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生物质能作为世界能源消费体系中的第四大能源，仅次于煤炭、石油和天然气，近年来得到了国家的重点鼓励和扶持，在未来能源结构中，生物质能作为可再生能源将发挥不可替代的作用[1-2]。近十年来，我国畜禽粪便年产量基本稳定在37亿吨，畜禽粪便中含有丰富的水分（50.5%）、有机质（25.5%）、氮（1.63%）、磷（1.54%）、硫化氢以及大量的病原菌等，由于产量巨大且综合利用率不足，是造成环境污染的主要污染源之一[3]，主要表现为易产生面源污染、粪便中病原体释放、气味恶劣等[4-5]，存在分散性、累积性和模糊性等特点，控制难度较大[6]。然而其作为一种生物质能，得到有效利用可以缓解能源紧张带来的压力并减少其对环境造成的污染。厌氧消化作为畜禽粪便等有机污染物的处置方法之一，可以将有机物转化为CH4、CO2和各类小分子脂肪酸，实现资源的进一步利用[7]。
温度作为厌氧消化的主要影响因素之一，将厌氧消化划分为常温厌氧消化（15～25 ℃）、中温厌氧消化（30～40 ℃）和高温厌氧消化（50～60 ℃）[8]，由于常温厌氧消化甲烷产量和有机物降解效率较低，中高温厌氧消化目前应用较为广泛。近年来很多研究表明，在高温厌氧消化过程中，有机物的降解效率、甲烷产量以及挥发性脂肪酸（VFAs）的去除率均高于中温厌氧消化[9-10]。KJERSTADIUS et al[11]通过在35、55和60 ℃下进行厌氧消化实验发现高温能够很好地减少沙门氏菌及大肠杆菌等病原体的释放。FERNÁNDEZ-RODRIGUEZ et al[12]利用Romero模型对中高温厌氧消化微生物最大生长速率（mu(MAX)）进行拟合，结果表明高温过程生长速率较中温过程提高27%～60%，并在更短时间内实现相同水平有机物的降解；同时WANG et al[13]指出通过改变温度进而改变水解酸化细菌和产甲烷菌相对丰度来提高厌氧消化工艺性能。但高温厌氧消化中的菌群易受外部环境的影响，其在厌氧消化过程中的耐热机理及微生物调节机制还有待进一步研究。所以本研究通过对比中高温厌氧消化产气特性及微生物群落结构变化，从分子生物学角度分析其各自微生物调节机制以及高温厌氧消化耐热机理，为实际沼气工程提供理论指导，实现能源高效回收。
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原材料鸡粪取自沈阳市某养鸡场，接种污泥取自沈阳市北部污水处理厂污泥浓缩池，取回后利用鸡粪进行驯化处理，保持接种污泥中微生物活性，鸡粪与接种污泥特性，见表1。
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本实验采用自行设计的4个3 L独立厌氧消化反应器，见图1。
罐体容积为3 L，反应有效容积为2.5 L，反应器设置2组，每组反应器内一次性添加鸡粪150 g、接种污泥500 mL，后用去离子水定容至2.5 L，启动前通过向其通入氮气，保证其严格厌氧的环境。温度分别设置为37和55 ℃，每组实验设置一组平行实验，实验结果取其平均值。实验过程中每隔6 h搅拌一次，每次2 min，待测样品由取料口取出，产生沼气通过湿式气体流量计实时监测，并定期检测pH、SCOD、氨氮、VFAs、菌群多样性等参数变化。
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沼气产量通过湿式气体流量计（LMF-1）测得，甲烷产量通过甲烷气体检测仪（JK60-CH4）测量并计算测得，物料初始TS和VS通过重量法（GB/T28731—2012）测得，溶解性化学需氧量（SCOD）采用重铬酸钾法进行测量（GB/T32208—2015)，利用纳氏试剂分光光度法测量氨氮（TAN）(HJ535—2009)，利用比色法测量总挥发性脂肪酸（VFAs）。
采用16S rRNA基因测序来分析微生物多样性，首先将样品中的DNA采用CATB方法进行提取[14]，并用琼脂糖电泳检测DNA的纯度和浓度。选用特异引物分别对细菌和古菌进行PCR扩增。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，后进行文库的构建和上机测序。并利用PICRCUt进行基因代谢功能预测，将本实验的基因测序数据与代谢功能已知的菌群全谱系基因功能预测谱数据库进行对比，从而实现对基因代谢功能的预测。其中中高温微生物群落样本分别用M（Medium）和H（High）表示，M1—M8与H1—H8分别代表中高温序批式厌氧消化实验随时间变化的8次测量结果。
