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生物炭特指为生物质在缺氧或有限氧气供应条件下，在相对较低温度下（<700 ℃）热解得到的富碳产物，通过施入土壤进行土壤管理，旨在改良土壤、提升地力、实现碳封存[1]，2013年，国际生物炭协会（IBI）再次完善了生物炭的概念和内涵，指出生物炭是生物质在缺氧条件下通过热化学转化得到的固态产物，它可以单独或者作为添加剂使用，能够改良土壤、提高资源利用效率、改善或避免特定的环境污染，以及作为温室气体减排的有效手段。这一概念更侧重于在用途上区分生物炭与其他炭化产物，进一步突出其在农业、环境领域中的作用[2]。生物炭是一种多孔、高比表面积、难降解、含碳丰富的材料[3]，在土壤中具有高度的稳定性，可以存在上千百万年[4-6]。研究表明生物炭对污染物具有高吸附性能，在土壤污染修复上具有很大的潜力[7-8]。近十年，研究者高度关注生物炭对土壤中重金属的影响，且多集中于生物炭固定土壤重金属[9]、影响重金属淋溶[10]和吸附-解吸[11]、改变重金属形态以及生物炭对重金属生物有效性影响[12-13]的研究。很多研究结果表明，生物炭可以有效吸附和固定土壤重金属，使重金属从有效态向稳定态转化，降低重金属的生物有效性，其机制有两方面：一方面，生物炭具有高电负性，高阳离子交换量，表面有丰富的官能团（—OH, —COOH, —C=O—和C=N等），并含有矿物质元素[14]。因此，它可以与重金属发生直接的相互作用，比如静电吸引、离子交换、络合、沉淀。另一方面，生物炭通过影响土壤理化性质间接影响土壤中的重金属形态[15]，进而影响其生物有效性[16]。在近几年，基于生物炭对土壤重金属影响的大量报道中，有多位学者利用荟萃分析，从不同的角度总结了生物炭对植物吸收重金属的影响[17-19]。重金属形态是影响重金属生物有效性的重要指标，然而迄今为止还缺少生物炭对土壤中重金属形态影响的归纳。因此，我们系统总结了生物炭对土壤重金属形态特征的影响，并分别对生物炭影响土壤和植物中重金属生物有效性及其机制进行了较为详细的阐述，在此基础上提出了未来的研究方向。
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土壤中重金属以不同的形态存在。Tessier等[20]在1979年提出土壤重金属连续提取法及改进方法。按提取顺序, 土壤中的重金属可被划分为5种形态：交换态（包括水溶态）、碳酸盐结合态（包括专性吸附结合态）、铁锰氧化物结合态、有机结合态、残渣态（硅酸盐结合态）。具体来说，交换态和碳酸盐结合态易于被生物利用。碳酸盐结合态对pH变化较为敏感。有机结合态中可溶性微量金属会缓慢释放。残渣态最稳定，包裹在原生和次生矿物晶格中[20-21]，且与内球体有较强的结合[22]。而欧共体司（BCR）将土壤重金属形态分为4种：弱酸提取态、可还原态、可氧化态以及残渣态[23]。弱酸提取态对应交换态和碳酸盐结合态，可还原态对应铁锰氧化物结合态，可氧化态对应有机结合态。根据生物体吸收情况，可将重金属形态分为3部分：（1）交换态和碳酸盐结合态为最具流动性和生物有效性的部分；（2）铁锰氧化物结合态和有机结合态为生物有效性较低的部分；（3）残渣态为潜在不流动部分[24]。重金属的稳定机制包括物理吸附、阳离子交换、沉淀和表面络合，通过这些作用来降低其生物有效性[25]。以上3部分的不同也体现在重金属与生物炭的相互作用机制上，其中，具流动性和生物有效性的部分与生物炭进行物理吸附和发生阳离子交换；生物有效性较低的部分与生物炭阳离子-π相互作用；潜在不流动部分与生物炭发生表面络合反应[26]。
本文在web of science检索系统中以“biochar”、“soil”、“heavy metal speciation”为检索词查询了2014年—2020年的英文文献，筛选给出具体形态变化数据（>400个）的文献，并对数据进行整理及统计分析。本文选择该领域文献中常见的4种重金属（Cd、Cu、Zn和Pb）。由于其他重金属（Cr、As、Hg等）的数据较少，因此未对它们进行统计。图1显示了生物炭添加到土壤中后，土壤重金属的不稳定态（可交换态或酸溶态）总体降低的百分率和稳定态（残渣态）总体升高的百分率。在生物炭添加下，土壤中Cd、Cu、Zn和Pb的不稳定态百分率分别降低25.6%、36.4%、16.5%和26.1%（图1a），不同重金属不稳定态变化具有显著性差异（P<0.05）。Cd、Cu、Zn和Pb稳定态百分率分别升高35.9%、22.9%、32.8%和46.5%（图1b）。上述现象的具体机制为：一般，生物炭加入到土壤后经过一段时间的培养，土壤中的可交换态或弱酸提取态重金属会转化为有机结合态和残渣态，这意味着生物炭会使可溶性重金属趋于稳定。生物炭的自身特性和对土壤理化性质的改变影响重金属在土壤中的形态，进而影响重金属的固定。首先，生物炭的碱性使土壤中OH−、
CO2−3 和SiO2−3 增加，促进不溶性重金属的氢氧化物、硅酸盐和碳酸盐的形成，减少可交换态重金属含量[27]。其次，生物炭促使土壤中重金属的有机结合态和残渣态增加，是因为生物炭表面含氧官能团（—OH、—COOH等）的存在[28]，也可能是由于CO2−3 和PO3−4 在生物炭表面与重金属形成沉淀造成的[29]。最后，生物炭含有矿物质成分，可与重金属发生吸附、络合和沉淀，将重金属由可交换态转化成残渣态[16]。其中，生物炭引起的土壤pH改变是导致重金属存在形态改变的主导机制。生物炭使土壤pH增加，氧化铁和氧化锰的吸附/络合作用增强，官能团增多会导致有机质的螯合作用，因此，弱酸提取态重金属含量降低[30]。另外，土壤pH增加，使得土壤粘土矿物表面负电荷、水合氧化物和有机质增加，加剧了对重金属的吸附，例如，Cd可能以CdCO3、Cd(OH)2和Cd(OH)PO3·H2O的形式存在，Cu以Cu(OH)2存在，Pb以PbCO3、2PbCO3·Pb(OH)2、PbSO4和5PbO·P2O5·SiO2的形式析出以及Zn以ZnCO3、ZnHCO3、Zn(OH)2和水锌矿的形式存在[22, 31-37]。此外，生物炭对Cd和Pb稳定态的影响总体上无显著性差异（P>0.05）。生物炭对Cd和Pb有较好的固定效果（图1b），尤其对Pb，可能是因为生物炭对两种重金属不同的结合机制。具体来说，生物炭使土壤pH值升高，导致Cd以氢氧化物或碳酸盐沉淀的形式析出，而Pb可以与生物炭表面官能团配合降低Pb的活性[38]。相比其他重金属，Pb更容易被固定（图1b），Wu等[39] 的研究发现了类似的结果。相反，图2显示生物炭添加后，土壤中Cd、Cu、Zn和Pb的不稳定态含量升高，稳定态含量降低，这说明生物炭的添加反而不利于重金属的稳定。例如Cd由可氧化组分转化为可还原组分，原因可能是生物炭上存在Fe、O、H等元素，这些元素为Cd形成铁锰氧化物或氢氧化物提供了有利条件[40]。因此，关于生物炭如何影响土壤重金属形态的转化及其机制有待于进一步深入研究。 -
生物炭的原料和热解温度会影响重金属形态的变化。Lu等[41] 通过盆栽实验，发现不同原料生物炭对重金属生物有效性有差异。生物有效性改变主要受制于重金属形态的转化。总体来看，木材类、农作物类与其他原料的生物炭对重金属不稳定态的影响均有显著性差异（P<0.05），而粪便、绿肥和污泥类的生物炭对重金属不稳定态的影响无显著性差异（P>0.05）。不同热解温度（300—400 ℃、401—500 ℃和501—800 ℃）的生物炭对重金属不稳定态和稳定态的影响均无显著性差异（P>0.05）。图3为不同生物炭添加到土壤后，Cd不稳定态和稳定态的变化。从图中可以看出，木材和污泥在401—500 ℃热解制备的生物炭使Cd的不稳定态含量下降较多。并且有研究发现，相比于600 ℃热解制备的生物炭，400—450 ℃热解制备的生物炭可以有效降低Cd的生物有效性[42-43]。
