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中国心理健康调查报告显示国内精神障碍疾病负担较重,抑郁和焦虑症患病率较高[1]. 心理健康受到社会和环境等多种因素影响,引发的炎症、氧化应激和神经递质紊乱都可能是神经系统疾病的致病因素. 长期压力应激状态会诱发焦虑、抑郁等精神类疾病,还具有导致器官功能性病变的风险[2]. 环境污染也可影响疾病的发生发展过程,污染物暴露可通过影响下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的功能和应激反应而引发心理疾病[3]. 研究表明心理应激和交通或工业空气污染对健康的不良影响存在明显协同效应[4]. 慢性压力应激状态下,全身易感性增强,环境污染物的毒性作用更为明显. 据报道,慢性压力应激和150 mg·kg−1醋酸铅同时暴露2个月可显著影响大鼠基底皮质酮水平与HPA轴功能[5]. Zhou等[6]发现妊娠期孕妇社会心理压力较大时,铅金属污染物暴露与婴幼儿神经缺陷、认知发育不全等不良健康的关联性增加. Clougherty等[7]研究发现,处于慢性压力下的大鼠对浓缩细颗粒空气污染的呼吸反应更强,并可能存在不同易感性的途径. 现有流行病学数据无法确定差异易感性的生理机制[8],因此,本文基于毒理代谢组学阐明慢性压力应激和污染暴露之间的潜在相互作用.
B[a]P是环境和食品中常见的污染物,主要通过呼吸和饮食途径进入体内,在肝脏蓄积和代谢活化,导致肝功能异常或肝损伤[9]. B[a]P及其代谢物可与体内氨基酸、有机酸、脂质等代谢物相互作用而具有肝毒性效应[10]. 长期慢性心理应激状态下机体生理功能和免疫力显著降低[11],因此可能对B[a]P暴露的应答会产生更复杂影响,但目前未有明确的影响机制研究. 本研究选用慢性不可预知温和刺激(chronic unpredictable mild stimulation,CUMS)作为慢性压力应激模型,采用靶向代谢组学分析方法研究了不同剂量B[a]P和CUMS单独或两者同时暴露对雄性C57BL/6J小鼠肝脏中氨基酸、TCA循环和胆汁酸代谢的影响,并通过统计学分析筛选出了差异代谢物,拟从代谢物差异变化初步探讨肝脏对B[a]P和慢性压力应激的应答和代谢机制.
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B[a]P(≥96%,HPLC级)购自Sigma化学公司(St Louis,MO,USA);甲酸(LC-MS级)、乙腈(LC-MS级)、甲醇(LC-MS级)和甲酸铵(LC-MS级)购自J&K化学公司(Beijing,China);超纯水由美国Milli-Q 超纯水系统(Millipore,Billerica,USA)净化.
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雄性C57BL/6J小鼠(7周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司(Beijing,China),并在中国科学院深圳先进技术研究院喂养,保持12 h光/暗循环,恒温20—26 ℃,相对湿度40% —70%. 动物实验经中国科学院深圳先进技术研究院动物实验和实验动物福利委员会批准,所有涉及动物的实验程序都严格按照国家动物实验法律法规和参考美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》执行.
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小鼠适应环境一周后被随机分成6组(n = 7):对照组(给予等体积橄榄油)、低剂量B[a]P暴露组(2.0 mg·kg−1·d−1)、高剂量B[a]P暴露组(20.0 mg·kg−1·d−1)、CUMS组(给予等体积的橄榄油和CUMS刺激)、低/高剂量B[a]P和CUMS同时暴露组(不同剂量B[a]P暴露基础上进行CUMS刺激). B[a]P溶于橄榄油中采用口服灌胃方式暴露;低/高剂量B[a]P和CUMS同时暴露组在灌胃2 h后以随机排序给予以下CUMS刺激操作:①小鼠置于相对湿度40%—70%的潮湿环境中12 h,②每只小鼠置于50 mL管中禁食禁水2 h进行约束处理,③将4只小鼠同时置于3 cm × 5 cm × 7 cm的盒子中2 h,并禁食禁水. 持续暴露21 d,暴露实验开始和结束时记录小鼠体重. 暴露结束后颈部脱臼法处死小鼠,立即切除肝组织,称取肝脏湿重用于计算肝脏脏器系数(肝脏脏器系数=肝脏湿重/体重 × 100%),随后在液氮中速冻、转移至-80 ℃冰箱储存.
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取适量肝脏组织样本置于2.0 mL离心管中,加入超纯水(肝组织重量:水重量 = 4:1),在高通量组织研磨仪(SCIENTZ-48L,Scientz,China)中进行研磨(4 ℃, 2.0 min). 称取约15 mg肝组织匀浆转移至1.5 mL新离心管中,加入0.2 mL甲醇,涡旋振荡20 min,在4 ℃和12000 r·min−1条件下离心15 min,取上清液进行仪器分析.
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使用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS 8060,Shimadzu,Japan)对肝脏组织中75种氨基酸、有机酸和胆汁酸类相关代谢物(表1、表2和表3)进行测定,采用外标法进行定量. 具体分析条件如下.
色谱参数:色谱柱柱温为40 ℃,流动相流速为0.2 mL·min−1,进样量为1.0 μL.
氨基酸类:Waters ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱(2.1 mm × 100 mm,1.8 μm),流动相A为0.1%甲酸-水,流动相B为0.1%甲酸-乙腈,梯度洗脱程序为:0 — 0.5 min,0% B;6.0 min,75% B;6.1 min,0% B,维持2.0 min.
