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慢性伤口(chronic wounds)是接受超过四周的治疗，不能愈合、也无愈合倾向的伤口[1]。它的特征是容易反复感染、久治不愈，还会导致很高的发病率和死亡率[2]。近几年有关细菌生物膜在慢性伤口形成中的作用引起了人们关注，有相当多的报告表明，细菌生物膜存在于慢性创面，是阻碍愈合过程的一个重要因素，是治疗感染一个主要问题[3-5]。目前临床上多使用抗生素治疗细菌生物膜感染。抗生素对浮游细菌有强大的杀灭能力，但对于存在于慢性伤口的生物膜，即使长期使用抗生素，也可能不能被完全清除。这是因为生物膜(biofilm)是细菌在生长过程中附着于非生物或生物表面的被细菌自身产生的多聚基质包裹的菌细胞群[6]。作为特殊的生长方式它可保护细菌抵抗抗菌药物的作用，形成特异性和非特异性的耐药性[7]。这使得慢性伤口感染治疗成本急剧增加，因此，急需找到一种高效灭活生物膜细菌的方法，这对伤口感染治疗和慢性伤口愈合具有重大意义。
等离子体放电可产生电离气体、分子、带电粒子、负离子/正离子、电子、光子和自由基组等活性组分[8]，因为高效、快速、无污染、可直接作用于人体等优点，被越来越多地被应用于医疗灭菌和消毒研究中。其中活性氧和活性氮被认为在灭菌工作中起主导作用。感染的慢性伤口通常被生物膜和渗出组织液覆盖，有限的穿透力使等离子诱导产生的活性物质极难穿透渗出组织液与细菌生物膜充分接触，这可能极大地限制了等离子体在慢性伤口治疗中的应用。根据最新的报道，除了气态等离子体具有抗菌作用外，由等离子体诱导产生的活化水也能有效失活多种细菌、生物膜[9-11]。与直接等离子处理相比，溶液的均匀性和流体的良好流动性使得活化水中活性组分均匀覆盖于受感染伤口生物膜上，同时，活化水还可以避免电流和紫外线辐射，而且操作方便，利于临床使用。
金黄色葡萄球菌生物膜是自然界、住院病房和人体内最常见的革兰氏阳性病原菌之一[12-13]，特别是在人体皮肤伤口上容易形成金黄色葡萄球菌生物膜。本研究以金黄色葡萄球菌生物膜为模型，研究了活化水对金黄色葡萄球菌生物膜的失活效果。通过细胞代谢能力、细胞内活性氧含量等生物学效应测定和长寿命活性组分含量检测，探讨了活化水的杀菌机理，以期为有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的感染提供有价值的参考。
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自制等离子体反应器，高压电源，酶标仪(Varioskan Flash, Thermo-Fisher Scientific, US)，纯水机，分析天平，振荡器，培养箱，PhotoLab6100分光光度计，AvaSpec-2048-8-RM光谱仪。
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金黄色葡萄球菌(NCTC-8325)，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，刃天青染料(Sigma, USA)，2'7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2-DCFDA) (Sigma, USA)，盐(NaCl，分析纯)，葡萄糖(C6H12O6，分析纯)，过氧化氢检测试剂盒(18789)MERCK、亚硝酸根离子检测试剂盒(00609)MERCK、臭氧检测试剂盒(00607)MERCK。
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利用直流高压放电产生空气低温等离子制备活化水(PAW)。图 1为实验装置图。其中，低温等离子体装置由6根铜电极组成，与高压源、电阻相连接。工作气体为周围的空气，直流驱动电压为10 kV，放电峰值电流约为5 mA，大气压低温等离子体的气体温度约为300 K。等离子体装置的铜电极针头与水溶液(去离子水)界面之间的距离保持在1 cm，铜电极由直流高压驱动，在针头与水溶液界面之间产生等离子体，等离子中活性组分扩散进入水溶液中或与水溶液反应形成等离子体活化水。
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等离子体分别处理无菌去离子水0、15、30、60 min，获得活化水。每次取1 mL活化水完全覆盖于生物膜表面，浸泡30 min后移除活化水，用无菌去离子水冲洗生物膜以避免活化水中长寿命活性组分产生的滞留效应。
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从胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养皿中分离出单个金黄色葡萄球菌NCTC-8325菌落于1 mL的TSB溶液中，在温度为37 ℃、转速为225 r·min-1的条件下，过夜培养。过夜培养后的细菌悬液与TSBG (TSB溶液加0.6%的葡萄糖和盐)溶液按1:100比例混合后，被转移到载有玻璃片(直径为5 mm)的24孔板中(2.5 mL·孔-1)。在37 ℃培养箱中静置培养12 h后，取出生物膜于直径为35 mm的培养皿中，用无菌去离子水轻轻洗去生物膜上的浮游细菌和培养基质。然后将生物膜置于37 ℃培养箱中干燥，直至生物膜表面水分被完全蒸发，将生物膜取出备用。