不同生物炭添加到土壤后，Cu、Zn和Pb不稳定态和稳定态的变化如图4—图6所示。相比于其他原料和热解温度的生物炭，501—800 ℃热解制备的木材类生物炭可以有效降低土壤中Cu不稳定态的含量，增加了Cu稳定态的含量（图4）。很多研究者把Cu的迁移和固定与溶解性有机碳（DOC）联系在一起[38, 44-45]。Han等[46] 总结并比较了粪便、农作物和木质材料生物炭的DOC含量，发现木质材料类生物炭的DOC含量最低；而501—700 ℃热解制备的生物炭DOC含量远小于250—500 ℃热解制备的生物炭。DOC较多，会与Cu形成可溶的络合物[47]，增加Cu的迁移。因此，501—800 ℃热解制备的木材类生物炭含有较少的DOC，降低了Cu的迁移性[48]。另外，如图5所示，以农作物为原料在300—400 ℃下热解制备的生物炭显著降低Zn的不稳定态含量。同样，300—400 ℃热解制备的污泥生物炭显著降低Pb的不稳定态含量（图6），这是因为相比于其他原料制备的生物炭，污泥生物炭含有的矿物质元素较多，低温热解的生物炭会释放更多的P、K和Ca等元素[48]，这些元素和Pb的固定有关。值得注意的是，还有研究表明污泥生物炭含有较多的重金属[49]，这一点也不可忽视。Cao等[50] 发现P元素可能与Pb的固定有关。P与Pb会形成Pb5(PO4)3Cl和Pb5(PO4)3(OH)稳定存在于土壤中[31, 50]。同时，Uchimiya等[51] 也报道了低温热解制备的生物炭更容易固定Pb。
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生物炭的添加量及添加时间可以影响土壤重金属的形态。从生物炭的添加量对不同重金属形态转化情况来看，相比于生物炭添加量为1%，其添加量较高（>3%）时，土壤Cd、Cu、Zn和Pb的不稳定态含量以及稳定态含量均有显著性差异（P<0.05）。有研究者报道，相比于添加量为1%，添加量为5%的鸡粪生物炭和油菜秸秆生物炭可以显著降低Cd的植物有效性[52]。同样，也有研究者发现相比于1%的添加量，5%的生物炭添加比例可以显著降低重金属Cu和Pb的生物有效性。另外，从图3—6中可知，随着实验时间的不同，重金属的形态呈动态变化。例如，Cd不稳定态的变化随着实验时间的增加而降低；对于Pb，其不稳定态变化规律随着时间的增加先升高再减小。具体动态变化的原因，可能是因为不同的实验时间内，生物炭与重金属以及土壤的相互作用不同。例如，Hua等[53] 将500 ℃热解的小麦秸秆和苹果树生物炭添加到土壤后，进行为期130 d的培养实验，发现Sb的各个形态含量随培养时间交替变化，并指出添加小麦秸秆生物炭的前20 d和苹果树生物炭的前50 d，Sb的迁移增加，可能是由于生物炭中官能团的静电排斥。相反，添加小麦秸秆生物炭的后20 d和苹果树生物炭的后50 d，Sb的迁移降低，可能是因为Sb和生物炭形成络合物，次生矿物沉淀以及Sb和生物炭诱导的土壤中腐殖酸有机络合。可见，重金属形态在生物炭施入后随时间呈动态变化，并且其变化机制不同。
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土壤质地、pH和有机碳含量会影响生物炭对土壤重金属形态的转化（图3—6）。在不同土壤中，生物炭在固定金属和活化金属方面的作用不尽相同[54]。
土壤质地分为三类：砂质、壤质和粘质。生物炭添加下，不同土壤质地对重金属不稳定态含量下降程度的影响有显著性差异（P<0.05）。对于Cd，砂质土壤中，其不稳定态百分率下降较多（27.4%），相应地，在砂质土壤中其稳定态百分率上升较多（30.6%）。一般而言，相对于粘质土，砂质土含有较少的有机碳和黏土矿物，因此对重金属的吸附较低[55]，这意味着砂质土中有更多有效态重金属。生物炭的加入，增加了对有效态重金属的吸附，因此，对不稳定态重金属的降低起着更明显的作用。土壤pH对生物炭影响重金属不稳定态的变化有显著性差异（P<0.05）。Cd、Cu和Pb在酸性和碱性的土壤中不稳定态平均下降率分别为6.8%和33.4%、26.9%和35.0%和12.4%和42.4%（图3、4和6）。Ahmad等[54]发现在碱性靶场和酸性农业土壤中，影响重金属固定的因素是不同的。相比其他重金属，Pb对pH更为敏感（图6）。另外，不同土壤有机碳含量对生物炭影响重金属不稳定态的变化也有显著性差异（P<0.05）。在适中（10—30 g·kg−1）和低（<10 g·kg−1）含量有机碳的土壤中，生物炭添加更能增加Cu和Zn的稳定。
总体上，生物炭的添加能够明显降低大部分重金属的有效态，减少其生物有效性。以上所述详见图7。另外，除了土壤质地、pH和有机碳，土壤生物性质也可影响重金属形态变化。例如，Liu等[56]发现生物炭可以降低重金属钴的毒性，使其酸溶态含量与土壤酶活性（脲酶和碱性磷酸酶）呈负相关（P<0.01）。Cui等[57]指出生物炭添加到土壤后，土壤中可交换和还原态重金属（Zn、Cu、Cd、Cr和Pb）与土壤微生物（异常球菌、拟杆菌、厚壁菌、变形菌和革兰氏阴性细菌）多样性具有相关性（P<0.01）。
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根据ISO 11074[58]，生物有效性是衡量土壤中的化学物质可被人类或生物体吸收或代谢，或可与生物系统相互作用的程度。评价重金属的生物有效性有不同的指标。比如，土壤重金属总量、化学试剂（CaCl2、EDTA和DTPA等）一步法提取的重金属含量、重金属各个形态的含量。除重金属浓度外，生物学评价法也能预测土壤重金属的生物有效性，比如，动植物中重金属的含量，植物中重金属的富集系数和转运系数等[59]。近几年来，很多学者研究了土壤中施加生物炭后，化学试剂提取重金属含量、植物中重金属含量的变化，进而明确生物炭对重金属生物有效性的影响（表1）。本文引用该领域文献中使用的生物有效性评价方法，主要包括化学试剂提取法和生物学评价法。
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不同原料以及热解温度制备的生物炭对重金属的固定以及生物有效性的影响效果不同。而重金属在土壤中被吸附或固定的潜力直接影响其生物有效性。首先，归纳了生物炭原材料和热解温度对土壤重金属的固定和吸附的影响。有研究发现鸡粪生物炭有利于降低Cu的生物有效性[60]。Yang等[61] 用一年的培养实验，证明了稻草生物炭在降低土壤中重金属（Cd、Cu、Pb、Zn）生物有效性方面比竹子生物炭具有更大的潜力。还有研究发现胡桃壳生物炭和小麦秸秆生物炭添加的土壤中Cd和Pb的生物有效性差异显著[34]。另外，厨余垃圾生物炭有较多的碱性金属（Na、K、Ca、Mg），因此有很好的离子交换能力，所以与玉米秸秆和花生壳生物炭相比，对Pb和Cd有更好的固着性能[38]。Awad等[42] 发现在酸性土壤中，600 ℃热解制备的园林废弃物生物炭对土壤Pb、Cu和Zn生物有效性的降低效果优于400 ℃生物炭。Qian等[36] 发现高温（550 ℃）热解制备的生物炭有较高的灰分含量，比低温（350 ℃）生物炭对Zn有更强的吸附固定能力。重金属与生物炭发生结合导致其生物有效性的改变。例如，有研究者认为金属碳酸盐的形成以及与生物炭表面官能团的相互作用是重金属生物有效性下降的机制[16]。目前，研究者基本上选取不同类型的生物炭研究土壤重金属生物有效性，但是对于不同原料以及不同热解温度的生物炭如何改变土壤重金属生物有效性还缺乏系统的研究，并且相应机制尚不清楚。
生物炭对土壤中不同重金属的固定以及生物有效性的改变有差异。Meng等[25] 研究发现生物炭处理对于降低4种重金属（Cd、Cu、Pb、Zn）的生物有效性并不是同等有效的，可能是由于生物炭降低有效态重金属的浓度不同，以及生物炭表面重金属有限的吸附位点的竞争。Arabyarmohammadi等[62]进行了生物炭与多种重金属污染土壤的吸附实验，发现重金属Cu主要与—NH2、—OH、—COOH基团形成化学键，Pb主要与不溶性氢氧化物、磷酸盐或碳酸盐相结合，Zn主要附着在残留的较难溶的组分上。另外，重金属与有机官能团形成的化合物的结构差异已被证明是导致重金属生物有效性降低的机制[16]。Zhao等[63] 通过量子计算证实不同种类重金属与生物炭—OH和—COOH的结合能有差异，相比于Zn，Pb的结合能更低，因此这些官能团更倾向于结合Pb，进而有效降低重金属Pb的生物有效性。