有机酸类:Waters ACQUITY UPLC®HSS C18 色谱柱(2.1 mm × 100 mm,1.7 μm),流动相A为0.01mol· L−1甲酸铵-水,流动相B为0.01mol· L−1甲酸铵-甲醇,梯度洗脱顺序为:0 min,5% B;2.0 min,60% B;2.1 min,5% B,维持2 min.
胆汁酸类:Waters ACQUITY UPLC®BEH C18 色谱柱(2.1 mm × 100 mm,1.7 μm),流动相A为0.1%甲酸-水,流动相B为0.1%甲酸-乙腈,梯度洗脱程序:0.0 min,40%B;0.5 min,45%B;1.0 min,50%B;2.0 min,52%B;2.5 min,53%B;4.5 min,54%B;5.0 min,55%B,维持1.0 min;7.0 min,70%B;8.0 min,95%B;8.5 min,100%B,维持1.0 min;10.5 min,40% B,平衡2.0 min.
质谱参数:正离子和负离子模式下电喷雾电压分别为4.0 kV和-3.0 kV,雾化气体流量3.0 L·min−1,干燥气流量10 L·min−1,加热气体流量10 L·min−1,接口温度300 ℃,DL温度250 ℃,加热模块温度400 ℃. 各代谢物具体质谱参数如表1、表2和表3所示,定量限为0.02—220.44 μg·L−1,检出限为0.01—77.44 μg·L−1.
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代谢扰乱度(Metabolic effect level index, MELI)是一种用于评估暴露后生物体代谢产物、特定代谢途径或整体代谢反应的定量终点指标[12]. 首先根据公式(1)计算不同组别样品中每个代谢物的变化(MCi). 其中,Ai为暴露组与对照组中单个代谢物i平均浓度的比值,ln(1)用于抵消对照组代谢水平.
将各代谢物的代谢变化汇总为累积代谢变化,根据公式(2)计算MELI值:
当MELIComb值接近MELIB[a]P和MELICUMS平方和的算术平方根时,B[a]P和CUMS的联合效应类型为加和效应;当MELIComb值大于MELIB[a]P和MELICUMS之和时,联合效应类型为协同效应;当MELIComb值小于MELIB[a]P或MELICUMS时,联合效应类型为拮抗效应.
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使用MetaboAnalyst 5.0在线分析软件进行多变量统计分析,基于KEGG数据库进行代谢通路分析(https://www.metaboanalyst.ca/),GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析和绘图. 使用单因素方差分析P < 0.05,偏最小二乘判别分析模型变量影响重要性因子(Variable importance in the projection,VIP)值 > 1.0和ROC曲线下面积(Area under curve,AUC)值 > 0.75,作为显著差异代谢物的筛选准则. 所有数据均以平均数 ± 标准差(Mean ± SD)表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)分析组间差异,P < 0.05为组间差异有统计学意义.
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暴露实验结束时小鼠体重增加系数见图1a. 连续暴露21 d,除2.0 mg·kg−1·d−1的B[a]P暴露组外,20.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P与CUMS单独暴露及不同剂量B[a]P与CUMS共同暴露的小鼠体重平均增长系数均低于对照组,表明高剂量B[a]P与CUMS单独暴露及B[a]P与CUMS同时暴露均可在一定程度上抑制小鼠的体重增长,减缓小鼠的生长速率. 如图1b所示,不同剂量B[a]P与CUMS单独或二者同时暴露的小鼠肝脏脏器系数均低于对照组,表明B[a]P与CUMS均可引发肝脏出现一定程度萎缩,说明肝脏是B[a]P与CUMS暴露的重要靶器官.
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采用PLS-DA评估不同剂量B[a]P暴露后小鼠肝脏氨基酸、TCA循环和胆汁酸代谢的变化. 模型累计贡献率(R2)和模型预测能力(Q2)分别为0.947和0.676,置换检验P值为0.021,表明建立的PLS-DA模型具有良好的解释和预测能力,且不存在过拟合情况. 如图2a所示,两个暴露组和对照组在第一主成分上得到良好区分,说明两个剂量B[a]P暴露均可引起小鼠肝脏代谢紊乱.
筛选出两种B[a]P暴露剂量下的显著差异代谢物,结果如图2b所示(筛选准则见1.6节所述). 与对照组相比,2.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P可使小鼠肝脏中精氨琥珀酸、精氨酸、丙氨酸水平显著上升(P < 0.05)而谷氨酰胺水平显著下降(P < 0.01);20.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P导致小鼠肝脏中谷氨酰胺水平显著降低(P < 0.01)和丙氨酸显著升高(P < 0.05). 以往研究也发现,腹腔注射1 mg·kg−1·d−1的B[a]P可使SD大鼠肝脏组织中氨基酸代谢发生紊乱,导致谷氨酰胺显著下降,精氨酸、丙氨酸等显著升高,谷草转氨酶显著升高[13]. 作为细胞增殖分化的必需营养物质,肝脏中谷氨酰胺含量下降可能与癌细胞增殖摄取有关,并有可能促发肝细胞凋亡[14]. Wang等[15]发现,10 mg·kg−1和20 mg·kg−1 B[a]P暴露3个月大鼠肝癌发生率分别为26.3%和35.3%,Michurina等[16]也发现,200 mg·kg−1 B[a]P暴露3 d后可致大鼠肝细胞凋亡. 同时,谷氨酰胺与丙氨酸还是肝糖原异生的重要底物[17],推测B[a]P暴露也会影响小鼠肝脏中糖异生能量转化途径. 此外,精氨酸与精氨琥珀酸是尿素循环的中间代谢产物,2.0 mg·kg−1 B[a]P暴露后两者显著上升表明尿素循环代谢被扰乱,可能会引发肝功能衰竭、化学性肝损伤等肝脏疾病[18].
