石油作为现代社会最主要的能源之一，有工业血液之称^[1]。然而，石油在生产、储运和使用的过程中也带来了许多环境问题，其中石油及其产品污染土壤的问题尤为突出，世界上98%的石油泄漏事故发生在陆地上^[2]。土壤中的石油类污染物会对土壤的通透性、微生物群落及农作物生长造成影响，修复石油污染土壤对环境保护和土地可持续利用有着十分重要的意义^[1]。

目前，高级氧化技术(advanced oxidation processes，AOPs)是修复石油污染土壤常用的方法之一^[3]。在高级氧化技术中常用到的氧化剂为双氧水(H₂O₂)。但由于H₂O₂有稳定性差、易催化分解等缺点，导致其修复效果受到限制^[4]。过氧化钙(CaO₂)被称为固态H₂O₂，因其具有强氧化性、持久缓释性、残留物无害性以及微生物友好性而被广泛应用于土壤和地下水化学修复^[5]。GOI等^[6]用CaO₂代替H₂O₂修复电气绝缘油污染的土壤，发现投加适量的CaO₂可在21 d去除96%的绝缘油。ZHANG等^[7]利用Fe(Ⅲ)催化CaO₂降解地下水中三氯乙烯，在180 min内达到了99.95%的降解率。

基于H₂O₂和CaO₂的高级氧化技术被广泛应用于去除土壤和地下水中的污染物，但关于其对土壤及地下水中微生物群落、植物等造成的影响的研究却相对较少^[8]。本研究利用类Fenton氧化技术修复石油污染土壤，考察氧化剂种类(H₂O₂和CaO₂)、氧化剂投加量、Fe(Ⅲ)及柠檬酸浓度对污染物去除效率的影响，通过比较CaO₂/Fe(Ⅲ)/柠檬酸体系和H₂O₂/Fe(Ⅲ)/柠檬酸体系修复前后土壤原著微生物及植物生长情况的变化，评估2种类Fenton技术所产生的生态毒性效应。

1.   材料与方法

1.1   实验材料与仪器

实验材料：四氯化碳(CCl₄，红外测油仪专用)、过氧化氢(H₂O₂，30%)、硫酸铁(Fe₂(SO₄)₃)、柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、二氯甲烷(CH₂Cl₂)、乙醇(C₂H₅OH)、丙酮(CH₃COCH₃)为分析纯，并均购自国药集团化学试剂有限公司；过氧化钙(CaO₂，75%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

供试土壤：取自上海市东华大学松江校区校园园圃地表10~15 cm深的土壤，自然风干，去掉碎屑、石块、草根等杂物后，研磨并过20目筛。以0^#柴油代替原油，取适量柴油溶于二氯甲烷后，加入过筛后的土壤中，振荡摇匀后，置于通风橱内，待二氯甲烷挥发完全后，在室温25℃下，老化1个月，制得模拟石油污染土壤，石油初始浓度为13.2 g·kg^−1[9-10]。受试土壤理化性质如下：砂粒(>20 µm)14%、粉粒(2~20 µm)57.2%、黏粒(<2 µm)28.8%，pH=7.54、含水率1.44%、有机质含量3.22%。

实验仪器：OLB3000B红外分光测油仪(天津金贝尔科技有限公司)；FA114A电子天平(上海豪晟科学仪器有限公司)；HY-5A回旋式振荡器(常州朗越仪器制造有限公司)；FE28 pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，SRG-800C恒温培养箱(杭州硕联仪器有限公司)。

1.2   实验方法

在锥形瓶中加入5 g受试土壤，依次向瓶中加入25 mL去离子水、柠檬酸溶液、Fe(Ⅲ)溶液、氧化剂H₂O₂或CaO₂，随后将锥形瓶放置在回旋振荡摇床中，转速为170 r·min⁻¹，混合反应时间为24 h，取样测定土样中剩余柴油的含量。控制氧化剂投加量为166.67 mmol·L⁻¹，柠檬酸浓度为27.78 mmol·L⁻¹，Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L⁻¹，处理无外加柴油污染的土壤样品，考察CaO₂/Fe(Ⅲ)/柠檬酸体系和H₂O₂/Fe(Ⅲ)/柠檬酸体系对土壤原著微生物的影响。取适量处理后土壤样品，离心，取下层固体装入无菌离心管中，在−80 ℃条件下保存用于高通量测序；另取相同处理土壤样品，在25 ℃恒温培养箱中培养48 h后，按上述操作进行高通量测序；再取适量处理后的土壤泥水混合物样品，放入恒温培养箱中，进行豌豆种子的萌发及培育实验，每份土壤样品培育60颗豌豆种子，待种子生长7 d后，测定植株的生长情况(发芽率、植株干重、株高、叶绿素含量)。每组实验设2个平行样，结果取平均值。