重金属生物有效性与改良后的土壤性质有一定的相关性。Zhang等[64] 将500 ℃制备的水稻秸秆生物炭施加到砂壤土3个月后，发现土壤有机碳和pH与生物有效Cd（EDTA萃取）浓度具有相关性，说明施用生物炭后土壤有机碳和pH的增加，导致土壤中Cd生物有效性的降低。Meng等[25]发现添加400 ℃热解水稻秸秆、猪粪以及水稻秸秆猪粪混合生物炭后，CaCl2溶液萃取的Cd、Cu、Pb和Zn浓度与土壤pH、电导率和DOC含量都呈显著的负相关（P<0.01），Chao等[33]的研究发现添加椰子壳生物炭进行盆栽试验117 d后，土壤中CaCl2溶液萃取的Pb和Zn分别与pH、阳离子交换量、水溶性
SO2−4 、DOC均呈显著负相关（P<0.05）。Tang等[65] 的研究发现水稻秸秆生物炭添加后，土壤溶液DOC含量增加，并且通过梯度扩散薄膜技术（DGT）测定的Cd和As浓度（CDGT）与DOC浓度呈显著的相关性（P<0.05），表明DOC在土壤中重金属的有效性中起着关键作用。然而，添加生物炭引起的土壤孔隙水中DOM变化进而导致重金属生物有效性改变的机制还缺乏系统研究，尤其是缺少针对DOM结构变化与重金属生物有效性关系的研究。总之，一方面，重金属与生物炭的结合改变重金属的形态进而改变重金属的生物有效性；另一方面，生物炭添加下重金属形态转化可以使其生物有效性发生改变。另外，生物炭改变土壤性质进而影响重金属形态，导致其生物有效性发生变化。到目前为止，大多数生物炭固定重金属的实验室和田间实验基本都是在较短期内进行的。由于老化过程中，生物炭固定重金属的能力可能会随着时间的推移而降低[66]，因此研究生物炭对金属固定化的长期影响很有必要。重金属能够在土壤中固定，本身依靠的是土壤腐殖质-矿物质、微生物-矿物质的界面反应[67]。粘土矿物和微生物由于粒径小，表面电荷大，在重金属结合中起着重要作用。微生物细胞中含有大量的磷基、羧基、氨基、羟基等官能团，对重金属离子具有静电和化学亲和力[67]。而生物炭施入土壤中，一般增加有机质含量，对微生物群落结构有明显的影响，还会与矿物质以及重金属发生结合。因此在生物炭添加下，重金属与腐殖质-矿物质-微生物体系作用的机理发生着怎样的变化？生物炭在这样的体系下的老化过程对重金属的固定有何影响？Dang等[68] 将水稻秸秆生物炭施入土壤中进行为期90 d的盆栽实验，发现2—4周后生物炭表面会形成一层有机矿物层，即微团聚体，并运用能谱分析（SEM-EDX）对老化后的生物炭表面进行了表征，结果表明，这些微团聚体中含有重金属，表明有少量的重金属与生物炭有机分子结合。而基于生物炭老化过程，关于微团聚体的形成对重金属在土壤中固定的影响的研究还较为少见。而且不同生物炭在一定时间的老化对重金属形态和稳定性有不同的影响[69]，有待于进行系统的研究。
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除了用土壤中的重金属浓度评价其生物有效性，生物学评价法也能预测土壤重金属的生物有效性。研究者们通过实验室模拟实验进行了大量关于生物炭降低动植物中重金属生物有效性的研究[52, 70-72]。生物炭的原料和热解温度会影响动植物中重金属的生物有效性。例如，Ali等[73] 探讨杏壳生物炭和苹果树生物炭对甘蓝型植物中Zn和Cd有效性的影响，结果发现：两种生物炭，特别是苹果树生物炭，均降低了甘蓝型植物对Zn和Cd的生物利用度、吸收和转运。苹果树生物炭的效果好于杏壳生物炭可能是由于其较高的碱度、比表面积和碳含量。低温生物炭，有利于降低碱性土壤重金属的植物有效性[64].
生物炭添加后，生物体中的重金属含量降低，即降低了土壤重金属的生物有效性，例如，Huang等[74] 研究用350 ℃制备的棉杆生物炭进行28 d的实验室培养实验，结果发现：蚯蚓对Cd、Cu、Zn和Pb的生物富集系数比对照组要低，说明生物炭降低了土壤重金属的生物有效性。将400 ℃热解的厨余垃圾、玉米秸秆和花生壳生物炭分别添加到土壤中进行3个月的盆栽实验，发现空心菜中Cd和Pb的浓度显著降低（P<0.05），且与土壤中可提取态重金属的浓度呈正相关关系[50]。Yang等[35]将烟草和病死猪生物炭添加到土壤中进行80 d的盆栽实验，发现烟草植株中重金属含量降低，且与CaCl2溶液可提取重金属浓度（Cd和Zn）呈显著正相关（P<0.01）。
关于生物炭添加影响生物体生物有效性的变化有着不同的机制。首先，生物炭添加后重金属由植物可利用部分转化为植物无法吸收的有机结合态和残渣态。其次，植物生物量的增加对其体内的重金属产生的稀释效应也是植物中重金属含量降低的原因之一[37, 64]。另外，生物炭添加还可以使土壤孔隙水中的重金属含量降低，进而减少植物中的重金属含量[37, 60, 75-76]。例如，有研究发现孔隙水中的重金属（Cd和Pb）含量随着培养时间的增加而降低，这可能是孔隙水pH的升高以及孔隙水中二氧化硅和磷酸盐的浓度升高导致的[77]。Beesley等[78] 研究发现生物炭改良土壤60 d使土壤孔隙水中Cd和Zn的含量降低，进而降低了黑麦草中重金属的毒性效应，然而生物炭使土壤孔隙水中As和Cu的浓度升高。而Karami等[79]添加橡树生物炭改良Cu和Pb污染的土壤并种植4个月的黑麦草，发现生物炭使土壤孔隙水中的Cu浓度降低。可见，不同的重金属污染的土壤以及同种重金属污染不同的土壤，在生物炭添加后，土壤孔隙水中重金属含量的变化存在差异性，针对这种差异还需要进一步的研究。也有研究表明植物中重金属生物有效性的降低并不归因于土壤孔隙水中重金属浓度的降低。例如，Beesley等[80] 用果园修剪残留物为原料500 ℃制备的生物炭施入As污染的土壤进行盆栽实验，发现生物炭显著提高孔隙水中As的浓度，同时显著降低番茄植物根、地上部As浓度。孔隙水中As浓度的增加是因为生物炭中的宏观、微观和纳米孔结构可能为土壤中的Fe和Mn的还原提供了条件，在这种还原条件下，As将不容易被土壤吸附，从而更具流动性。除了以上常见的机制，微生物的变化也是生物炭改变重金属生物有效性的机制。添加生物炭后，水稻土中Cd的生物有效性降低，研究者对水稻根际的微生物进行了检测，发现生物炭增加了促进植物生长的鞘脂单胞菌、根瘤菌以及促进重金属转化的β-变形菌，这些变化为Cd的生物有效性降低提供了可能的解释[81]。Meier等[60] 把Cu生物有效性降低的原因归为生物炭增加了土壤中的微生物活性和脱氢酶活性，将过量的Cu阻隔在丛枝菌根真菌的耐金属结构中促进植物生长，从而使Cu的生物有效性降低。生物炭可以改善土壤微生物群落，例如，谭凤娇[82] 研究发现生物炭增加了土壤外生菌根真菌物种数，使外生菌根真菌多样性显著增加。Tang等[83] 得出外生菌根真菌促进了植物对Cd和Cu的吸收。关于生物炭改良诱导的微生物促进/抑制机制尚不完全清楚，并且植物重金属生物有效性变化的微生物水平机制还有待于研究。由于微生物重要的作用，生物炭与微生物对重金属生物有效性的共同影响是近年来的研究热点。Tu等[84] 发现玉米生物炭和耐重金属菌株假单胞菌（Pseudomonas sp.）同时加入到土壤中后，可以显著降低Cd和Cu的DTPA萃取浓度。有研究发现木质素类生物炭与丛枝菌根共同处理会显著降低水稻籽粒Pb的浓度，该项研究还证明了生物炭与丛枝菌根共同处理会提高粮食生产的安全性[85]。但是，Qiao等[86]的研究结果表明丛枝菌根与生物炭之间没有相互作用，并且生物炭与接种丛枝菌根共同作用降低重金属生物有效性的益处仍不明确。可见，仍需要加深对菌剂与生物炭共同改变土壤重金属生物有效性的研究，并重点探讨其机制。
生物炭对不同重金属的生物有效性影响不同，这与重金属本身的性质有关。具体来说，发现生物炭对水稻植株籽粒中Cd的降低程度大于Pb。有两个原因，一方面，Pb形成金属羟基化合物的能力大于Cd，生物炭上形成的Pb析出量远高于Cd；另一方面，Pb在植物中的迁移性本身比较低[34]。Li等[87] 阐明了Pb在植物中低迁移性的机制，该研究者进行了稻草生物炭对土壤-水稻系统中Pb的吸附效应实验，利用X-射线吸收近边结构光谱（XANES）测定了水稻根中的Pb的种类，发现了Pb-果胶和Pb-半胱氨酸，其中Pb-果胶与根内Pb的络合作用减少了其从根向茎的迁移，Pb-半胱氨酸的形成抑制其从根向地上部的迁移，因此认为这些有机复合物可能是导致土壤中添加生物炭后水稻对Pb积累减少的原因。
