哌拉西林（piperacillin，PIP）属于青霉素类抗生素. 受现有污水处理设施去除率低^[1]、污水直接排放等因素影响，PIP在环境中已有检出^[2-3]. PIP的预测无效应浓度（Predicted No-effect Concentration， PNEC）较低（0.5 μg·L⁻¹），表明其在很低的浓度水平就具有环境风险^[4]. 因此，有必要了解PIP在水环境中的迁移转化规律.

水解是PIP在水环境中的主要代谢途径^[5]. PIP的主要特征结构是分子内的β-内酰胺环与哌嗪结构，除此以外还含有—NH₂、—COOH和—OH等. β-内酰胺环的水解是青霉素类抗生素在环境中水解的重要途径，即β-内酰胺环结构中的α-氨基和羧酸根基团之间的分子内酰胺化反应，其反应速率受温度、pH、金属离子等影响^[5-10].

本研究测定PIP在不同温度、pH条件下浓度随时间的变化，计算了PIP的水解速率常数、半衰期与活化能. 结合液相色谱质谱分析，推导PIP在不同pH条件下的水解机理.

1.   材料与方法（Materials and methods）

1.1   设备与材料

仪器：液相色谱（1260 infinity Ⅱ，安捷伦，美国），pH计（PHS-3C，上海越平，中国），恒温培养箱（SPX-250B，上海琅玕实验设备有限公司，中国），液相色谱质谱（Xevo-TQD，Waters，美国）.

材料：邻苯二甲酸氢钾（GR，北京化工厂，中国），2-环己氨基乙磺酸（CHES）（≥99.5%，阿拉丁，中国），4-吗啉乙磺酸（MES）（≥99%，阿拉丁，中国），3-吗啉丙磺酸（MOPS）（≥99.5%，阿拉丁，中国），PIP（99.0%，坛墨质检，中国），盐酸（CMOS，国药集团，中国），氢氧化钠（AR，西陇化工股份有限公司，中国），甲醇（HPLC，阿拉丁，中国）.

1.2   反应体系

正交反应体系：温度为15 ℃、25 ℃、35 ℃，pH为3、5、5.6（无缓冲盐）、7、9，每一种实验条件的反应体系平行配置3组. 反应体系均在避光条件下培养，实验所用器具均预先使用高压灭菌处理.在反应开始后的4周内，按一定时间间隔取样测定。

1.3   样品分析

液相色谱：色谱柱（Poroshell EC-C18，4 μm ×4.6 mm × 150 mm），柱温30 ℃，于220 nm处使用VWD检测器进行测定. 进样量为10 μL，流动相A和流动相B分别为0.025 mol·L⁻¹ NaH₂PO₄（45%）和甲醇（55%），流速1.0 mL·min⁻¹ .

液相色谱质谱：色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm × 50 mm × 7 μm）；流动相A和流动相B分别为0.1%甲酸-水溶液和0.1%甲酸-甲醇溶液，流速为0.20 mL·min⁻¹；色谱柱温度为40 ℃；样品进样量为10 μL. 采用全扫描模式检测对质荷比（m/z）为50—600的范围检测，离子源温度为150 ℃；毛细管电压为3.2 V；碰撞气和脱溶剂气流量分别为50 L·h⁻¹和550 L·h⁻¹，去溶剂温度为550 ℃. 流动相为在0—2 min（A 95%，B 5%），2—7 min（A由95%下降至5%， B由5%上升至95%）， 7—8 min（A 5%，B 95%）， 8—10 min （A由5%上升至95%， B由95%下降至5%）.

2.   结果与讨论（Results and discussion）

2.1   温度对PIP水解的影响

PIP在不同温度下的一级动力学水解速率、半衰期及活化能见表1. 在pH一定的条件下，PIP水解速率均随温度的上升而加快. 这与前人的总结的规律相同，即随着温度升高，抗生素更容易水解^{[6, 11]}. 在不同pH条件下，PIP半衰期受温度影响变化趋势相近. 计算PIP的平均水解速率变化因子^[6]，在pH = 3、5、5.6、7、9时，每增加10 ℃，PIP的平均水解速率因子分别增加0.498、0.499、0.499、0.496、0.494 h⁻¹. PIP的平均水解速率变化因子不受pH影响，在不同pH条件下，每增加10 ℃，PIP的平均水解速率变化因子为0.497 h⁻¹.

表 1  温度对PIP在不同pH条件下水解速率、半衰期及活化能的影响

Table 1.  Effect of temperature on the degradation rate, half-life, and activation energy of PIP under different pH conditions

pH	水解速率常数/h−1|半衰期/h			活化能/（kJ·mol−1）
	15 ℃	25 ℃	35 ℃
3	0.0029|240.8	0.0029|236.4	0.0095|72.6	45.3
5	0.0014|503.8	0.0016|439.2	0.0019|364.8	12.0
7	0.0018|384.8	0.0108|64.3	0.0044|155.9	31.2
9	0.0269|25.8	0.1159|6.0	0.1515|4.6	62.9
5.6（无缓冲盐）	0.0013|536.6	0.0013|544.5	0.0032|217.6	34.1

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2.2   pH对PIP水解的影响

pH对PIP的水解速率影响见表1. PIP的水解速率受pH影响较大，当pH = 9时的水解速率最快，pH = 3时次之，pH = 7较慢，在pH = 5和无缓冲盐的体系中更慢. 当pH不同时，PIP水解反应的活化能差异较大，表明PIP的水解应存在不同的反应路径. 当反应超过500 h后，PIP在非碱性条件下的吸收峰面积不再继续降低，因此本文中关于PIP的动力学计算仅使用了500 h前的数据.