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温度是影响厌氧消化过程有机物降解效率的关键因素，中高温厌氧消化过程中甲烷产量、pH、SCOD、氨氮等常规参数的变化，见图2。
图2(a)可知，在实验前期底物基质相同的情况下，中高温甲烷日产量变化趋势大致相同，在实验中期高温组甲烷日产量于第19天率先达到峰值，产量为39.77 mL/gVS，中温组于第25 d达到峰值，产量为43.18 mL/gVS，结果表明高温对厌氧消化中有机物具有更高的降解效率[15]，但倘若反应系统内有机质含量过高，高温厌氧消化内会出现较高的碱度和氨氮水平，从而对微生物活性产生抑制。图2(b)可知，中高温厌氧消化累计产甲烷量分别为734.75和699.50 mL/gVS，由于底物中有机质含量较高，首先在高温条件下嗜热菌群对温度具有较高耐受性展现出强大的活性，其他菌群在高温环境下会通过提高自身新陈代谢来提高自身耐受性，使系统产生更多的VFAs，从而影响有机质的降解效率[16]；但与中温组相比，高温组累计产甲烷量曲线能够较快增长并趋于平缓，同样表明高温下有机物降解率更高，能够有效缩短厌氧消化反应周期。
厌氧消化系统内最适pH为6.8～7.2，过高或过低的pH均会对水解酸化细菌和产甲烷菌等微生物产生不同程度的抑制效果。图2(c)反映了pH和VFAs的变化关系，研究发现中高温实验组pH均呈现出前期较低对着反应进行逐渐升高的变化趋势，VFAs也整体呈现出先上升后下降的变化趋势。这是由于大分子有机物在水解酸化细菌的作用下降解为脂肪酸等小分子有机物，从而使VFAs含量逐步上升，其间同时产生大量游离H+导致pH下降。随着反应进行，产甲烷菌逐渐适应了环境并开始利用系统中游离的H+与VFAs合成CH4，VFAs含量开始下降，pH值升高，这与YANG et al[17]的研究结果相似。通过对比发现高温组在整个实验过程中的pH均高于中温组，且VFAs也率先达到峰值，原因是底物中含有较多粗蛋白，蛋白质在高温条件下的转化速率更快，从而提高了系统内的总碱度，对VFAs起到了一定的中和作用[8,18]。ALMEIDA et al[19]发现高温厌氧消化在不需要人为干预的情况下能够使pH稳定在7.0左右，而中温厌氧消化则需要加碱来维持反应系统pH的稳定。
SCOD的含量能够直观地反映出厌氧消化系统内有机质的含量，图2(d)可以看出SCOD随有机质水解呈现出先上升后下降的变化趋势，且高温组在第16 d率先达到峰值（25 170 mg/L），中温组在28 d达到峰值（24 470 mg/L），在序批式实验中底物浓度保持不变，SCOD浓度会随着产甲烷菌对有机质的利用而逐渐降低，产甲烷古菌OTU数目明显上升。在反应结束时，中高温SCOD去除率分别达到66%和63%，SCOD含量的变化能够从侧面反映出系统中的有机物得到有效降解[20]。DUAN et al[21]研究发现TAN浓度会对厌氧消化系统产生不同的抑制效果，当TAN浓度在0～3 000 mg/L时不会对系统产生抑制现象，高温产甲烷菌对氨氮的耐受性阈值为8 000 mg/L，中温产甲烷菌为16 000 mg/L，所以温度的升高会增加氨氮抑制的风险[22-23]。本研究中高温厌氧消化实验氨氮浓度变化如图2(e)所示，由于底物浓度较低，氨氮浓度均在3 000 mg/L以下，不会产生明显的氨抑制现象。由于高温厌氧消化比中温厌氧消化更易受到氨氮抑制，所以在实际工程中尤其在高温厌氧消化工艺中，应避免氨氮浓度过高，使厌氧微生物处于可承受范围之内，保障系统稳定运行。
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本研究基于16S rRNA测序所得的有效数据进行OTUs物种聚类分析，分别得到1 717和1 941个细菌的OTU，中高温细菌样本群落变化，见图3。