生物炭除了降低土壤重金属生物有效性，还会产生一些负面影响。例如，Meier等[60] 将500 ℃制备的鸡粪生物炭与土壤混合后，发现月见草根系中会加剧Cu的积累。其机制为重金属与植物细胞壁中的生物聚合物结合，一旦穿过细胞壁，会在细胞膜上的表面固定化。有研究表明生物炭即使对Cd的吸附达到最大，也未降低生菜中Cd的含量，可能是因为生菜对Cd的吸收较强[64]。因此，在应用生物炭固定重金属时，应当了解生物炭的物化性质和前期实验，以减少应用生物炭会增加蔬菜吸收重金属的风险。Huang等[74] 发现生物炭使重金属污染土壤中蚯蚓的生物量下降。当向Cd污染的黄土中施加鸡粪和油菜秆生物炭三周后发现，玉米植株的高度低于对照组，认为生物炭添加增加了土壤pH，使其达到植物的耐受限度（pH=8.5），以及低添加量（1%和5%）的生物炭对抑制植物吸收Cd没有明显的效果[39]。Chao等[33]认为胡桃壳生物炭会降低Pb、Zn污染的酸性水稻土中水稻植株籽粒的生物量，因为生物炭会与土壤中植物的营养元素发生结合，并且生物炭含有的挥发性有机化合物可能对植物生长产生负面影响。一般，重金属胁迫诱导植物细胞内积累过多的活性氧（ROS），如超氧阴离子自由基（
O−2⋅ ）、羟基自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）[88]，从而增加植物的衰老[89]，由于这些ROS与生物分子发生反应，导致细胞膜损伤和酶失活，从而影响细胞活力[90]。生物炭本身具有持久性自由基，会产生ROS[91-92]，生物炭添加在重金属污染的土壤-植物系统中后，由重金属、ROS参与的电子转移、芬顿反应等过程与生物炭产生的自由基的作用引发的植物代谢的变化还有待于研究。 -
近年来，生物炭修复重金属污染土壤研究的涌现，使人们对生物炭及其在重金属污染土壤中的应用有着更为深入的认识。比如：生物炭自身的性质（多孔结构、丰富的有机官能团和矿物质元素等）、生物炭影响重金属的存在形态和生物有效性。尽管取得了很多的研究成果，但是还有一些不足之处以及需解决的问题，因此提出以下的研究问题与展望。
（1）对于不同类型生物炭与重金属污染土壤的修复效果的构效关系认识不足。需要加强不同类型（原料、热解温度）的生物炭对土壤中重金属的归趋和生物有效性影响的系统性研究。并将研究重点放在不同生物炭产生不同效果的机制上。
（2）缺乏生物炭施入田间长期效应的研究。多数研究仅停留在实验室模拟研究，但是实际的田间会有更多不可控的因素，因此，进行田间实验很有必要。由于生物炭在土壤中培养时间的不同会导致其老化程度不同以及重金属的形态发生一系列的动态变化，因此需要进行长期的监测，并深入研究生物炭和重金属相互作用的老化过程。
（3）确定土壤性质变化以及生物炭表面的生物、非生物和结构变化对重金属固定影响的差异是当前研究的主要任务[16]。仍需加强生物炭添加后如何影响土壤孔隙水中不同种类重金属浓度变化的研究，探究其变化与DOM结构变化的关系。
（4）从微生物水平上进一步研究生物炭改变土壤重金属生物有效性的机制。例如，生物炭添加下土壤重金属生物有效性评价指标与微生物和酶等指标（例如微生物群落结构、脱氢酶活性等）的相关性，以及加强研究生物炭诱导下重金属对菌群的耐受性以及生物炭与菌群共同作用对动植物重金属有效性降低的机制。
（5）深入研究在重金属、ROS参与的微观反应等过程中，生物炭引发的植物代谢的变化。针对生物炭的负面影响，应尽可能全面辩证地考虑生物炭的缺点，防止重金属通过食物链富集到人体，并加快探究其可能的规避措施。
总之，关于生物炭在土壤重金属修复领域的研究还有很大的发展空间，有望带来新的进展。
生物炭对土壤重金属形态及生物有效性影响的研究进展
Effect of biochar on soil heavy metal speciation and bioavailability: A review
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摘要:
考察生物炭施入土壤后重金属形态以及生物有效性的变化是土壤学近年来的研究热点。重金属形态变化是衡量其生物有效性的一个较为重要的指标。将生物炭添加到土壤-动植物系统中，并评估重金属生物有效性有利于推进生物炭应用于土壤改良及重金属修复。因此，本文首先收集了大量关于生物炭对土壤重金属形态含量变化的数据。统计发现，生物炭添加下土壤中重金属Cd、Cu、Zn和Pb的不稳定态（可交换态/酸溶态）下降的平均百分率分别为25.6%、36.4%、16.5%和26.1%，稳定态（残渣态）升高的平均百分率分别为35.9%、22.9%、32.8%和46.5%。生物炭的原料、热解温度和土壤质地是影响重金属形态变化的主要因素。探讨了生物炭的添加对土壤重金属形态转化的影响机制。其次，总结了生物炭对土壤和生物体中的重金属生物有效性的影响，以及阐述了相应的影响机制。最后，基于目前的研究现状提出了未来的研究方向。
Abstract:Investigation on the variations of soil heavy metal speciation and bioavailability with the application of biochar is becoming a hot research topic in the field of soil science in recent years. Heavy metal speciation is an important indicator of bioavailability. Evaluation of heavy metal bioavailability with the addition of biochar in soil-animal/plant system is beneficial to promote the application of biochar in soil improvement and soil heavy metal remediation. Therefore, data on the changes of the content of heavy metal speciation induced by biochar were collected. It was found that the mean decrease percentages of labile fraction (exchangeable fraction/acid-soluble fraction) of Cd, Cu, Zn, Pb were 25.6%, 36.4%, 16.5%, and 26.1%, respectively. The mean increase percentages of recalcitrant fraction (residue fraction) were 35.9%, 22.9%, 32.8% and 46.5%, respectively. The effect of biochar on soil heavy metal speciation mainly depended on the feedstock and heating treatment temperature of biochar as well as soil texture. The mechanisms of biochar-induced changes in soil heavy metal speciation were discussed. Then, the influences of biochar on heavy metal bioavailability in soil and animal/plant were summarized and the corresponding mechanisms were stated. Finally, potential research directions in the future were proposed based on current research status.