如图2c和2d所示,通过对显著差异代谢物进行KEGG代谢通路分析发现,两个不同剂量B[a]P暴露主要影响小鼠肝脏丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酰基-tRNA生物合成、氮代谢、精氨酸代谢合成,而2.0 mg·kg−1·d−1B[a]P影响的9个代谢通路,20.0 mg·kg−1·d−1B[a]P影响的8个代谢通路。 这些结果表明,B[a]P经口暴露后主要影响肝脏氨基酸代谢,低剂量B[a]P暴露的影响更为明显.
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如图3a所示,从PLS-DA因子得分图(R2 = 0.729,Q2 = 0.357,P < 0.001)可以看出,CUMS单独暴露和与B[a]P同时暴露对小鼠肝脏氨基酸和胆汁酸代谢都有明显影响. 根据差异代谢物筛选准则,发现CUMS刺激后,小鼠肝组织中同型半胱氨酸水平显著下降(P < 0.05),这与以往有关CUMS刺激后小鼠肝脏组织代谢变化的结果一致[19]. 同时,发现两个剂量B[a]P和CUMS同时暴露小鼠肝脏的氨基酸和胆汁酸代谢物变化,如图3b中所示,2.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P与CUMS同时暴露使得小鼠肝组织中5-羟基吲哚乙酸、同型半胱氨酸、组氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、丝氨酸水平显著降低(P < 0.05);而20.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P与CUMS同时暴露则主要干扰肝脏胆汁酸代谢途径,表现为甘胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺胆酸、胆酸和α-鼠胆酸水平显著升高(P < 0.05). 即2.0 mg·kg−1·d−1B[a]P与CUMS共同暴露后肝脏氨基酸代谢紊乱而20.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P与CUMS共同暴露后肝脏胆汁酸代谢异常. 作为参与机体胆固醇和脂质代谢的内源性小分子代谢物,胆汁酸在肝组织中的累积会诱导肝损伤的发生[20]. 此外,次级胆汁酸如甘胆酸、牛磺熊脱氧胆酸的水平变化与肝性脑病和2-型糖尿病有关[21]. 同时氨基酸代谢与肝脏正常生理功能密切相关,其紊乱还与肝炎、肝硬化等疾病的发生有关[22]. 已有文献报道,CUMS和B[a]P暴露都可使小鼠肝功能血清生化指标天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶活性升高[23-24],且肝组织HE染色后可观察到明显的组织病理学变化[25-26],表明CUMS和B[a]P可导致肝功能异常和肝损伤. 因此,推测B[a]P与CUMS暴露引发的小鼠肝脏氨基酸和胆汁酸代谢物的变化是其诱导肝功能异常和肝损伤可能的机制之一.
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环境污染和心理健康是疾病发生与发展的两大因素,流行病学调查发现空气污染暴露对处于慢性压力状态机体的不良影响显著增加[27],但具体的生理机制及两者间相互作用尚不完全清楚. 毒理代谢组学可从代谢物角度揭示压力应激和环境污染暴露之间的效应,代谢扰乱度(MELI)可将信息量丰富的代谢组学数据转化成一个综合的定量终点,目前已被用于评估反映PM2.5、氯化石蜡等污染物暴露后细胞代谢的的总体变化情况[28-29]. 小鼠肝组织中氨基酸代谢、TCA循环和胆汁酸代谢在B[a]P与CUMS单独或同时暴露后MELI值见图4.
从图4中看出,20.0 mg·kg−1·d−1的B[a]P对氨基酸代谢、TCA循环和胆汁酸代谢的影响更大. 如图4a所示,氨基酸代谢MELILow-CUMS值小于MELILow和MELICUMS表明低剂量B[a]P与CUMS同时暴露对小鼠肝脏氨基酸代谢的联合效应为拮抗效应;MELIHigh-CUMS值接近于MELILow2+MELICUMS2算术平方根的值,说明高剂量B[a]P与CUMS同时暴露对小鼠肝脏氨基酸的联合效应为加和效应. TCA循环的MELILow-CUMS值大于MELILow+MELICUMS,而MELIHigh-CUMS值小于MELIHigh且大于MELICUMS(图4b),说明低剂量B[a]P与CUMS同时暴露对小鼠肝脏TCA循环具有协同效应,而高剂量B[a]P与CUMS同时暴露对小鼠肝脏TCA循环具有拮抗效应. 不同剂量B[a]P与CUMS同时暴露对小鼠肝脏氨基酸代谢和TCA循环的联合效应均不同,其效应的类型与共同暴露时B[a]P的剂量有关. 此外,胆汁酸代谢的MELILow-CUMS与MELIHigh-CUMS值分别接近MELILow2+MELICUMS2和MELIHigh2+MELICUMS2(图4c),表明不同剂量B[a]P与CUMS同时暴露对小鼠肝脏胆汁酸代谢的联合效应类型均为加和效应.