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采用分光度法(PhotoLab 6100, WTW, Germany)测定活化水中代表性长寿命活性组分含量(过氧化氢、亚硝酸盐、臭氧)，检测试剂盒为分别为过氧化氢检测试剂盒(18789)MERCK、亚硝酸根离子检测试剂盒(00609)MERCK、臭氧检测试剂盒(00607)MERCK。
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本实验通过计算培养皿上的CFU数量来观察活化水对生物膜的杀菌效果。每组实验中，将经活化水处理后的生物膜置于装有1 mL无菌去离子水的10 mL试管中，超声水浴分散15 min，得到原始细菌悬液。用连续10倍系列稀释法将其稀释至适当浓度。选择适当浓度的细菌悬液，取100 μL于TSB琼脂板上。利用涂布棒使细菌悬液均匀覆盖琼脂板。在37 ℃培养箱中静置培养12 h，对隔夜培养的琼脂板进行计数，评估活化水的抗生物膜能力。
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刃天青(7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide)是一种对细胞无毒害、不影响细胞代谢的氧化还原染料。被灭活的细菌细胞丧失了代谢能力，不能还原刃天青染料，继而不能产生荧光信号。然而活细胞内还原酶能够将蓝色的刃天青染料转变为粉红色的荧光物质试卤灵(7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one)，改变了样品的荧光强度，使用荧光酶标仪检测吸光度(激发波长为560 nm/590 nm)。根据吸光度的大小可以快速判定细胞的新陈代谢能力。具有新陈代谢能力的细菌所占的百分比通过与对照组(100%)的比较来获得。在实验中，用超声水浴将细菌从被处理过的生物膜中分离出来，细菌悬液与刃天青染料(10%)(Sigma, St. Louis, MO, USA)充分混合，在振荡器中培养(37 ℃、80 r·min-1)2.5 h后。将混合悬液转移到96孔板(200 μL·孔-1)，准备检测。所有染色和检测过程均在避光条件下进行。
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本实验使用检测活性氧含量的荧光探针是2', 7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2-DCFDA)。H2-DCFDA本身没有荧光，可以穿过细胞膜，进入细菌胞内后被细胞内的酯酶水解，脱掉双乙酸基，生成2', 7'-二氯二氢荧光素(DCFH)。DCFH不能通过细胞膜，故该探针可被装载到细胞内。无荧光强度的DCFH可以将细胞内ROS氧化生成带荧光的2', 7'-二氯荧光素(DCF)。DCF荧光强度能够定量反映细胞内ROS的水平。在每组实验中，将处理后的生物膜细菌悬液与稀释后的H2-DCFDA染液(1:1)混合后，转移到96孔板(200 μL·孔-1)。在37 ℃温度下静置培养25 min，使用酶标仪(Varioskan Flash, Thermo-Fisher Scientific, US)检测荧光强度，激发波长为488 nm/525 nm，所有染色过程在避光条件下进行。
1.1. 主要设备和仪器
1.2. 主要材料
1.3. 实验方法
1.3.1. 活化水制备
1.3.2. 活化水处理
1.3.3. 生物膜的制备
1.3.4. 长寿命活性组分含量的测定方法
1.3.5. 抗生物膜活性测定方法
1.3.6. 新陈代谢能力测定方法
1.3.7. 细胞内活性氧
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等离子体源200~900 nm的典型发射光谱如图 2所示。在300~450 nm和600~800 nm处发现了强烈的发射峰群，在777.2 nm和844.6 nm处观察到激发的原子氧(O)。低温等离子体放电，产生的电子、离子、自由基等气相基团转移到水中，引发一系列复杂化学反应，生成活性氧(ROS)和活性氮(RNS)[10]。其中包括H2O2、NO2-、O3等长寿命组分和OH-、O2-、ONOO-等短寿命组分。过氧化氢[12]主要通过式(1)和式(2)反应生成。
臭氧主要通过式(3)~式(5)反应生成。
NO2-主要通过NO、O2、O3和H2O发生一系列络合加成反应而形成。
由于短寿命物种半衰期较短，本研究仅检测了活化水中3种代表性长效活性组分(H2O2、O3、NO2-)的浓度。如图 3所示，等离子体处理60 min后，H2O2的浓度上升趋势最为明显，从0 mg·L-1显著升高到227 mg·L-1。NO2-浓度也显著上升，以先快后慢的趋势增长到180 mg·L-1。相比较而言，O3的浓度上升较为缓慢，在等离子体处理60 min后，浓度仅有5.8 mg·L-1，这可能是臭氧较难溶于水的缘故。