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Key words:
- biochar /
- soil heavy metals /
- speciation /
- bioavailability
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石化行业作为推动国家能源发展的支柱产业，为国计民生提供了资源和能源保障。产业链由石油开采、油气炼制、石油化工等组成，工艺流程复杂，产生的废水组成复杂、有机物浓度高、毒性大且可生化性低。单一处理工艺难以达标排放，多用物化法进行预处理，厌氧/好氧等生物工艺进行二级处理。生物法作为石化废水二级处理中的核心单元，用于处理隔油气浮环节出水中的有机物、氮和磷等污染物。目前石化厂多采用组合工艺，典型代表为A2O工艺。A2O工艺通过厌氧段、缺氧段和好氧段逐步实现污染物的降解[1]。但生物法也有局限性，如微生物本身易受到有毒化学物质和高盐度的影响，降低处理效率[2]。因此如何减弱石化废水带给微生物的冲击，提高微生物的处理效果，成为了近年来的研究热点。
厌氧膜生物反应器(anaerobic membrane bioreactor, AnMBR)凭借其在生物处理、资源回收等方面的优势而广泛应用于工业废水处理中[3]。AnMBR将膜过滤和厌氧发酵有效结合，实现了HRT与SRT的完全分离[4]，与普通厌氧消化相比，膜能过滤部分难降解污染物，处理难降解石化废水时仍有较好的COD去除效果。而胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)和溶解性微生物产物(soluble microbial products, SMP)会聚集在膜上形成膜污染，降低膜重复利用性并提高清洗成本，制约其工程化应用。目前研究多集中在膜污染的抑制上。与板式膜相比，中空纤维膜自身比表面积更大，沼气冲刷还能促进高分子化合物脱落，有效缓解膜污染[5]。电化学强化厌氧膜生物反应器(anaerobic electro-assisted membrane bioreactor, AnEMBR)在近些年受到了关注，此工艺利用阴极膜组件与负电性的EPS和SMP之间的静电排斥作用减缓膜污染的发生[6]，电化学体系还有利于增强微生物代谢，提高生物处理效果[7]，为处理难降解的石化废水提供了可能性。YANG等[8]利用碳纳米管(carbon nanotubes, CNTs)制备CNTs-HFMs膜并将其用于AnEMBR处理模拟废水，结果表明，加电组COD去除率大于95%，对照组的COD去除率均小于95%，加电组的最高甲烷产量高于对照组111.12 mL·(g·d)−1，加电组产甲烷菌含量较对照组提高近2倍；膜污染方面，加电组膜组件在进行3次水力清洗循环后，跨膜压差(trans-membrane pressure, TMP)仍能恢复到35 kPa，对照组只能恢复到50 kPa和60 kPa，说明加电组有效缓解不可逆膜污染。杜磊等[9]使用真空抽滤交联技术将CNTs负载于聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜表面制备的CNT-PVDF膜，具有良好的抗污染性能。这说明CNTs具有良好的应用前景，可为导电膜的规模化生产和应用提供技术支持。此外，石化废水中常含有NH4+，仅依靠厌氧工艺难以使NH4+达标。因此，在厌氧工艺后需选择合适的好氧工艺，进行NH4+的降解。基于悬浮生物载体的生物膜与活性污泥复合工艺(integrated free-floating biofilm and activated sludge, IFFAS)因兼具了生物膜法和活性污泥法的优点而备受关注。借助悬浮载体与活性污泥的流态化接触在填料表面形成一定厚度的生物膜。生物膜外部的好氧区能进行硝化以及有机物的去除，内部由于氧扩散的限制形成缺氧区以及厌氧区，发生反硝化，从而使IFFAS具备实现同步硝化反硝化(simultaneous nitrification and denitrification, SND)的可能性[10]。LIU等[11]通过双单元的IFFAS工艺实现了59.9%~65.9%的TN去除率，与对照组相比提高了12.3%~13.5%。LIU等[12]制备了新型载体处理模拟废水，在精准的溶解氧(dissolved oxygen, DO)控制下去除了80.2%的TN。以上结果为AnEMBR-IFFAS耦合工艺处理石化废水提供了理论和技术支持。雷士雅等[13]构建了电化学辅助厌氧消化反应器 (bioelectrochemical-assisted anaerobic digestion reactor, BEAD) 处理石化废水强化COD的去除，BEAD的COD去除率为85%，出水COD稳定在(360±24) mg·L−1,而普通厌氧消化对COD的去除率小于60%。与BEAD相比，AnEMBR除了能够将石化废水中复杂的有机物转化为小分子的挥发性脂肪酸等物质，便于后续IFFAS中的微生物进行利用外，还可以通过膜组件截留部分COD提高COD去除效率并保持反应器内较高的污泥浓度。此外，AnEMBR还能通过收集甲烷气体实现能源回收，IFFAS构建同步硝化反硝化实现NH4+-N和TN的同时去除。
本研究构建实验室规模AnEMBR-IFFAS耦合工艺，考察此工艺在不同进水有机强度、HRT等条件下对石化废水中耗氧有机污染物(以COD计)、NH4+-N等污染物的处理效果，优化工艺参数，并探究生物群落组成，以期为工艺工程化应用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验装置
工艺流程如图1所示，电化学强化厌氧膜生物反应器(AnEMBR)与基于悬浮生物载体的生物膜-活性污泥复合工艺(IFFAS)顺次相接。AnEMBR(有效体积2 L)内置膜组件(膜面积约为0.05 m2)，施加电压−1.2 V，以钛网为对电极(150 mm×200 mm)，外部连接直流稳压电源。AnEMBR出水流入IFFAS(有效体积2 L)，IFFAS出水流入二沉池，剩余污泥回流至IFFAS。IFFAS内装有填充比约为30%的新型生物亲和型载体。AnEMBR中初始污泥质量浓度(MLVSS)为5 500 mg·L−1，IFFAS中初始污泥质量浓度(MLVSS)为1 500 mg·L−1。膜组件为CNT-PVDF复合中空纤维膜，参照杜磊等[9]的方法进行制备。亲和型改性载体通过物理共混和螺杆挤出技术制备[12]。
图 1 AnEMBR-IFFAS耦合工艺实验装置Figure 1. Experimental setup of AnEMBR-IFFAS combined processes1.2 运行条件
正式运行条件如表1所示。提前进行挂膜启动工作，进水为模拟废水，并用NaHCO3调节进水pH为7~8。挂膜成功后正式开始实验。鉴于实际废水的耗氧有机污染物浓度(以COD计)较高，正式实验的实际进水采用不同稀释比例(用自来水稀释)的混合废水，并额外投加NH4Cl，使废水在不同的COD下，NH4+-N质量浓度均维持在50 mg·L−1左右，以考察C/N对脱氮效果的影响。处理目标为《石油化学工业污染物排放标准》(GB 31571-2015)，其中COD<60 mg·L−1、NH4+-N<8 mg·L−1、TN<40 mg·L−1。
表 1 反应器运行条件Table 1. Operation conditions of reactor阶段 AnEMBR HRT/h IFFAS HRT/h COD/(g·L−1) NH4+-N/(mg·L−1) TN/(mg·L−1) Ⅰ 24 24 1.10 45.90 46.66 Ⅱ 24 24 1.82 51.00 52.65 Ⅲ 18 18 1.55 48.05 49.38 Ⅳ 18 18 2.87 51.45 53.50 Ⅴ 24 24 2.69 53.54 55.46 | Show Table
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1.3 实验用水和接种污泥