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本研究通过靶向代谢组学分析方法,发现了暴露在B[a]P下主要影响氨基酸代谢且不同剂量条件下小鼠肝脏代谢应答存在明显差异. 不同剂量B[a]P均可导致谷氨酰胺水平显著下降,丙氨酸显著上升;同时2.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P还可使精氨琥珀酸、精氨酸显著上升. 不同剂量B[a]P对肝脏代谢影响的机制是不同的. 慢性压力应激影响小鼠肝脏氨基酸代谢,同型半胱氨酸含量显著下降. B[a]P与CUMS同时暴露,使得小鼠肝脏氨基酸和胆汁酸代谢发生显著变化,差异的代谢物与两者单独暴露明显不同. 利用MELI评估污染物和精神因素对小鼠肝脏代谢的联合作用,不同剂量B[a]P与CUMS对氨基酸代谢、TCA循环和胆汁酸代谢具有不同的作用,差异的机制还需要进一步研究. 本研究初步阐明了两大因子对肝脏氨基酸、有机酸和胆汁酸代谢的影响,但对脂质、激素等代谢的影响及具体作用机制还需进一步研究. 综上,本研究发现的代谢异常与肝损伤、肝功能异常、肝细胞炎症和肝癌等病变的发生有关,这有助于进一步理解环境污染物与精神因素对机体健康的作用.
苯并[a]芘和慢性压力应激暴露对小鼠肝脏代谢的影响
Effects of exposure to benzo[a]pyrene and chronic stress on hepatic metabolism of mice
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摘要: 环境污染和慢性压力是影响人类健康的两大类常见风险因子,本研究通过表征苯[a]并芘(benzo[a]pyrene,B[a]P)与慢性压力应激(chronic unpredictable mild stimulation,CUMS刺激)暴露对小鼠肝脏代谢的影响,并探讨了同时暴露时两大风险因子之间潜在的相互作用. 采用靶向代谢组学结合多元统计学方法分析了两个剂量B[a]P(2.0 mg·kg−1 ·d−1和20.0 mg·kg−1·d−1)与CUMS刺激单独或联合暴露21 d后,雄性C57BL/6J小鼠肝脏中氨基酸代谢、TCA循环和胆汁酸代谢的变化. 研究发现,2.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P可使小鼠肝脏中精氨琥珀酸、精氨酸和丙氨酸显著升高,谷氨酰胺显著降低;20.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P则主要导致丙氨酸显著上升,谷氨酰胺下降. 慢性压力应激使小鼠肝脏同型半胱氨酸的含量显著下降. B[a]P与慢性压力应激同时暴露时,小鼠肝脏氨基酸和胆汁酸代谢会发生显著变化. 进一步采用代谢扰乱度(metabolic effect level index,MELI)评估了两个风险因子的联合作用效果,发现2.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P和慢性压力应激同时暴露对小鼠氨基酸代谢、TCA循环和胆汁酸代谢的影响分别为拮抗、协同和加和作用;而20 mg·kg−1·d−1 B[a]P和慢性压力应激同时暴露的小鼠氨基酸代谢和胆汁酸代谢的影响均为加和作用,TCA循环为拮抗作用. 结果表明,不同剂量的B[a]P和CUMS暴露造成小鼠肝脏氨基酸代谢和胆汁酸代谢紊乱,差异的代谢物与两者单独暴露时明显不同,且代谢的变化与B[a]P暴露剂量密切相关.Abstract: Environmental pollutants and chronic stress are two common risk factors that have great impact on human health. In this study, potential interactions between these two factors were explored by characterizing the effects of benzo[a]pyrene (B[a]P), or chronic stress, or their combination, on liver metabolism of male C57BL/6J mice using targeted metabolomics followed by multivariate statistical analysis. It was found that the hepatic levels of alanine and glutamine were significantly up- and down-regulated respectively after 21 days of exposure to 2.0 mg·kg−1·d−1 or 20.0 mg·kg−1·d−1 of B[a]P. But only in the 2.0 mg·kg−1·d−1 case did we observe the up-regulation of argininosuccinic acid and arginine, suggesting that the B[a]P-induced alterations in amino acid metabolism were dose dependent. Moreover, chronic stress stimulus was found associated with a significant decrease in the hepatic level of homocysteine. Also, we evaluated the effects of combined exposure on the hepatic metabolism based on the metabolic effect level index (MELI). Specifically, the combined exposure to 2.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P and chronic stress exhibited antagonistic, synergistic and additive effects on amino acid metabolism, TCA cycle and bile acid metabolism, respectively. In contrast, the combined exposure to 20.0 mg·kg−1·d−1 B[a]P and chronic stress showed additive effects on both amino acid metabolism and bile acid metabolism, but antagonistic effect on TCA cycle. We conclude that the exposure to both B[a]P and chronic stress can trigger significant disorders in amino acid and bile acid metabolism, which, notably, differ from those caused by exposure to either alone and were closely related to the exposure dose of B[a]P.
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Key words:
- benzo[a]pyrene /
- chronic stress /
- exposomics /
- mice liver /
- metabolomics
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自十九世纪以来,塑料凭借着低廉的价格和高性价比被广泛生产和使用,塑料制品为人类生活提供了诸多便利,但人类一度长期缺乏对废弃塑料制品的有效回收与管控. 大量废弃的塑料制品随着自然风化、物理摩擦、紫外线裂解等逐渐被分解为粒径小于5 mm的碎片,即微塑料[1]. 微塑料具有难降解性,其在食物链中易于累积放大,最终危害到食物链顶端的人类健康[2],甚至被称为“影响人类生存的最后杀手”. 据相关研究报道,塑料制品可以在自然环境中存留至少400年[3]. 因此,微塑料污染引发的生态安全值得引起人类高度关注.