1.3   分析方法

取反应后土水混合物样品，离心，使样品固液分离，使用四氯化碳萃取上清液，测得柴油浓度，取出下层底泥，置于培养皿，放置于通风橱中，待水分挥发完全后(室温下挥发时间为1 d左右)，使用四氯化碳萃取并测得干燥土壤样品中柴油浓度，二者之和即为反应后土壤样品柴油浓度。该方法测得柴油回收率为90%~110%，可保证样品测定的柴油浓度接近原土壤的实际柴油浓度。

准确称取0.5 g土壤样品于25 mL比色管中，加入20 mL四氯化碳于比色管中，在35℃条件下，超声45 min，萃取土壤中的柴油，取一定量萃取液于10 mL比色管，稀释定容到可检测浓度范围后，利用红外分光测油仪测定溶剂中柴油的浓度。上清液中柴油浓度的测定参考文献中的方法^[11]。

土壤中细菌16S rRNA高通量测序和分析参考王慕华等^[12]的研究方法；豌豆植株的发芽率、干重、株高的测定参考SERA等^[13]的研究方法；叶绿素的测定参考汪艳杰等^[14]的研究方法。

2.   结果与讨论

2.1   氧化剂种类及投加量对土壤中柴油污染物去除的影响

控制Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L⁻¹、柠檬酸浓度为27.78 mmol·L⁻¹，投加不同浓度的CaO₂或H₂O₂(55.56、111.11、166.67、222.22 mmol·L⁻¹)，探究氧化剂种类及投加量对污染物降解效果的影响。如图1所示，CaO₂类Fenton法比H₂O₂类Fenton法对土壤中柴油的去除效果更好。当氧化剂投加量为166.67 mmol·L⁻¹时，H₂O₂类Fenton法对柴油的去除率仅为17.65%，而CaO₂类Fenton法对柴油的去除率为44.14%。这主要是由于CaO₂在反应体系中，缓慢持续地释放H₂O₂，使得体系中H₂O₂的浓度长时间维持在较低水平，避免了短时间内过量的H₂O₂积累，造成H₂O₂发生分解(2H₂O₂→O₂+2H₂O)而失去氧化能力。而在H₂O₂类Fenton体系中，一次性投加的H₂O₂可发生自分解反应和体系中 · OH的清除反应(H₂O₂+ · OH→HO₂ · +H₂O)，最终导致对污染物的去除效果变差。徐金兰等^[3]在利用改性Fenton降解石油污染土壤时发现，将900 mmol·L⁻¹的H₂O₂分4次投加对TPH的降解率比一次性投加900 mmol·L⁻¹H₂O₂的TPH降解率，提高了2.2倍(由22%提高到49%)。因此，利用CaO₂作为氧化剂代替H₂O₂，更有利于土壤中柴油污染的去除。

图 1  不同CaO₂及H₂O₂投加量下土壤柴油污染降解率

Figure 1.  Degradation efficiency of diesel oil in soil by Fenton-like treatments at different CaO₂ or H₂O₂ dosages

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如图1所示，当CaO₂的投加量由0增加至166.67 mmol·L⁻¹时，土壤中柴油的降解率由4.33%提高到44.14%。这是因为随着CaO₂投加量的增多，释放的H₂O₂及 · OH的浓度也会升高(CaO₂+2H₂O→H₂O₂+Ca(OH)₂；H₂O₂+Fe(Ⅱ)→ · OH+Fe(Ⅲ)+HO-)，从而促进了柴油的氧化降解。当CaO₂的投加量由166.67 mmol·L⁻¹增加至222.22 mmol·L⁻¹时，土壤中柴油的降解率由44.14%下降至35.62%。这是因为过量投加CaO₂会产生过量的H₂O₂，当H₂O₂浓度过高时，会发生自分解反应(2H₂O₂→O₂+2H₂O)，并且多余的H₂O₂还会消耗 · OH等活性氧自由基(H₂O₂+ · OH→HO₂ · +H₂O)，从而使目标物去除率有所下降。