挂膜启动采用的模拟废水的主要物质为：0.94 g·L−1 C6H12O6、0.096 g·L−1 NH4Cl、0.022 g·L−1 KH2PO4、0.05 g·L−1 NaCl、0.075 g·L−1 NaHCO3、0.075 g·L−1 MgSO4·7H2O、0.025 g·L−1 CaCl2、0.01 g·L−1 FeSO4·7H2O以及2 mL·L−1的微量元素溶液。实际石化废水的水质分析为：4 654 mg·L−1 TOC、4 124 mg·L−1 BOD5、14 040 mg·L−1 COD、16.5 mg·L−1 NH4+-N、28.8 mg·L−1 TN、39.3 mg·L−1 TP。由于实验所用混合废水仅添加NH4Cl作为外加氮源并且实际废水中并未检测到有机氮，参考相关文献[14]，TN的质量浓度视为NH4+-N、NO2−-N和NO3−-N三者质量浓度的总和。AnEMBR内污泥取自大连市夏家河污水处理厂二沉池，IFFAS内污泥取自大连市凌水污水处理厂二沉池。
1.4 分析方法
COD、NH4+-N、NO2−-N等水质指标测定采用标准方法[15]；NO3−-N采用水杨酸-浓硫酸法[16]测定；TMP用压力表读数记录；CH4和CO2采用气相色谱法测定；pH采用梅特勒pH计测定；DO采用奥豪斯ST400D型便携式溶解氧仪测定；EPS采用甲醇-氢氧化钠法[13]提取，利用控温式荧光光谱仪(Cary Eclipse, Agilent, 马来西亚)进行3D-EEM分析；蛋白质采用考马斯亮蓝显色法[17]测定；多糖采用苯酚-硫酸法[18]测定。
1.5 微生物群落分析
通过16S rRNA高通量测序法分析耦合工艺的微生物群落组成。运行结束后在AnEMBR悬浮污泥、AnEMBR膜组件附着污泥、IFFAS悬浮污泥和IFFAS载体生物膜上各取10 mL污泥样品，首先利用试剂盒对样品进行DNA提取，再使用细菌引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)对细菌16s的V3~V4区域进行扩增。另取AnEMBR悬浮污泥和AnEMBR膜组件附着污泥的10 ml污泥样品，利用试剂盒对样品进行DNA提取，再使用古菌引物对古菌16s的V3~V4区域进行2轮扩增(第1轮: 340F(CCCTAYGGGGYGCASCAG)和1000R(GGCCATGCACYWCYTCTC), 第2轮: 349F(GYGCASCAGKCGMGAAW)和806R(GGACTACVSGGGTATCTAAT))，最后在 Miseq测序平台上进行高通量测序。
2. 结果与讨论
2.1 COD去除效果分析
耦合工艺对耗氧有机污染物(以COD计)的去除分为3步：AnEMBR厌氧生物降解、膜分离作用和IFFAS好氧生物降解。图2为运行期间的COD去除情况，表2为COD去除率计算分析结果。阶段Ⅰ和阶段Ⅱ仅靠AnEMBR中的微生物就能去除89.3%的COD，膜分离的COD去除率为2.2%，IFFAS的COD去除率为5.5%。在缩短HRT后(阶段Ⅲ)，厌氧生物降解(84.1%)和膜分离(0.2%)的去除率略有下降，IFFAS的COD去除率(14.6%)提高。进水COD升到2 800 mg·L−1(阶段Ⅳ)后，各环节的COD去除率为76.2%、8.4%和13.3%。虽然COD去除率得到提高，但出水COD也略有增加。当HRT回升至24 h(阶段Ⅴ)后，各环节的COD去除率为72.0%、15.2%和10.9%，出水COD稳定达标。当进水COD较低时，COD的去除集中在AnEMBR阶段；当进水COD较高时，AnEMBR的生物去除效果有限，阴极膜的阻隔效果以及IFFAS对COD的去除效果提高，使系统在面临不同浓度的废水时均能实现良好的COD去除效果。整个运行周期的COD去除率不断提高,维持在95%以上，其中阶段Ⅴ的COD平均去除率(97.9%)最高。阶段I~Ⅴ的出水COD平均值为50.24、41.50、54.71、62.33和52.11 mg·L−1，说明AnEMBR- IFFAS系统对石化废水具有较强的有机污染物去除能力。除阶段Ⅳ外，其他阶段均达到了《石油化工行业污染物排放标准》(GB 31571-2015)(COD<60 mg·L−1)。在本实验构建的含有微生物存在的电化学系统中，电活性微生物会在阳极氧化部分有机污染物，而阴极膜组件表面附着的部分产甲烷菌可以利用外电路传来的电子和CO2产甲烷。此外，阴极表面的微生物对污染物降解也有一定促进作用。另一方面，污泥回流保证了IFFAS内部较高的污泥浓度，能增强污泥-生物膜之间的交互作用，达到良好的有机污染物降解效果[19]。
表 2 COD去除率计算结果Table 2. Calculation results of COD removal rate阶段 AnEMBR平均COD去除负荷/(kg·(m3·d)−1) IFFAS平均COD去除负荷/(kg·(m3·d)−1) AnEMBR生物降解去除率/% AnEMBR膜分离去除率/% IFFAS生物降解去除率/% Ⅰ 1.01 0.05 90.37 1.65 3.97 Ⅱ 1.66 0.12 88.31 2.64 6.78 Ⅲ 1.68 0.31 84.09 0.25 14.57 Ⅳ 3.23 0.51 76.17 8.41 13.25 Ⅴ 2.34 0.29 72.00 15.19 10.89 | Show TableDownLoad:
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2.2 NH4+-N和TN的去除效果分析
图3和图4分别反映了NH4+-N和TN的去除效果。依靠IFFAS载体上形成的好氧-缺氧体系和悬浮污泥中的局部好氧区和局部厌氧区实现同步硝化反硝化来降解NH4+-N和TN。而AnEMBR内部厌氧，硝化效果较差，其对NH4+-N和TN的去除贡献率较低。阶段I~Ⅴ中AnEMBR的 NH4+-N去除率为13.8%、12.2%、12.5%、16.3%和30.1%；阶段I~Ⅴ中AnEMBR的TN去除率为15.0 %、14.4%、13.5%、19.0%和32.3%。阶段Ⅰ的出水NH4+-N平均质量浓度为5.93 mg·L−1，TN平均质量浓度为39.13 mg·L−1。分析原因，一方面IFFAS内部DO质量浓度约为2.0 mg·L−1，生物膜内部反硝化效果较差；另一方面IFFAS的低C/N(2.4:1)无法使得反硝化充分进行。阶段Ⅱ提高IFFAS的 C/N(3.7:1)并将DO下调至1 mg·L−1左右，NH4+-N和TN去除率均有所提高，出水平均质量浓度分别为4.58 mg·L−1和29.50 mg·L−1。阶段Ⅲ的C/N(6.7:1)再次提高，各环节HRT缩短至18 h，出水NH4+-N和TN平均质量浓度分别为6.78 mg·L−1和22.60 mg·L−1。阶段Ⅳ提高C/N至10.3:1，出水NH4+-N和TN平均质量浓度分别为8.56 mg·L−1和16.89 mg·L−1。出水NH4+-N超标(8 mg·L−1)，由此判断C/N不宜过高。分析原因，高C/N促进反硝化作用，但过高会使好氧异养菌大量增殖与硝化细菌竞争O2，抑制硝化作用。阶段Ⅴ提高HRT并降低C/N至9.7:1，此时NH4+-N和TN平均去除率可达到93.1%和72.2%，出水平均质量浓度分别为3.70 mg·L−1和15.19 mg·L−1。由图4可见，TN的去除与IFFAS的DO的变化趋势相似，当DO提高时(1.0~1.5 mg·L−1)TN去除效果降低，若DO大于2.0 mg·L−1，则无明显的去除效果。当DO在0.7~1.0 mg·L−1时，出水TN浓度较低且稳定达标，这说明若想实现TN的稳定去除，可使DO维持在较低水平(0.7~1.0 mg·L−1)。总体上看，适宜条件下(AnEMBR HRT=24 h，IFFAS HRT=24 h ，IFFAS C/N=9.7:1)工艺出水NH4+-N和TN能稳定达到《石油化学工业污染物排放标准》(GB 31571-2015)，即NH4+-N<8 mg·L−1，TN<40 mg·L−1。
2.3 产甲烷性能分析
图5为CH4和CO2的每日产量。气体产量随进水COD的升高而升高。起初，产甲烷菌处于适应阶段，产气量较低，仅有20.61 mL·(g·d)−1。随着时间推移，进水COD提高，产甲烷量升高，日产量最高可达127.72 mL·(g·d)−1。运行周期内AnEMBR中的CH4气体平均占比为90.7%。KATURI等[20]发现AnEMBR系统中所发生的产甲烷过程多为氢型产甲烷过程，能有效富集氢型产甲烷菌，促进甲烷生成，这与后续的古菌群落分析结果一致。CHENG等[21]研究表明在电化学系统或微生物电解池(microbial electrolysis cell, MEC)中使用含有产甲烷菌的生物阴极可以通过电产甲烷过程直接生产甲烷(式(1))，比传统的厌氧消化产甲烷效果更好。
CO2+8H++8e−→CH4+2H2O (1) 2.4 TMP积累情况
