.37 1.23 LC-MS/MS TnPP 0.992 94.68 5.7 0.05 0.18 LC-MS/MS TiPP 0.994 98.25 4.6 0.03 0.11 LC-MS/MS MDPP 0.996 66.30 3.6 0.31 1.04 LC-MS/MS IDPP 0.996 74.88 3.1 0.37 1.24 LC-MS/MS TIPPP 0.999 97.57 7.8 0.31 1.02 LC-MS/MS TPeP 0.999 90.51 6.5 0.04 0.14 LC-MS/MS EHDPP 0.998 95.03 9.3 0.07 0.23 LC-MS/MS TEP 0.999 76.20 5.1 0.1 0.32 LC-MS/MS TCPP 0.998 65.82 2.4 0.03 0.11 LC-MS/MS TBEP 0.999 74.48 10.6 0.05 0.16 LC-MS/MS TnBP 0.999 102.14 8.3 0.02 0.06 LC-MS/MS THP 0.994 81.16 9.4 0.13 0.44 LC-MS/MS TPhP 0.996 80.91 8.0 0.13 0.42 LC-MS/MS TPPO 0.998 94.59 10.1 0.02 0.08 LC-MS/MS IDDP 0.994 75.96 8.3 0.08 0.25 LC-MS/MS TDCPP 0.999 70.54 6.3 0.29 0.96 LC-MS/MS TXP 0.996 77.14 5.1 0.10 0.32 LC-MS/MS BEHP 0.993 95.36 4.2 0.55 1.83 GC-MS TEHP 0.999 101.36 4.2 0.49 1.62 GC-MS BPDP 0.999 103.35 6.4 2.53 8.43 GC-MS DBPP 0.994 86.38 5.2 0.74 2.45 GC-MS o-TTP 0.999 95.80 6.3 0.39 1.31 GC-MS m-TTP 0.999 92.76 8.2 0.59 1.96 GC-MS p-TTP 0.997 108.48 6.1 0.68 2.28 GC-MS
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表 4 23种OPFRs在8个采样点中的质量浓度
Table 4. Mass concentrations of 23 kinds of OPFRs in 8 sampling points
化合物 地表水/(ng·L−1) 地下水/(ng·L−1) S1 S2 S3 S4 1# 2# 3# 4# TDMPP 1.83 1.98 0 6.56 72.23 105.33 46.54 61.75 TCEP 40.05 37.07 4.37 7.06 29.31 8.03 11.41 25.88 TiBP 16.23 15.99 12.19 8.15 13.25 32.58 27.64 34.35 TnPP 315.47 192.76 46.46 44.67 29.30 208.83 191.06 201.69 TiPP 298.41 189.09 64.68 46.72 10.34 116.51 105.91 102.14 MDPP 0.57 0.48 0.52 1.25 2.24 2.39 0 12.22 TPeP 0.43 0 0 0 0 0.46 0 2.03 EHDPP 1.44 1.03 1.05 0.88 0.88 8.96 2.88 6.15 TEP 136.53 133.21 17.38 459.90 7.48 80.94 113.56 71.21 TCPP 61.23 45.63 9.54 26.56 17.75 65.76 21.81 83.39 m-TTP 2.31 2.67 2.49 6.41 11.63 9.97 1.60 87.27 o-TTP 0.49 0.68 1.01 1.20 2.28 4.75 8.93 15.39 TBEP 27.01 5.74 1.21 0.62 1.33 8.01 2.52 7.35 TnBP 51.34 41.09 14.49 31.80 64.99 116.36 57.86 86.04 THP 1.11 0.66 1.01 0.92 0.67 0.76 0 1.60 TPhP 2.32 0 3.27 2.78 3.06 4.93 3.36 9.11 TPPO 70.60 53.56 55.84 12.26 37.41 30.29 27.60 53.75 p-TTP 0.84 0.96 0.72 2.94 1.74 3.38 0 23.86 IDDP 2.98 0.64 0.89 2.83 0.97 1.13 2.88 5.63 TDCPP 8.06 9.88 1.50 2.36 2.47 4.83 5.80 10.96 TXP 1.24 1.86 0.49 5.34 82.13 116.10 38.16 64.94 BEHP 0.31 0.27 0.24 0.51 3.85 9.93 0.81 1.36 TEHP 30.46 26.95 23.04 50.38 376.85 973.17 79.27 133.17 ƩOPFRs 1 071.26 762.2 262.39 722.1 772.16 1 913.4 749.6 1 101.24
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表 5 OPFRs 暴露风险计算参数
Table 5. Parameters for the exposure risk calculation to OPFRs
性别 儿童或成人 饮水量/（L·d-1） 人体质量/kg 男性 儿童 0.81 24 成人 2.23 65 女性 儿童 0.76 23 成人 1.65 56
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表 6 OPFRs的参考剂量值和斜率致癌因子参数值
Table 6. Chronic oral reference dose and oral slope factor values of OPFRs
化合物 参考剂量值/(ng·(kg·d)−1) 致癌斜率因子/(ng·(kg·d)−1) TEP 125 000 — TnBP 10 000 9.00×10−9 TDCPP 20 000 3.10×10−8 TPHP 7 000 — EHDPP 15 000 — o-TTP 20 000 — m-TTP 20 000 — p-TTP 20 000 — TCEP 7 000 2.00×10−8 TCPP 10 000 — TBEP 15 000 — TPPO 20 000 — TEHP 100 000 3.10×10−9
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