2.2   Fe(Ⅲ)浓度对土壤中柴油污染物去除的影响

控制CaO₂浓度为166.67 mmol·L⁻¹、柠檬酸浓度为83.33 mmol·L⁻¹，改变Fe(Ⅲ)浓度(0、13.89、27.78、41.67、55.56 mmol·L⁻¹)，探究Fe(Ⅲ)浓度对CaO₂类Fenton体系修复石油污染土壤的影响。由图2可知，土壤中柴油的降解率随着Fe(Ⅲ)浓度的增加，呈现先增加后略有下降的趋势。当Fe(Ⅲ)从0增加到27.78 mmol·L⁻¹时，柴油的降解率从14.24%增加到35.92%，随着Fe(Ⅲ)浓度的升高，促进了Fe(Ⅲ)与H₂O₂的反应(H₂O₂+Fe(Ⅲ)→Fe(Ⅱ)+HO₂ · +H⁺)，产生更多的Fe(Ⅱ)，进而促进更多的 · OH等活性氧自由基的生成(H₂O₂+Fe(Ⅱ)→ · OH+Fe(Ⅲ)+HO^–)，从而导致柴油去除率升高。进一步增加Fe(Ⅲ)浓度到55.56 mmol·L⁻¹，柴油的降解率下降了3.34%。这可能是因为过量的Fe(Ⅲ)可与CaO₂溶解产生的Ca(OH)₂反应，生成Fe(OH)₃胶体或沉淀物，将土壤颗粒表面包裹，不利于吸附在土壤表面的柴油与氧化剂接触反应，从而降低了柴油的去除率^[15]。但由于上述Fe(Ⅲ)被H₂O₂还原为Fe(Ⅱ)的反应速率很低(约0.001 L·(mol·s)⁻¹)，反应生成的Fe(Ⅱ)可即时与H₂O₂反应被消耗，因此，过量的Fe(Ⅲ)未对柴油降解产生明显的抑制作用(H₂O₂+Fe(Ⅲ)→Fe(Ⅱ)+HO₂·+H⁺)^[4]。

图 2  不同浓度Fe(Ⅲ)对土壤柴油污染降解率

Figure 2.  Degradation efficiency of diesel oil in soil by CaO₂ Fenton-like treatment at different Fe(Ⅲ) concentrations

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2.3   柠檬酸浓度对土壤中柴油污染物去除的影响

控制CaO₂浓度为166.67 mmol·L⁻¹、Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L⁻¹，改变柠檬酸浓度(0、13.89、27.78、55.56、83.33 mmol·L⁻¹)，探究柠檬酸浓度对CaO₂类Fenton体系修复石油污染土壤的影响。如图3所示，柴油的降解率随着柠檬酸浓度的升高呈现先升后降的趋势，当柠檬酸浓度从0增加到27.78 mmol·L⁻¹时，柴油的降解率由22.19%增加到42.03%。这是因为柠檬酸与Fe(Ⅲ)可形成螯合物，使溶液中溶解态的Fe(Ⅲ)的浓度增加，从而促进氧化反应的进行。当进一步增加柠檬酸浓度至83.33 mmol·L⁻¹，柴油降解率下降了16.67%。这是因为过量的柠檬酸作为有机物，会与柴油污染物竞争体系中的活性自由基等氧化剂，从而降低柴油的降解率^[16]。综上所述，采用CaO₂类Fenton体系降解石油污染的最优条件为：CaO₂ 166.67 mmol·L⁻¹，Fe(Ⅲ) 27.78 mmol·L⁻¹，柠檬酸27.78 mmol·L⁻¹。在此条件下反应24 h，柴油的降解率可达44.14%。

图 3  柠檬酸不同浓度对土壤柴油污染降解的影响

Figure 3.  Degradation efficiency of diesel oil in soil by CaO₂ Fenton-like treatment at different citric acid concentrations