活化水中的活性氧被认为在细菌失活中起主要作用，作为具有强抗菌活性的氧化剂，H2O2可以与细菌组分发生反应，造成DNA和蛋白质的氧化损伤[10]，O3可以与碳氢键发生反应，使细菌的细胞壁变得薄弱。作为主要的活性氮，NO2-是造成水溶液的酸化的主要原因之一。在酸性环境中，H2O2可以与NO2-发生反应，形成ONOO-，这种物质具有高度的细胞毒性，通过细胞壁通道扩散，造成细胞壁破裂[14]。除此之外，活性物质诱导的氧化应激也是造成细菌细胞损伤和死亡的主要原因之一[15]。
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采用菌落计数法分析等离子体活化水对金黄色葡萄球菌生物膜的灭活效果。在图 4中，金黄色葡萄球菌生物膜的灭菌效果表现出等离子体处理与时间的依赖性，随着等离子体处理时间的增加，存活的生物膜细菌逐渐减少。等离子体处理30 min，活化水浸泡30 min时，生物膜中存活的细菌下降了2.2个数量级左右。而当等离子体处理时间延长到60 min，活化水浸泡30 min后，大约有4.8个数量级的细菌被灭活。PAN等[16]研究发现活化水的抗生物膜活性随大气压等离子体处理时间的增加而增加，经大气压等离子体活化水处理5 min后，5 d大粪肠球菌生物膜细菌减少了7个数量级，较高的灭菌效果可能是生物膜放置在水溶液中，等离子体直接处理，短寿命组分与长寿命组分共同作用的结果。
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利用刃天青染料量化具有代谢能力的活细胞数量百分比。如图 5所示，随着等离子体处理时间的延长，具有代谢能力的活细菌数量百分比呈下降趋势。未经等离子体处理时(对照组)，活化水浸泡30 min后，生物膜中具有代谢能力的活细菌为100%，等离子体处理延长到30 min，活化水浸泡30 min后，生物膜中具有代谢能力的活细菌数量百分比快速下降到44%。等随着离子体处理时间继续延长，最终具有新陈代谢能力活细菌比例只有30%。
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ROS包括多种活性含氧离子、分子和自由基。在维持细胞功能稳定、细胞信号传递中起重要作用。利用荧光探针2', 7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，使用酶标仪对生物膜中细菌的胞内ROS浓度进行定量检测。图 6显示了胞内ROS含量与等离子体处理时间对应的函数关系。随着等离子体处理时间的延长，细胞内ROS浓度逐渐上升，60 min后最终达到初始细菌ROS浓度的1.16，有明显上升趋势。
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活化水中活性基团浓度随着等离子体处理时间的增长而积累，高浓度的活性基团会与细胞组分发生反应，破坏细胞膜结构，造成细菌DNA和蛋白质的氧化损伤。除此之外，作为外源ROS的信号分子，活性氧和活性氮诱导了细菌发生氧化应激反应。干扰了细胞内正常氧化还原系统的平衡，刺激细胞内ROS的产生。胞内ROS积累到一定量后，也会攻击细胞结构，造成细菌的失活。胞内ROS与胞外活性基团协同作用可能是造成细菌失活的主要原因。值得注意的是失活实验中，将菌落计数法的结果与新陈代谢能力测定结果比较发现，有一部分细菌不能够培养发育但是却拥有新陈代谢能力。这可能是可能进入假死(VBNC)的状态，当细菌面临氧化应激、低温、低营养、渗透胁迫等环境压力时，会进入VBNC状态。此状态下细菌不能发育繁殖，但能够利用营养物质维持自身新陈代谢。作为不利的环境因素，活化水中的长效活性组分(H2O2、NO2-、O3)会抑制细菌的生长，破坏细菌结构，同时诱导细菌发生氧化应激反应，促使一部分细菌进入了假死状态。VBNC细菌具有完整的细胞膜结构和遗传信息，通过产生信使RNA进行基因转录。活化水中活性组分在不同程度上抑制了相关基因的表达，这可能是数据出现差异的主要原因。
2.1. 实验结果
2.1.1. 活性组分含量
2.1.2. 生物膜失活
2.1.3. 新陈代谢能力
2.1.4. 胞内ROS含量
2.2. 讨论
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1) 等离子体活化水处理对金黄色葡萄球菌生物膜有明显的抗生物膜作用，延长等离子体的处理时间可以加强失活效果。
2) 等离子体处理60 min后，水中长寿命活性组分浓度有不同程度地提高，生物膜中有4.8个数量级的细菌被灭活。刃天青检测表明，还有30%细菌保持新陈代谢能力。差异性结果表明，一些细菌可能进入了可存活不能培养的(VBNC)的状态。
3) 活化水处理后，细菌胞内ROS含量升高，随着等离子体处理时间的增加，细菌胞内ROS含量持续增加，在等离子体处理60 min后达到最大值。
4) 活化水中积累的大量活基团与细胞内ROS协同作用可能是生物膜细菌失活的主要原因。