TMP可用来评估膜污染进程，AnEMBR中的TMP检测结果如图6所示。可以发现，随着COD的增加和HRT的缩短，TMP的增长速率加快，但每次水力清洗后的初始TMP差别不明显，表明膜组件没有出现严重的不可逆膜污染现象。每一阶段的TMP平均增长速率分别为：0.63、0.79、1.5、2.2和0.85 kPa·d−1。可以发现当HRT为24 h时(阶段Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ)，进水COD的提高，会加快TMP增长。当进水COD变化不大，提高HRT时(阶段Ⅳ和Ⅴ)，TMP增长速率会明显下降。WANG等[22]构建了电化学膜生物反应器(electrochemicalmembrane bioreactor, EMBR)系统，并通过TMP变化和激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)分析证明了施加外部电压能减少污泥沉积并减缓膜污染的发生。图7为膜污染缓解机理示意图。可见，施加负电压可使膜组件呈负电性，静电排斥作用会阻止带负电荷的EPS等靠近膜组件，抑制不可逆膜污染发生。此外膜表面发生的产甲烷反应，有利于冲刷污染层，对减缓膜污染具有部分贡献。
图 7 静电排斥作用缓解膜污染原理Figure 7. Principle of electrostatic repulsion to alleviate membrane pollution2.5 AnEMBR胞外聚合物分析
1) EPS浓度。胞外聚合物(EPS)的主要成分蛋白质(PN)和多糖(PS)，能影响污泥絮体的絮凝性和表面带电性等[23]，是膜污染的主要因素。测定了各阶段膜组件表面污泥以及上清液环境中的EPS含量，如图8所示。可以发现，EPS随着HRT的减少而升高，随着进水COD浓度的升高而升高。当进水浓度提升或HRT缩短时，多糖的增长速度更快，使PN/PS呈下降趋势，能够降低微生物絮凝物的疏水性与表面密度，从而使其不易粘附在膜表面，抑制膜污染[24]。但由图8可见，每个阶段的膜污染程度随时间的延长逐渐提高。这说明进水COD的提高以及HRT的缩短对膜污染的影响更大。上清液的EPS浓度始终维持在较低的水平，说明电负性环境减弱了EPS在上清液的聚集，抑制EPS向膜组件靠近。
2)对EPS的定性3D-EEM分析。运行结束后对AnEMBR膜表面污泥和底部污泥的EPS样品进行3D-EEM分析，结果如图9所示。将三维光谱图划分为5个区域，每个区域相应的荧光代表物质为：Ⅰ区为类酪氨酸(λex/λem为(200~250) nm/(200~330) nm)、Ⅱ区为类色氨酸(λex/λem为(200~250) nm/(330~380) nm)、Ⅲ区为类富里酸( λex/λem为(200~250) nm/(380~500) nm)、Ⅳ区为类溶解性代谢产物(λex/λem为(250~400) nm/(200~380) nm)和Ⅴ区类腐殖酸(λex/λem为(250~400) nm/(380~500) nm)[25]。可以发现，在电化学作用下，不同区域的EPS在种类和含量上存在一定的差异。EPS的荧光峰主要集中在Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ区域。荧光强度越高，代表该物质含量越高。从荧光峰强度来看，膜表面污泥样品的整体荧光峰强度更高，代表其EPS含量更高。其中荧光峰强度最高的是Ⅳ区域，其次是Ⅱ区域，这些区域包含色氨酸类蛋白质及其他类蛋白物质，是造成膜污染的主要因素之一。蛋白质是两性电解质，含有氨基和羧基等基团，本身电性与体系pH和自身等电点相关。以上结果表明，与底泥相比，施加阴极电压未有效抑制该类污染物的分泌。与Ⅱ、Ⅳ区域相比，膜表面污泥较底部污泥在Ⅴ区域的荧光强度增幅最小，该区域主要物质是腐殖酸，其主要基团是羧基和羰基，易被带负电荷的膜组件排斥，不易富集在负电环境中[8]。以上结果说明，电化学系统的介入，一方面可以改变EPS的组成且减弱其粘附性能，另一方面有利于减缓类腐殖酸物质污染物造成的膜污染效应。
图 9 底部污泥和CNT-PVDF表面的EPS的EEM荧光光谱图像Figure 9. EEM fluorescence spectroscopy images of EPS from bottom sludge and CNT-PVDF surface2.6 微生物群落分析
在实验结束后，对AnEMBR底部污泥(A)、AnEMBR膜组件表面污泥(B)、IFFAS悬浮污泥(C)和IFFAS载体生物膜(D)的微生物样品进行16S rRNA高通量测序，分析微生物组成。
1) AnEMBR古菌群落分析。如图10所示，主要古菌属有6个，分别为Methanobacterium、Methanothrix、Methanosarcina、Methanospirillum、Methanomethylovorans、Methanomassiliicoccus。膜上富集了大量的Methanobacterium (50.43%)和Methanothrix (36.92%)。其中Methanobacterium (甲烷杆菌)是可以利用多种底物(甲醇、H2和CO2等)的氢型产甲烷菌[26-27]，在底泥和膜泥中占比最高，是电化学系统中的优势菌群。Methanothrix (甲烷丝菌)为乙酸型产甲烷菌，能够将乙酸转化为甲烷[28]，AnEMBR中的VFA的主要成分是乙酸，为其提供了碳源。Methanosarcina(甲烷八叠球菌)是利用乙酸、H2和CO2或甲基化合物产甲烷的多营养型产甲烷菌[29]，在底泥(21.07%)和膜泥(7.83%)中也有一定富集。Methanospirillum(甲烷螺菌)可利用H2和CO2等产甲烷[30]，在底泥(17.71%)中有较高占比，而膜泥(1.80%)中含量较低。体系还存在少量的Methanomethylovorans(底泥0.52%, 膜泥1.34%)和Methanomassiliicoccus(底泥1.45%, 膜泥0.06%)2种甲基营养型产甲烷菌[31-32]。
图 10 AnEMBR古菌在属水平的相对丰度Figure 10. Relative abundance of archaeal community (AnEMBR) at genus level2)AnEMBR细菌群落分析。如图11(a)所示，底泥富集了Enterococcus(16.13%)、LD21(10.62%)、UBA6170(6.43%)、Syntrophobacter(5.37%)等菌属。膜泥富集了Lentimicrobium(27.72%)、Petrimonas(5.15%)等菌属。其中Lentimicrobium是一类能够进行胞外电子传递的发酵细菌，与产甲烷过程密切相关[33]，在膜上相对丰度最高。Aminipila是一类严格的厌氧细菌通过发酵产生乙酸盐和丁酸盐[34]，在底泥和膜泥的丰度相近。Petrimonas是一类利用NO2−等作为电子受体的厌氧发酵细菌，常见于微生物燃料电池[35-36]。Longilinea 、Tsukamurella 等菌属对有机物的降解也有一定贡献。此外，AnEMBR中的许多菌属与产甲烷过程密切相关。Clostridium(底泥0.54%, 膜泥0.14%)、Pseudomonas(底泥0.44%, 膜泥0.33%)、Syntrophomonas(底泥0.17%, 膜泥0.15%)、Syntrophobacter(底泥5.37%, 膜泥0.64%)、Smithella(底泥0.79%, 膜泥0.70%)和Thauera(底泥0.086%, 膜泥 0.85%)是AnEMBR中主要的产甲烷共生菌，能与部分产甲烷古菌进行互营代谢合作，促进产甲烷作用[37-38]。
图 11 AnEMBR和IFFAS细菌在属水平的相对丰度Figure 11. Relative abundance of bacterial community (AnEMBR and IFFAS) at genus level3) IFFAS细菌群落分析。IFFAS的群落分布如图11(b)所示。Paracoccus菌属常见的好氧或兼性厌氧菌属，该菌属下部分细菌能够以NO3−、NO2−作为电子受体进行厌氧生长[39]，在生物膜(19.98%)与悬浮污泥(39.02%)中的含量最高。Nitrospira菌属为自养硝化菌属，能够将亚硝氮转化为硝氮[12]，其在生物膜(9.59%)上的含量明显高于在悬浮污泥(2.10%)中的含量，说明悬浮载体成功富集了硝化细菌。Rhodobium菌属在悬浮污泥和生物膜上的含量分别为0.14%和1.92%，是反硝化菌目Rhizobiales的成员[12]。Ignavibacterium菌属是亚硝酸盐还原细菌[40]，在生物膜(含量0.71%)和悬浮污泥(含量1.04%)上均有富集。