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2.4   微生物群落Alpha多样性分析

Alpha多样性通过分析单个样品来反映微生物群落组成的多样性和丰度情况^[17]。Alpha多样性包含多个衡量指标，分别通过不同的算法来估算微生物的多样性和丰度。其中，Shannon和Simpson指数常被用来反映物种的多样性程度，前者大小与多样性程度呈正相关，后者则与之呈负相关；Sobs、Chao1和ACE指数均被用来衡量微生物物种丰度的大小，其数值越高，物种的丰度越大；测序深度指数用于衡量各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中物种被测出的概率越高。图4反映了类Fenton处理前后土壤原著微生物群落的丰富度和多样性变化情况。由图4可知，各样本的测序深度均在98%以上，说明测序结果反映了各样本微生物的真实情况。与未处理的土壤相比，H₂O₂类Fenton处理后的土壤的Shannon指数下降了21.77%，而CaO₂类Fenton处理后的土壤的Shannon指数则上升了2.8%；H₂O₂类Fenton处理后的土壤的Simpson指数上升了350%，而CaO₂类Fenton处理后的土壤的Simpson指数下降了25%。这表明，H₂O₂类Fenton处理对土壤微生物群落的物种多样性有明显的抑制作用，而CaO₂类Fenton处理对土壤微生物群落的物种多样性有促进作用。另外，在物种丰度指数方面，与未处理的土壤相比，H₂O₂类Fenton处理后的土壤的Sobs、Chao1和ACE指数均有所下降，而CaO₂类Fenton处理后的土壤的Sobs、Chao1和ACE指数则分别增加了14.78%、22.39%、21.32%。这表明，H₂O₂类Fenton处理对土壤微生物群落组成的丰富度有抑制作用，而CaO₂类Fenton处理对土壤微生物群落组成的丰富度有明显的促进作用。

图 4  CaO₂及H₂O₂类Fenton处理前后土壤微生物丰富度和多样性指数变化的比较

Figure 4.  Comparison of microbial richness and diversity indexes among control, H₂O₂-based and CaO₂-based treatments

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各样本在处理后继续恒温培养48 h的实验结果如图4(c)和图4(d)所示。可以看出，H₂O₂类Fenton处理组的微生物丰度和多样性水平在完成反应的48 h后有明显下降。以丰度指数Sobs和多样性指数Shannon为例，2种指数的降幅分别由最初培养的18.32%和21.77%增至培养48 h的49.36%和31.61%。与最初培养的结果类似，CaO₂类Fenton处理组培养48 h的Alpha多样性指数与对照组相比有一定的提升。这表明H₂O₂类Fenton处理对土壤微生物可能造成一定程度的持续毒性作用。

造成以上结果的原因主要是：H₂O₂类Fenton体系反应速率快，反应程度剧烈，在短时间内，大幅提升了反应体系的氧化还原电位，从而抑制了微生物的生长；而CaO₂类Fenton体系相对温和的反应机制降低了其对微生物的抑制作用。另有研究^[18-19]表明，CaO₂可以通过分解供氧、刺激生物酶活性、促进微生物代谢、降解污染物等多个方面来强化微生物修复效果。因此，CaO₂类Fenton处理有益于提高土壤微生物群落的物种多样性及丰度。

2.5   微生物群落物种组成分析

图5反映了各实验组微生物群落组成在门水平上的差异性。可以看出，未经处理的原受试土样微生物群落的优势菌门组成为Actinobacteria (35.21%)、Proteobacteria (28.56%)和Acidobacteria (15.09%)。经H₂O₂类Fenton处理后，上述3种菌门所占比例均明显下降，分别下降了24.63%、25.39%和14.02%；而未处理前占极小比例(0.95%)的Firmicutes在处理后增加到79.4%，成为主要优势菌门且占比远高于其他优势菌门。相较而言，CaO₂类Fenton处理后的Firmicutes占比同样有一定程度的提升，提升到16.22%，而在未处理前为主要优势菌门的Actinobacteria、Proteobacteria和Acidobacteria均有所下降，分别下降了2.37%、12.64%和4.25%。以上结果表明，CaO₂及H₂O₂类Fenton处理影响了土壤微生物优势菌门的组成，类Fenton处理明显激活并促进了Firmicutes的生长，同时抑制了土壤原著优势菌群的生长。土壤中优势菌门的构成比例变化可能会影响土壤有机质的代谢。有研究^[20]表明，Proteobacteria的相对丰度与土壤有机质含量呈显著正相关，其处理后相对丰度占比下降可能与土壤有机质含量的降低有关；Firmicutes可释放细胞胞外酶，促进半纤维素、纤维素和蛋白质的降解和水解，在土壤类富里酸的合成和腐殖化过程中起着重要作用^[21-22]。因此，CaO₂及H₂O₂类Fenton处理可能会促进土壤后期有机质的降解和腐殖化进程。

图 5  CaO₂及H₂O₂类Fenton处理前后土壤微生物群落在门水平上主要构成及相对丰度的比较

Figure 5.  Composition of microbial communities and their relative abundance on phylum level in control, CaO₂ and H₂O₂ Fenton-like treated soil

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2.6   CaO₂及H₂O₂类Fenton处理对植物生长的影响