当前,国际上越来越多的研究人员已开始关注内陆水域中微塑料污染[4]. 2013年,Eriksen等[5]研究报道了北美劳伦森大湖区(即北美五大湖区)的水体存在微塑料颗粒,这是首次报道淡水湖泊中的微塑料污染情况. 同年,Faure等[6]对位于欧洲最高山脉——阿尔卑斯山脉的日内瓦湖微塑料污染进行了研究,发现了表层湖水中微塑料的存在,且其丰度达到
48100 n·kg−1. 我国于2018年也开展了内陆水域的微塑料污染调查,发现湖南洞庭湖和湖北洪湖水体中微塑料的广泛存在,其中通江湖泊-洞庭湖水体微塑料丰度为900—2800 n·m−3,非通江湖泊-洪湖水体微塑料丰度则高达1200 —4600 n·m−3[7] . 内蒙古的王志超及其团队在我国八大淡水湖之一的乌梁素海的冰盖中发现了微塑料的存在,且微塑料平均丰度高达57000 —141000 n·m−3[8].由于湖泊生态系统具有相对稳定的水文特征,微塑料往往可以在湖泊中长期积累,致使湖泊成为流域中微塑料的汇[9]. 因此,研究湖泊湿地生态系统中微塑料在泥-水介质上的污染赋存特征对理解典型水环境系统中微塑料污染现状具有重要意义. 该文选取我国最大淡水湖鄱阳湖的内湖——大明湖(水面面积100 km2)为研究区域,开展水体及沉积物中微塑料分布特征调查,为探知水稻种植与淡水渔业生产集约区的微塑料污染特征提供研究基础. 该研究成果将在我国内湖水体微塑料污染防控、农业用水质量安全保障乃至人类健康风险防控指导上具有现实意义.
1. 材料与方法(Materials and methods)
1.1 研究区概况
余干大明湖地处江西省北部(北纬28.76°—28.86°,东经116.49°—116.54°),隶属鄱阳湖南岸内湖,为国家级蓄滞洪区,处余干县康山大堤圩区内,水面面积100 km2,水深常年在3 m左右,是鄱阳湖第二大内湖. 区域多年平均气温为17.8 ℃,气温-14.3℃—40℃;多年平均降水量为
1586.4 mm,4、5、6月为降雨集中季节,占全年降水量的40%—50%,4—6月平均降雨量都在200 mm以上,有明显的伏旱和秋旱现象,年平均相对湿度为81%. 大明湖具有丰富的水生生物资源,水生生物多样性高,是重要的渔农生产基地和优质农产品供给区. 历史上大明湖内长期存在着生产性捕捞,且大明湖沿岸分布着高度集约化的水稻种植区、淡水渔业生产区以及人口密集的村镇居民区. 据统计,大明湖流域内有两镇两乡,户籍人口约6.7万人,水稻种植面积约51 km2,精养池塘面积约43 km2,其他生产活动(果蔬种植)约1.2 km2.1.2 样品采集
选取典型枯水年的2022年农业退水期(9月),采用梅花点取样法在大明湖水域分3个湖区,北湖、中湖、南湖均匀设置11个采样点,其中中心湖区设置8个采样点(采样间隔3 km),入湖口3个(S9—11,图1),每个点位采集3个平行样,将同一采点位样品充分混匀,带回实验室.
对湖泊表层水样(水下0.5 m)及表层沉积物(深度0—20 cm)采集相应样品[10]. 采样前所有采样工具均用超纯水清洗2—3遍,使用5 L采水器采集湖泊表层水样,每个采样点采集水样10 L,并用不锈钢筛网过滤(孔径为20 μm),再用纯水将截留物冲洗进采样瓶(250 mL)中,当天运回实验室冰箱(4 ℃)保存;采用金属材质彼得森采泥器采集湖泊表层沉积物样品,采集的样品装入铝箔材质采样袋中,随水样当天运回实验室低温(4 ℃)保存.
1.3 微塑料分离及提取
水样首先进行干燥处理,样品完全干燥后,加入30% H2O2溶液进行消解,用铝箔纸密封,摇床振荡72 h,直至溶液澄清,再用0.47 μm聚四氟乙烯滤膜对上清液进行真空过滤[10],将滤膜保存于玻璃培养皿中,低温干燥,以备观察.
采用饱和NaCl浮选与H2O2消解相结合的方法对沉积物样品进行预处理[11]. 称取冷冻干燥后的样品50 g,先将密度为1.2 g·mL−1的饱和NaCl溶液加入样品中进行初次分离浮选[12],浮选静置时长为24 h,重复上述过程3次,用饱和NaCl,溶液对1—5 mm和<1 mm粒径范围的颗粒回收率分别达到97.5%和95.5%. 再用30%H2O2进行消解处理,此后步骤与水样处理一致.
1.4 微塑料物理化学性质检测
每个采样点位选取3个平行样进行观察检测,采用体式显微镜(SZX16, Olympus, Japan),在放大40—100倍下通过软件IMSA-2000对干燥滤膜上的微塑料进行拍照计数. 微塑料按形态特征分为纤维、颗粒、碎片、薄膜状共4种类型[13]. 按颜色分为红色、蓝色、绿色、透明、白色和黑色共6类[14]. 根据其粒径不同可分为小于0.5 mm、0.5—1 mm、1—2 mm和2—5 mm等4个梯度[15].
选择具有代表性的微塑料样品,采用拉曼光谱仪(DXR, Thermo Fisher, USA),根据已知的聚合物光谱确定微塑料的聚合物类型,对微塑料样品的化学组成进行识别.
