实验装置由1个有效体积为1.0 L的序批式反应器(sequencing batch reactor，SBR)和1个有效体积为2.3 L的上流式厌氧污泥床反应器(upflow sludge bed reactor，UASB)组成。其中，SBR中主要进行部分硝化(partial nitrification，PN)过程(以下将这部分反应器简称为“PN反应器”)，以定时装置控制蠕动泵开关，实现包括进水、间歇曝气、沉淀和出水的4阶段循环，以增氧机和玻璃转子流量计实现定量曝气，曝气阶段控制溶解氧(DO)低于0.5 mg·L⁻¹；UASB中主要进行厌氧氨氧化过程(以下将这部分反应器简称为“anammox反应器”)，其内径为5 cm、非沉淀区高度为80 cm，采用连续进水、溢流出水的方式运行，且密封反应器以隔绝空气。用恒温水浴将反应器系统的温度维持在(25±1)℃。PN反应器进水为某有效体积为6 L的厌氧膜生物反应器(AnMBR)出水，具体水质指标如图1和图2所示；PN反应器的出水则进入anammox反应器，从而形成两段式PN/A系统。AnMBR出水中的荧光类物质主要包含类富里酸物质、色氨酸类蛋白质和类腐殖酸物质，以及一定量的多糖类物质^[12]。该AnMBR的进水为人工模拟废水，其水质指标为COD (500±50) mg·L⁻¹、TN (50±3) mg·L⁻¹、总磷 (5±11) mg·L⁻¹。该水样的主要成分有：尿素88.2 mg·L⁻¹、乙酸钠220.6 mg·L⁻¹、NaHCO₃ 800 mg·L⁻¹、KH₂PO₄ 21.9 mg·L⁻¹、FeSO₄·7H₂O 5 mg·L⁻¹、MgCl₂·6H₂O 5 mg·L⁻¹、酵母浸膏56.8 mg·L⁻¹、牛肉浸膏64.6 mg·L⁻¹、酵母56.8 mg·L⁻¹、葡萄糖220.6 mg·L⁻¹。其中，微量元素的成分见参考文献[10]。AnMBR接种污泥取自西安汉斯啤酒厂的中温污泥厌氧消化池；PN/A反应器污泥取自西安某污水处理厂的A²O缺氧池末端。

根据HRT的变化将实验分为4个阶段，其运行周期分别为1~33 d(HRT为10 h)、34~89 d(HRT为8 h)、90~166 d(HRT为6 h)及167~274 d(HRT为4 h)。

测定方法：COD为快速消解分光光度法；${\rm{NH}}_4^{+}$-N为钠氏试剂分光光度法；${\rm{NO}}_2^{-}$-N为N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；${\rm{NO}}_3^{-}$-N为紫外分光光度法。

1)高通量测序。在系统稳定运行期间，从anammox反应器中采集污泥样品。取均匀混合的污泥样品置于−20 ℃冰箱中保存备用。利用DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek Inc，USA)提取样品中DNA，并选用16Sr DNA V3-V4区域的引物341F(5'-CCTACGGGNGGCWGGAG-3’)和805R(5’- GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)进行聚合链式反应(PCR)扩增，并将PCR扩增产物通过Sangon Biotech Co.(中国上海)的lllumina MiSeq平台进行高通量测序，分析不同条件下微生物的群落特征。

2)荧光原位杂交(FISH)。颗粒污泥采用冷冻切片机(Leica CM 1950,Germany)进行切片，杂交后的样品通过激光共聚焦显微镜(TCS SP8,莱卡)进行观察并采集图像。实验所用探针：总细菌为EUBmix(EUB338、EUBⅡ、EUB338Ⅲ、EUB338Ⅳ)；厌氧氨氧化菌为anammox820。具体实验操作参考文献[13]。

3)粒径分析。先采用湿氏筛分法^[14]测定污泥粒径。筛孔直径分别为 0.9、1.5、2.0和 2.5 mm。针对小于 0.9 mm 的污泥粒径，再用激光粒度分析仪(LS230/SVM+，Beckman Coulter，USA)和重量法结合分析并计算其比例。

Anammox反应器处于密闭状态，而PN反应器出水DO不超过0.5 mg·L⁻¹，可忽略不计。因此，假设反应器内未发生${\rm{NO}}_3^{-}$-N或${\rm{NO}}_2^{-}$-N还原反应时，只发生anammox反应；又由于PN反应器出水${\rm{NO}}_2^{-}$-N与${\rm{NH}}_4^{+}$-N的质量浓度之比一直小于1.32，即${\rm{NO}}_2^{-}$-N质量浓度决定了anammox反应的脱氮上限，其理论脱氮效率可根据式(1)计算。