图6反映了CaO₂及H₂O₂类Fenton处理对土壤中豌豆植株的发芽率、植株株高、干重和叶绿素含量的影响。由图6可知，相比于未处理的土壤，H₂O₂类Fenton处理后土壤培育的豌豆发芽率、植株株高、干质量和叶绿素含量与未处理相比分别下降了72.73%、93.22%、97.3%和98.59%；而CaO₂类Fenton处理后土壤培育的豌豆发芽率、植株株高、干质量和叶绿素含量分别下降了5.45%、5.39%、10.02%和15.14%。以上结果表明，CaO₂及H₂O₂类Fenton处理对豌豆的生长均有一定的抑制作用。相较而言，CaO₂类Fenton处理对豌豆生长的影响比H₂O₂类Fenton处理的影响更小。这主要是因为CaO₂类Fenton体系有更温和的反应机制。经2种类Fenton处理后，空白组、H₂O₂及CaO₂类Fenton处理组的Eh分别为(116±4.2)、(557±11.3)和(297±18.2) mV，H₂O₂类Fenton处理组的Eh约为CaO₂类Fenton处理组相应值的1.8倍，由此推测，H₂O₂类Fenton处理后，体系中残留的活性氧(ROS)浓度较CaO₂类Fenton组更高，超出了豌豆种子抗氧化酶系统转化和降解ROS的能力，从而导致H₂O₂类Fenton组豌豆的发芽率等4项指标远低于未处理组。相反，CaO₂类Fenton处理由于氧化剂本身的长效性及缓释性，体系中Eh维持较低水平且仍释放低水平的H₂O₂。

图 6  CaO₂及H₂O₂类Fenton处理对土壤豌豆植株生长的植物毒性

Figure 6.  Phytotoxicity on the growth of pea plants in soil with CaO₂ and H₂O₂-Fenton-like treatments

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陈颖等^[23]研究表明，低浓度的H₂O₂(0.5~5.0 mmol·L⁻¹)可提高银杏细胞中SOD和CAT酶的活性；张晓龙等^[24]使用1.5 mmol·L⁻¹ H₂O₂处理黄瓜幼苗12 h，处理后，SOD、CAT等酶的活性增强，同时显著降低了O₂·^－的生成速率。GAO等^[25]使用0.5 mmol·L⁻¹ H₂O₂处理本研究同一品种豌豆植株，处理后，豌豆植株的株高和干重有所提高。结合上述研究分析，CaO₂类Fenton处理24 h后，体系中低浓度H₂O₂可能在一定程度上增强了豌豆植株的抗氧化酶活性，并缓解了类Fenton体系对其造成的氧化胁迫作用，导致CaO₂类Fenton组豌豆的生长及发育受到相对较小的抑制影响。

此外，CaO₂类Fenton体系在反应中释放的钙离子在植物生长过程中也起着至关重要的作用，从而间接促进了豌豆植株的生长。CORPAS等^[26]研究发现，钙离子是植物细胞多种代谢过程的关键性调控因子，植物细胞的过氧化物酶蛋白如分解H₂O₂的H₂O₂酶、乙醇酸循环中的乙醇酸氧化酶等活性均会受到钙离子含量的影响。因此，CaO₂类Fenton体系比H₂O₂类Fenton体系对植物生长的毒性效应更小。

3.   结论

1) CaO₂/Fe(Ⅲ)/柠檬酸类Fenton体系可有效降解土壤中柴油污染。在相同条件下，CaO₂类Fenton体系较H₂O₂类Fenton体系具有更好的降解效果。

2)土壤中柴油的去除率会随着氧化剂的投加量、Fe(Ⅲ)浓度及柠檬酸浓度的增加而先增加后减少。当CaO₂浓度为166.67 mmol·L⁻¹，Fe(Ⅲ)浓度为27.78 mmol·L⁻¹，柠檬酸浓度为27.78 mmol·L⁻¹时，反应24 h后，土壤中柴油降解率达到44.14%。

3) CaO₂类Fenton处理后土壤微生物群落的丰富度和多样性指数均有所提高，H₂O₂类Fenton处理后则均有所降低，2种处理方式均改变了土壤微生物群落的优势菌门组成及比例。

4) CaO₂类Fenton处理和H₂O₂类Fenton处理前后豌豆的发芽率、植株干质量、株高和叶绿素含量均有所降低，其中CaO₂类Fenton体系比H₂O₂类Fenton体系对植物生长的毒性效应更小。