1.5 质量控制
为保证数据的准确性,实验所用仪器均为非塑料材质制品. 实验中进行了空白对照以除去空气中微塑料的干扰. 在空白对照组样品中仅检测到0.10±0.08个纤维,数据可忽略不计. 实验中所用化学溶液均使用滤膜过滤,实验工具均用超纯水洗涤至少3遍.
1.6 数据处理
采样点位分布图采用软件ArcGIS 10.7绘制. 实验数据分析统计和绘图分别用Microsoft Excel 2019和Origin 2021进行处理及绘制. 水体微塑料丰度单位用n·m−3表示,而沉积物丰度单位用n·kg−1来表示;微塑料粒径设置为小于0.5 mm、0.5—1 mm、1—2 mm和2—5 mm4个梯度[15].
2. 结果与讨论(Results and discussion)
2.1 微塑料丰度与分布
由图2可知,按照区域划分(图1),大明湖水样中微塑料丰度为1900—
10900 n·m−3,平均丰度为4309 n·m−3,其中南湖(S1—S3)微塑料平均丰度为3230 n·m−3、中湖(S4、S5)平均丰度为1970 n·m−3、北湖(S6—S8)平均丰度为4037 n·m−3、入湖口(S9—S11)平均丰度为7244 n·m−3. 其中居民区排水口(S10)微塑料丰度最高,为10900 n·m−3,S5号点位微塑料丰度最低,为1900 n·m−3,中湖区到北湖区的微塑料丰度呈递增状.大明湖沉积物中微塑料丰度为960—1860 n·kg−1,平均丰度为
1452 n·kg−1,其中南湖(S1—S3)微塑料平均丰度为1525 n·kg−1、中湖(S4、S5)平均丰度为1032 n·kg−1、北湖(S6—S8)平均丰度为1787 n·kg−1、入湖口(S9—S11)平均丰度为1334 n·kg−1. 北湖区(出口水域)S8号点位的微塑料含量最高,达到1860 n·kg−1,中湖区S5号点位最低,为960 n·kg−1. 中湖区到北湖区的沉积物中微塑料丰度也是呈递增状态.11个采样点位的水体及沉积物存在显著性差异(P<0.01),这也就解释了大明湖水体和沉积物中微塑料从整个区域来看呈现相似的分布规律,但就单个点位来看,水体和沉积物中的微塑料赋存存在差异,说明微塑料在不同环境状态下,赋存于水体及沉积物中的含量不同.
该研究区域中的S10号点位处于乡镇污水处理设施排放口,附近为居民集中区,受人为因素影响较大. 洗衣服废水中的合成纺织纤维因体积小,不能被污水处理厂的处理单元完全捕获,排放到水体中仍会造成环境污染[16]. S9,S11号点位同样为入湖口,S9号点位处于农田灌溉水入大明湖口,微塑料含量也相对较高. S11号点位处于水产养殖水入大明湖口,S9号和S11号点位微塑料含量均低于S10号点位,这说明了生活用水造成的微塑料污染最为严重,水产养殖活动导致的微塑料污染小于农业活动造成的污染. 大明湖中湖(S4、S5)微塑料含量较少,这可能是因为离人为活动区域较远,人类活动干扰较少. 大明湖北湖(S6—S8)离入湖口(S9、S11)较近,且常有渔船活动,这就可为大明湖下游水域中微塑料丰度较高作解释.
沉积物中入湖口(S9—S11)微塑料丰度相较于水体有所降低,这可能是因为入湖口水体流速快,沉积泥沙及微塑料被带入大明湖内. 大明湖北湖(S6—S8)微塑料丰度最高可能是因为该区域位处于下游处,水面宽阔平坦,利于微塑料沉积和蓄积. 大明湖中游水流流速较快,微塑料丰度较低,由此可知微塑料的迁移在不同水环境中受空间影响较大[17].
目前对于内陆河流的微塑料研究较少,其中Wang等[7]对洞庭湖和洪湖水体微塑料的研究发现洞庭湖水体微塑料丰度为900—
2800 n·m−3,洪湖水体微塑料丰度高达1200 —4600 n·m−3. 鄱阳湖各湖区微塑料丰度差异较大,安乐河入鄱阳湖段[18]沉积物微塑料浓度为180 n·kg−1,鄱阳湖湖口与长江连通段沉积物丰度982 n·kg−1[19]. 与前人研究结果对比发现,大明湖微塑料污染水平较高,这可能是与枯水期湖泊水量偏少有关,2022年下半年鄱阳湖流域经历了历史罕见的持续大旱,大明湖水位在9月份处于罕见的低枯状况,枯水期微塑料浓度高,这与余厚平等[20]的研究结论一致。2.2 微塑料的形态分布特征
微塑料粒径设置可分为<0.5 、0.5—1、1—2 和 2—5 mm共4个梯度. 如图3大明湖表层水样与沉积物样粒径大小分布情况大致相同,粒径<0.5 mm的微塑料所占比例最大,在水样与沉积物样中占比分别为71.43%与59.72%,其次为0.5—1 mm,在水样与沉积物样中占比分别为18.67%和23.78%. 2—5 mm的粒径占最少,分别为2.87%(水样),3.34%(沉积物). 大明湖表层水体与沉积物中微塑料粒径分布情况与Tang等[21]的研究结果一致,符合微塑料粒径越大含量越少的规律. 这可能是因为大明湖周围分布了大片农田,伴随农耕活动以及紫外线的裂解作用,微塑料加快由大尺寸裂解为小尺寸并且微塑料在地表径流作用下与地面以及湖岸产生摩擦等机械作用使得微塑料破碎分解的速度加快[22]. 采样时大明湖正处于枯水期,水流较平缓,微塑料能浮于水面与外界环境有较长时间的接触,并通过物理摩擦、生物降解、紫外线裂解等作用缓慢分解.