3. 结论
1)工艺稳定运行时(AnEMBR HRT=24 h，IFFAS HRT=24 h，IFFAS C/N=9.7:1)能够实现平均97.9% COD、93.1% NH4+-N和72.2% TN的同时去除。2)AnEMBR的不可逆膜污染程度较轻，同时可回收CH4，日产量最高为127.72 mL·(g·d)−1。3) AnEMBR中富集了以氢型产甲烷菌Methanobacterium为主的产甲烷古菌。IFFAS中富集了Nitrospira、Rhodobium、Ignavibacterium等脱氮功能菌。
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图 1 生物炭诱导的土壤中重金属不稳定态（a）和稳定态（b）含量的变化（红线代表平均值）
Figure 1. Changes of the contents of labile (a) and recalcitrant fraction (b) of heavy metals induced by biochar (red line represents the mean value)
图 2 生物炭诱导的土壤中重金属不稳定态（a）和稳定态（b）含量的变化（红线代表平均值）
Figure 2. Changes of the contents of labile (a) and recalcitrant fraction (b) of heavy metals induced by biochar (red line represents the mean value)
图 3 生物炭诱导的土壤重金属Cd不稳定态（a）和稳定态（b）含量随生物炭原料、热解温度、添加量、实验时间、土壤质地、土壤pH和土壤有机碳含量的变化（红线代表平均值）
Figure 3. Changes of the contents of labile (a) and recalcitrant fraction (b) of Cd induced by biochar with feedstock, pyrolysis temperature, addition rate, experiment time, soil texture, soil pH and soil organic carbon content (red line represents the mean value)
图 4 生物炭诱导的土壤重金属Cu不稳定态（a）和稳定态（b）含量随生物炭原料、热解温度、添加量、实验时间、土壤质地、土壤pH和土壤有机碳含量的变化（红线代表平均值）
Figure 4. Changes of the contents of labile (a) and recalcitrant fraction (b) of Cu induced by biochar with feedstock, pyrolysis temperature, addition rate, experiment time, soil texture, soil pH and soil organic carbon content (red line represents the mean value)
图 6 生物炭诱导的土壤重金属Pb不稳定态（a）和稳定态（b）含量随生物炭原料、热解温度、添加量、实验时间、土壤质地、土壤pH和土壤有机碳含量的变化（红线代表平均值）
Figure 6. Changes of the contents of labile (a) and recalcitrant fraction (b) of Pb induced by biochar with feedstock, pyrolysis temperature, addition rate, experiment time, soil texture, soil pH and soil organic carbon content (red line represents the mean value)
图 5 生物炭诱导的土壤重金属Zn不稳定态（a）和稳定态（b）含量随生物炭原料、热解温度、添加量、实验时间、土壤质地、土壤pH和土壤有机碳含量的变化（红线代表平均值）
Figure 5. Changes of the contents of labile (a) and recalcitrant fraction (b) of Zn induced by biochar with feedstock, pyrolysis temperature, addition rate, experiment time, soil texture, soil pH and soil organic carbon content (red line represents the mean value)
图 7 不同种类生物炭以及土壤性质影响土壤重金属形态变化的示意图
Figure 7. Schematic diagram of soil heavy metal speciation changes affected by different types of biochar and soil properties
表 1 不同类型生物炭对重金属生物有效性影响的研究
Table 1. Studies on the effect of different types of biochar on heavy metal bioavailability
原料Feedstock 热解温度/℃Heat treatment temperature 添加量/%Addition rate 实验时间Experiment time 重金属Heavy metals 受试生物Tested organisms 生物有效性Bioavailability 参考文献References 玉米秸秆 350 2 28 d Cd、Cu、Pb — DTPA萃取Cd、Cu、Pb浓度分别降低11.9%、14.3%和23.8% [74] 鸡粪 500 5 90 d Cu — NH4NO3萃取Cu降低73% [60] 水稻秸秆 500 1、5 1年 Pb、Cd — CaCl2萃取Pb和Cd分别降低29%和17.7% [61] 竹材 750 1、5 1年 Cu — CaCl2萃取Cu降低26.8%、31.9% [61] 竹材 700—800 2 2个月 Cd — DTPA萃取Cd降低13.4% [42] 园林废弃物 400 6 2个月 Pb、Cd、Cu、Zn 芥菜 DTPA萃取Pb、Cd、Cu、Zn分别降低29.56%、46.04%、59.98%和48.29%；芥菜植株中Cd降低87.97% [42] 杏壳、苹果树 500 5、10 50 d Cd、Zn 芥菜 DTPA萃取Zn降低9.1%和11.2%；DTPA萃取Cd降低11.7%和19.1%；芥菜生物量增加29.35%、18.72%；芥菜生物量降低2.84%、4.48% [73] 胡桃壳 350—500 1、2、5 117 d Pb、Zn 水稻 CaCl2萃取Pb、Zn分别降低41.04%—98.66%、17.78%—96.87%；水稻根、茎、果皮和籽粒降低45.63%、86.4%、64.75%和60.32% [33] 南洋缨（木本植物） 900 1、2.5、5 9周 Cr、Ni、Mn 番茄 MgCl2萃取Cr、Ni、Mn降低95%、14%和19%；番茄植株中Cr、Ni、Mn降低83%、89%和67% [93] 竹材 400 0.5、1、1.5 6个月 Cd 卷心菜、玉米 CaCl2萃取Cd降低93.1%、96.77%；DTPA萃取Cd降低24.55%、63.72%；卷心菜植株中Cd变化为34.5%—23.88%、60.21%—44.57%、80.64%—62.63%；玉米植株中Cd变化为16.73%—27.68%、56.73%—38.4%、79.59%—56.31% [94] 苎麻根 350—550 0.5、1 2个月 Pb、Cd 烟草 NH4NO3萃取Pb降低26.09%、54.35%；烟草叶中Pb降低26.12%、7.22%；烟草茎中Pb降低24.03%、30.52%；烟草叶中Cd降低91.72%和87.01% [95] 注：表中列出均为实验室模拟实验.
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