研究表明，碱性条件有利于青霉素类抗生素的水解^[12]，青霉素类抗生素在碱性条件下，多以阴离子状态存在，以阿莫西林（Amoxicillin，AMX）为例，当pH大于9.63时，AMX以AMX^2-的形式存在^[13]. 青霉素类抗生素处于离子状态时，更容易发生水解反应^[6]. 除此以外，Zhang等研究发现，羰基对青霉素类抗生素的水解过程有催化作用^[8]. 头孢拉定属于青霉素类抗生素，分子结构内具有β-内酰胺环. 头孢拉定分子内β-内酰胺环C₈-N₅的开环反应存在两种方式. 一是H₂O中的H与—OH同时进攻C₈与N₅；二是—OH先进攻C₈，随后H转移至羰基的O上，再转移至N₅上. 经计算，第二种开环反应的吉布斯自由能低于第一种开环反应，第二种开环反应更容易发生^[8]. 随溶液pH的上升，溶液中游离的—OH增加，有利于第二种开环反应的正向移动，进而加速β-内酰胺环结构的水解.

2.3   PIP的水解产物分析

利用液相色谱质谱对15 ℃不同pH条件下反应40 d后的PIP的水解产物进行检测. 如图1 a所示，PIP （m/z = 518）的保留时间（retention time，RT）为6.0 min（图1 a）. pH = 9时（图1 b），PIP完全水解（在6.0 min处无色谱峰）. PIP的主要水解产物为P1（m/z = 536）（RT = 5.7 min）、P4（m/z = 100）（RT = 2.0 min）、P6（m/z = 554）（RT = 5.2 min）. P1为PIP的β-内酰胺环开环反应的直接水解产物^[14].

图 1  哌拉西林水解产物的总离子流（TIC）图（a） PIP；（b） pH=9；（c） pH=7；（d） pH=5.6；（e） pH=5；（f） pH=3

Figure 1.  TIC on hydrolysis products from Piperacillin

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pH=3时，PIP完全水解，主要水解产物为P2（m/z = 143）（RT = 5.2 min）、P3（m/z = 492）（RT = 5.7 min）（图1 f）. P3是P1失去一个羧基后的水解产物，该反应在pH = 3时更容易发生^[14]. P2是PIP的常见杂质与水解产物^[14-15]，也是商业合成PIP的原料之一^[16]. 对比PIP在pH = 3和pH = 9时的水解产物. 在pH = 9时，未检出P2，因此推测P4为P2在碱性条件下的水解产物. 由于哌嗪结构在碱性条件下不稳定，推测P6为P1中哌嗪结构在碱性条件下水解的产物.

pH = 7、5.6、5时（图1 c，d，e），PIP不完全水解，PIP的剩余浓度分别为5.98、3.63、5.69 μg·L⁻¹. PIP的主要水解产物为P3、P5（m/z = 359）（RT = 6.0 min）. 在pH = 7时，P1检出，在pH = 5时，P2（m/z = 143）（RT = 5.2 min）检出. P5存在于PIP的杂质谱中，是PIP在中性条件下常见的水解产物^[15]. 与pH=3和pH=9时不同，在pH = 7、5.6、5时PIP未完全水解. 原因可能是P1在中性和弱酸性条件下较为稳定，容易与PIP形成稳定的二聚体^[15]，二聚体的存在会抑制PIP的水解. 当pH = 9时，PIP快速水解，不易与P1形成P7（m/z = 1035）（图2）. 研究表明，弱酸条件下更利于P7的生成^[15]，这与我们测定的PIP剩余浓度的差异具有相同的规律. P7的存在使得在中性和弱酸条件下，PIP在500 h后达到PIP、P1与P7之间的化学平衡，进而抑制了PIP的水解. PIP可能的水解机理见图2.

图 2  哌拉西林水解反应机理

Figure 2.  Hydrolysis mechanism of Piperacillin

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3.   结论（Conclusion）

（1）温度每增加10 ℃，PIP的平均水解速率因子增加0.497 h⁻¹.

（2）pH通过影响PIP在反应体系中的存在形式，进而影响其水解的反应途径. 碱性条件下PIP水解更快.

（3）碱性条件下，PIP分子内的哌嗪结构不稳定，会进一步水解，m/z = 143的产物进一步水解为m/z = 100的水解产物，m/z = 536的产物进一步水解为m/z = 554的水解产物.

（4）PIP与其水解产物（m/z = 536）形成的二聚体在弱酸性和中性条件下会抑制PIP的水解.