微塑料的形状占比及显微镜下拍摄的典型微塑料照片如图4所示,观察到的微塑料主要分为纤维状、碎片状、颗粒状和薄膜状. 由图5可知,大明湖水域微塑料主要以纤维状和薄膜状的形态存在于表层水体与沉积物中,水体中纤维状和薄膜状分别为44.9%、35.1%;沉积物中纤维状和薄膜状分别为42.6%、40.9%. 大明湖水体中微塑料形状分布情况与相关的研究结果相符,如太湖(48%—84%)[23]和洞庭湖(41.9%—91.9%)[7]中占比最大的均为纤维状微塑料. 不同形态微塑料通常具有不同来源,大明湖中纤维含量高可能是纤维不易分解、居民大量使用纺织品及渔业活动中使用渔网渔具所致[24]. 薄膜含量较高是因为大明湖周围分布范围较大的农田,农业活动中覆膜会产生大量薄膜状微塑料,农用塑料薄膜是农田土壤中微塑料的主要来源[25]. 颗粒状微塑料在表层水体与沉积物中占比最小,分别为4.5%和5.4%. Napper等[26]从个人护理产品中提取到了PE微珠,可见,个人洗护用品也是颗粒状微塑料的主要来源. 碎片主要是塑料制品在自然条件下裂解而成,如塑料包装袋和塑料容器[27].
大明湖水体与沉积物中微塑料颜色组成主要为透明、黑色、白色、蓝色、红色和绿色等6种(图6). 透明色与白色的区别在于,透明色的透明度更高,能透过微塑料本身观察到滤膜. 其中,在水体中透明色微塑料占主导地位,占比为56.52%,其次为黑色,占比为11.96%. 沉积物中透明色占比最大,占总数的63.82%. 其次为绿色(9.44%)和黑色(9.25%),蓝色在水体与沉积物中均占比最少,分别为5.95%和3.88%.
大明湖水体与沉积物中微塑料颜色的分布情况与已有研究结果略有差异,例如在鄱阳湖水体中占比最大的是彩色微塑料(48.9%)[28],而透明微塑料在洞庭湖(71.3%)和洪湖(77.9%)水体中占优势[7]. 大明湖水体与沉积物微塑料颜色丰富多样,表明这些微塑料的来源较为广泛,透明色微塑料可能是农用透明色薄膜的大量使用所产生的并且透明塑料袋使用量较大,经过风化、摩擦、紫外线裂解成微塑料,这可能是透明微塑料占比较多的原因[29 − 30]. 黑色微塑料可能是汽车轮胎或农用黑色薄膜的大量使用所产生的. 绿色微塑料主要以纤维与薄膜状存在,可能是渔业活动中大量使用绿色渔网和渗透膜导致的. 此外,研究发现水生生物更容易误食颜色鲜艳的微塑料颗粒[31],这对生物多样性维持存在生态风险,通过食物链传递,则最终对人类健康产生危害.
2.3 大明湖微塑料的组成成分及来源分析
该研究采用拉曼光谱法鉴定微塑料的聚合物类型. 选取了具有代表性的120个疑似微塑料,检测结果显示,100个微塑料被鉴定为微塑料,主要包含聚丙烯(polypropylene,PP)、聚乙烯(polyethylene,PE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯 (polyethyleneterephthalate,PET)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)和尼龙6(nylon6). 其中,PP在所有类型中占主要地位,约占48.23%,其次为PE,约占38.77%;薄膜和纤维类聚合物以聚乙烯(polyethylene,PE)为主;碎片类以聚丙烯(polypropylene,PP)聚合物为主(图7).
纤维类的主要成分为PE和PET,PE主要来源于渔网和鱼线的风化碎裂;PET主要来源于纺织服装品,通过洗涤过程随生活污水排入大明湖内;大明湖上频繁的渔业活动导致大量渔网和渔线在环境中遗留;居民生活排放废水也是纤维状微塑料的主要来源. 此外,薄膜类成分为PE和PP,这两种材料最常见的用途为制作塑料袋,如食品包装袋、购物袋、保鲜膜等,而农业大棚和地膜覆盖也是一个不容忽视的主要来源. 大明湖周围围绕着大面积农田,频繁的农作活动导致地膜加速分裂成薄膜状微塑料,是薄膜状微塑料的主要来源.
3. 结论(Conclusion)
(1)大明湖表层水体微塑料丰度范围1900—
10900 n·m−3,沉积物中微塑料丰度为960—1860 n·kg−1,形态均以纤维和薄膜为主,颜色均以透明和黑色为主. 微塑料的粒径以<0.5 mm为主,表层水体与沉积物分布大致相似且微塑料丰度随粒径增大而下降.(2)大明湖流域水体及沉积物微塑料都具有较为显著的空间差异,大明湖下游以及污水排放口处微塑料丰度显著高于其他点位.
(3)分析发现,该研究区域的微塑料污染具有多源贡献特征,具体主要来源为直排生活污水、污水处理厂尾水、农业灌溉退水和排放的养殖废水,以及农业生产、渔业捕捞、处置不当的生活垃圾等形成的面源污染.