式中：[${\rm{NO}}_2^{-}$-N]为PN出水中${\rm{NO}}_2^{-}$-N的质量浓度，mg·L⁻¹；TN为PN出水总氮，mg·L⁻¹。

随着HRT从10 h降至6 h，PN/A系统的脱氮效率逐渐升高(如图1所示)，且在HRT为6 h达到最大值81.3%，而出水TN基本低于16 mg·L⁻¹。当HRT缩短至4 h时，系统脱氮效率迅速降至41.2 %。由不同阶段PN/A系统的氮素组成变化可知，在前3个阶段内，anammox出水中${\rm{NO}}_2^{-}$-N的质量浓度不超过2 mg·L⁻¹，而${\rm{NH}}_4^{+}$-N有一定剩余，表明脱氮的限制因素是${\rm{NO}}_2^{-}$-N的不足。另外，整个实验期间PN出水的${\rm{NO}}_3^{-}$-N质量浓度均稳定在较低水平(小于8 mg·L⁻¹)。这是由于在低HRT、低溶解氧环境下，NOB的活性稳定持续地受到控制。

PN/A系统进水为AnMBR出水，COD为(24.7±6.8)mg·L⁻¹。自HRT为8 h开始，anammox反应器出水COD都稳定低于20 mg·L⁻¹。相比进水的变化，PN出水COD始终未出现波动。这可能是由于PN内DO与HRT相对较低，而PN/A系统内COD的去除主要发生在anammox反应器内。考虑到该系统为COD与${\rm{NO}}_3^{-}$-N共存的厌氧环境，推测COD的主要去除途径可能是反硝化过程。

控制较低COD/N、保持适宜的有机物种类可促进PD过程发生^[15]。由图3(a)可知，anammox反应器进水的${\rm{NO}}_2^{-}$-N与${\rm{NH}}_4^{+}$-N质量浓度之比([${\rm{NO}}_2^{-}$-N]/[${\rm{NH}}_4^{+}$-N])在大多数时间内都远低于anammox反应理论所需的1.32^[16]。而计算结果表明，anammox段理论脱氮效率(假设anammox反应器内仅发生anammox反应)远低于实际脱氮效率，这意味着该反应器内可能发生了除anammox反应外的可提供${\rm{NO}}_2^{-}$-N的反应，如PD反应。另外，由于anammox反应器内的[${\rm{NO}}_3^{-}$-N]与[${\rm{NH}}_4^{+}$-N]变化量的绝对值之比(Δ[${\rm{NO}}_3^{-}$-N]/Δ[${\rm{NH}}_4^{+}$-N])远远低于anammox反应的理论值0.26，即系统内${\rm{NO}}_3^{-}$-N的确被部分转化，也进一步验证了PD过程的发生。

本研究中，平均COD/N始终维持在0.40~0.55。由于部分反硝化(PD)过程的最佳COD/N大约为2.0~3.5^[11]，此时${\rm{NO}}_2^{-}$-N还原受抑制而${\rm{NO}}_3^{-}$-N还原速率较高，从而可实现${\rm{NO}}_2^{-}$-N的积累。然而，本研究中COD/N远低于该范围，即理论上来说对${\rm{NO}}_2^{-}$-N还原的抑制会更强；另一方面，碳源不足也导致${\rm{NO}}_3^{-}$-N的还原速率维持较低状态，但足以辅助anammox反应实现脱氮，并在anammox反应器进水[${\rm{NO}}_2^{-}$-N]/[${\rm{NH}}_4^{+}$-N]低于1.32的情况下，可将脱氮效率提升至最高水平(约81.3%)。

当HRT为8、6和4 h时，在anammox反应器中，与氮转化相关及相对丰度高于1%的属水平下微生物相对丰度如图4所示。其中，anammox菌主要为Candidatus Brocadia属，当HRT为8、6 h时，其相对丰度分别为1.79 %、5.32 %。这表明HRT的缩短和氮负荷的提升可促进Candidatus Brocadia的富集。而在HRT为4 h时，属于AOB的Nitrosomonas、Nitrosospira和属于NOB的Nitrospira相对丰度有所提升，则意味着溶解氧随进水被引入使得DO增大。另外，属于反硝化菌的Denitratisoma相对丰度随HRT的缩短而升高，意味着在HRT为6 h时污泥的反硝化能力增强可能是脱氮效率提升一个重要因素。当HRT为4 h时，Candidatus Brocadia和Denitratisoma的相对丰度又进一步提升，分别为16.25 %和3.54 %，而此时脱氮效率相比HRT为6 h时明显下降。这表明该系统内微生物的相对丰度与系统性能之间的关系可能较为复杂，还需要从微生物在污泥内的分布等角度进行深入分析。