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图 2 不同剂量B[a]P暴露对小鼠肝脏氨基酸、TCA循环和胆汁酸代谢的影响
Figure 2. Effects of exposure to B[a]P on amino acids, TCA cycle and bile acid metabolism in the liver of mice (a) PLS-DA score plot;(b) Box plots of amino acids with the significant difference in different groups;(c) the relevant metabolic pathways after exposure to B[a]P with low doses ;(d) the relevant metabolic pathways after exposure to B[a]P with high doses
表 1 氨基酸代谢物的质谱参数
Table 1. Mass spectrometry parameters for amino acid metabolites
化合物Compounds 检测离子对Transitions 化合物Compounds 检测离子对Transitions 化合物Compounds 检测离子对Transitions 肾上腺素 183.9→166.1a 183.9→107.2b 去甲肾上腺素 170.2→107.1 170.2→152.2 3-羟基苯甲酸 154.1→136.1 154.1→80.1 5-羟色胺 177.2→160.2 177.2→115.1 褪黑素 233.2→174.2 233.2→159.1 3-羟基犬尿氨酸 224.9→208.1 224.9→162.1 胆碱 104.2→60.2104.2→58.2 肌酸 132.1→90.2132.1→44.2 5-氨基戊酸 118.4→55.2 118.4→101.1 谷氨酰胺 147.2→84.1 147.2→130.1 多巴胺 153.9→91.2 153.9→136.9 5-羟基吲哚乙酸 192.3→146.1192.3→91.2 甘氨酸 76.1→30.2 肌酐 114.3→44.2 二羟基苯乙酸 166.4→122.9 组胺 112.3→95.2 112.3→41.2 犬尿酸 190.1→144.1190.1→89.1 γ-氨基丁酸 104.1→87.1104.1→69.1 多巴 198.1→152.2198.1→107.2 二羟基苯乙醇 152.8→123.0152.8→95.1 犬尿氨酸 209.2→192.2209.2→94.1 丙氨酸 90.1→56.2 90.1→44.2 苯丙氨酸 166.1→120.2166.1→103.1 牛磺酸 126.0→107.8 126.0→43.95 色氨酸 205.2→188.0205.2→146.1 酪胺 138.2→121.1138.2→77.1 酪氨酸 182.1→91.1182.1→136.2 黄尿酸 206.1→160.1206.1→132.1 4-羟基脯氨酸 132.1→86.2132.1→68.1 乙酰胆碱 146.2→97.1 146.2→43.1 精氨酸 175.2→70.2 175.2→60.2 精氨琥珀酸 291.2→70.1 291.2→116.2 天冬精氨 133.1→87.2133.1→28.2 天冬氨酸 134.1→74.2134.1→88.1 肉碱 162.2→60.3162.2→85.2 瓜氨酸 176.2→70.2 176.2→159.2 半胱氨酸 122.2→59.2122.2→76.1 胱氨酸 241.3→74.1 241.3→152.1 谷氨酸 148.1→84.1148.1→56.1 组氨酸 156.2→110.2156.2→56.2 同型半胱氨酸 136.2→90.1136.2→56.2 异亮氨酸 132.2→86.2 132.2→69.2 亮氨酸 132.4→86.2 132.4→30.2 赖氨酸 147.4→84.2 甲硫氨酸 150.2→56.1 150.2→104.1 烟酰胺 123.1→80.1123.1→78.1 鸟氨酸 133.2→70.2 133.2→116.2 丝氨酸 106.1→60.1 脯氨酸 116.1→70.1 苏氨酸 120.1→104.1120.1→74.3 缬氨酸 118.1→72.2118.1→55.2 表 2 有机酸代谢物的质谱参数
Table 2. Mass spectrometry parameters for organic acid metabolites
化合物Compounds 检测离子对Transitions 化合物Compounds 检测离子对Transitions 化合物Compounds 检测离子对Transitions α-酮戊二酸 145.0→100.9 145.0→56.8 乌头酸 173.0→84.9173.0→129.0 柠檬酸 191.0→111191.0→86.9 富马酸 115.1→71.1115.1→26.9 衣康酸 129.0→60.1 129.0→40.8 乳酸 89.1→42.9 苹果酸 133.0→71.1 133.0→73.0 丙酮酸 87.1→43.0 琥珀酸 117→73.1 表 3 胆汁酸代谢物的质谱参数
Table 3. Mass spectrometry parameters for bile metabolites
化合物Compounds 检测离子对Transitions 化合物Compounds 检测离子对Transitions 化合物Compounds 检测离子对Transitions 甘氨胆酸 464.0→74.0a 464.0→402.2b 甘氨鹅脱氧胆酸 448.1→74.0 448.1→386.0 牛磺胆酸 514.2→124.0 514.2→107.0 α-鼠胆酸 373.1→355.3 373.1→373.2 牛磺鹅脱氧胆酸 498.0→124.0 498.0→80.0 β-鼠胆酸 391.1→355.3 391.1→373.2 ω-鼠胆酸 373.1→159.2 373.1→337.5 鹅去氧胆酸 357.1→105.1 357.1→135.4 猪去氧胆酸 357.1→161.2 357.1→135.2 石胆酸 359.1→135.2 359.1→95.1 去氧胆酸 391.0→345.3 391.0→327.1 胆酸 407.3→343.3 407.3→288.9 熊去氧胆酸 357.1→161.2 357.1→135.2 牛磺熊脱氧胆酸 498.0→124.0 498.0→80.0 甘氨熊脱氧胆酸 448.05→74.0 448.05→386.2 注:a定量离子对:quantitative ion; b定性离子对:qualitative ion. -
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