当HRT分别为8、6和4 h时，anammox反应器下端污泥粒径质量分布变化如图5所示。随着HRT的增大和反应的进行，anammox反应器内粒径小于0.2 mm的絮体污泥的占比持续大幅减少，这说明污泥一直处在快速颗粒化的过程中。然而，当HRT为4 h时，粒径大于0.9 mm的污泥占比却从HRT为6 h时的13.7 %降至10.5 %。有研究证明，anammox颗粒的粒径大小与反应器内水力剪切力存在平衡关系，较大的剪切力会导致污泥粒径的降低^[17-18]。随着HRT的提升，anammox内的上升流速也随之增大，从HRT为6 h时的0.28 m·h⁻¹增至HRT为4 h时的0.42 m·h⁻¹。与相关研究中约0.5m·h⁻¹的UASB上升流速^[19-20]相比，该数值虽不高，但HRT由6 h减小至4 h的短期内上升流速增加了约50%，说明即使上升流速绝对值较小，其变动速率过大，也可能会对粒径污泥的结构造成破坏。

FISH图像(图6)表明anammox菌更加倾向于生长在颗粒的内侧，且颗粒污泥内部存在明显的孔道结构。通常认为，anammox颗粒污泥的空间结构是外围生长AOB、NOB及异养菌，而anammox菌生长在内部以避免不良环境的影响，比如高DO的冲击等^[21-23]。另外，anammox颗粒污泥的内部孔道又提供了物质交换通道，在一定程度上提升了颗粒内部微生物的代谢速率上限。当HRT从6 h降至4 h后，污泥粒径受到的冲刷作用变强，可能导致颗粒内部的anammox菌直接暴露在液相环境中，而更强的水力冲刷本身也会导致固液界面传质阻力下降，从而增大了不利环境因素的冲击风险。

在HRT分别为10 h和8 h的工况下，进水氮负荷过低导致anammox菌等功能菌相对丰度较低，且污泥粒径较小，限制了系统的脱氮效率。在HRT为6 h时，氮负荷的上升导致anammox菌相对丰度上升，并且在适宜的上升流速下污泥粒径也明显增大，优化了anammox菌的生存环境。当HRT为4 h时，由于进水氮负荷的提升和长期的富集作用，anammox菌的相对丰度虽比之前发生了突跃，已达到最大值16.25%，但系统脱氮效率相比HRT为6 h时却明显下降。这可能是由于上升流速提升使得污泥结构受到破坏，且反应器内高度沿程的污泥分布被扰乱。随后，更多微生物暴露于DO较大的液相环境中，导致anammox菌活性受到抑制^[23]。以上因素使得系统很难达到较好的脱氮效率。

PN/A系统在HRT为6 h时获得了最高的脱氮效率。该阶段氮素和COD的转化路径如图7所示。PN反应器进水含50 mg·L⁻¹的${\rm{NH}}_4^{+}$-N，在AOB作用下占TN 54%的${\rm{NH}}_4^{+}$-N被转化为${\rm{NO}}_2^{-}$-N，仅有10.6 %TN被转化为${\rm{NO}}_3^{-}$-N；相比而言，PN进水COD(约24 mg·L⁻¹)仅有8.4%被消耗，剩余的91.6%均进入anammox反应器。在anammox反应器内，anammox反应(主要参与的菌群为Candidatus Brocadia菌，相对丰度5.32 %)作为主反应分别消耗了37.6% ${\rm{NH}}_4^{+}$-N和49.6% ${\rm{NO}}_2^{-}$-N，产生了9.6% ${\rm{NO}}_3^{-}$-N(均以进水TN计)，脱除了77.4%的TN。此外，在anammox反应器内还发生了PD反应(主要菌群为Denitratisoma菌，相对丰度为1.68%)，消耗了占进水TN10.8%的${\rm{NO}}_3^{-}$-N和26.3%进水COD并补充了${\rm{NO}}_2^{-}$-N，提升了PN/A系统的脱氮效率。在城市污水处理中，anammox反应器内的PD反应降低了PN/A系统对于前端PN反应的依赖度，从而有效提升了整个系统的稳定性。

1) COD在anammox反应器内驱动的PD过程使得anammox反应最终代谢产物${\rm{NO}}_3^{-}$-N被转化为${\rm{NO}}_2^{-}$-N，并再次成为anammox反应的基质，从而提高了系统的脱氮效率。

2) UASB形式的anammox反应器内功能菌的相对丰度和污泥结构共同决定系统脱氮性能。随着HRT的缩短，氮负荷增加促进Anammox菌富集，但过短的HRT引发反应器内水力冲刷过强可能会导致污泥形态破坏并使得脱氮效率降低。

3)在PN/A系统HRT为6 h条件下，anammox反应器内氮负荷与水力冲刷2个因素达到平衡点，使得系统可实现最高81.3 %的脱氮效率。