中温厌氧消化在门水平上优势菌种主要为Firmicutes、Spirochaetes、Bacteroidetes和Proteobacteria，相对丰度最高分别为69.11%、45.83%、36.30%、17.84%。这4种细菌门下的大部分微生物均可对有机质进行降解并转化为丙酮酸进而产生VFAs和乙醇等代谢产物[24]。Firmicutes中含有众多功能性微生物，在实验前期对大部分有机物（蛋白质、纤维素类、碳水化合物等）进行降解[25]，随着有机质不断被消耗，菌群相对丰度逐渐降低。Bacteroidetes和Proteobacteria作为肠道菌群的优势菌种，主要作用于蛋白质，将其水解为氨基酸，并为自身及其他微生物提供维生素、乳酸和短链脂肪酸等营养物质[20,26]。高温厌氧消化在门水平上的优势菌种主要为Firmicutes、Thermotogae、Bacteroidetes和Proteobacteria，相对丰度最高分别可以达到72.61%、33.39%、35.15%、39.95%。其中Thermotogae是一类嗜热或超嗜热菌群，如热袍菌等细胞内具有错配修复机制（MMR），在受到热损伤后会使DNA片段发生碱基对错位配对，导致遗传信息发生改变，MMR会切除错误的碱基对，然后通过DNA聚合酶和连接酶的作用，合成配对正确的双链DNA分子。因此嗜热菌在DNA重组反应中发挥介导作用，细胞内部含有识别损伤、启动修复的重组介导功能的蛋白以提高细菌的耐热性。中温（左）和高温（右）温厌氧消化细菌菌群相对丰度柱形，见图4。
图4（左）可知，中温厌氧消化过程中属水平上优势菌属主要有unidentified_ Spirochaetaceae、Lactobacillus、Megasphaera和unidentified_Lentimicrobiaceae，其中unidentified_ Spirochaetaceae和Lactobacillus相对丰度最高可达43.08%和20.19%，unidentified_Spirochaetaceae属于螺旋体科（Spirochaetaceae），是一种常见的人畜共患病的病原体，大多存在于被污染的水体及其他环境中，可利用糖类、氨基酸及长链脂肪酸等以维持自身能量需求[27]。Lactobacillus隶属于乳杆菌科，可产生乳酸及多种脂肪酶，可将有机质主要转化为丁酸等脂肪酸类物质，通过PENG et al[28]研究发现其在酸性环境中仍然具有较高活性，能够为其他细菌提供可利用的有机硒等微量元素，这些微量元素在一定程度上可减缓细胞凋亡，但Lactobacillus与其他细菌的互营共生关系还有待进一步研究[29]。Lactobacillus随着反应进行丰度逐渐下降，这与底物浓度及反应系统内的pH变化有关。Megasphaera属于实验前期优势菌种，主要利用Lactobacillus产生的乳酸及果糖[30]，其丰度会随着Lactobacillus变化而变化。unidentified_Lentimicrobiaceae是一种严格厌氧、短棒状革兰氏阴性细菌，最适pH为7.0左右，由于实验后期pH升高致使其丰度主要体现在中温厌氧消化后期；SUN et al[31]指出Lentimicrobiaceae主要作用于碳水化合物，发酵终产物是乙酸盐、苹果酸盐、丙酸盐、甲酸盐和氢离子。
高温厌氧消化属水平优势菌种主要为Defluviitoga、Proteiniphilum、Herbinix、Caproiciproducens等，相对丰度最高分别可达22.14%、16.68%、15.39%、15.34%。图4（右）可知，值得注意的是高温厌氧消化中发现的菌群对温度耐受性较高。Defluviitoga 作为高温厌氧消化优势菌种，属于Thermotogae门，是一种嗜热微嗜盐厌氧的化学有机营养型细菌，最适温度为55 ℃，最适pH为6.5～7.9，具有发酵广谱碳水化合物和酵母提取物的能力，可将大部分的多糖类物质（如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖等）用作电子供体，降解并转化为醋酸盐、H2和CO2，还可将硫代硫酸盐和元素硫还原为H2S[32-33]。Proteiniphilum是一种嗜蛋白质嗜纤维素的功能性细菌，最终产物为乙酸，其在高温厌氧消化反应前中期丰度较高，并随着反应进行丰度逐渐下降，这与系统内底物浓度变化有关。WU et al[34]检索并筛选了该属四个基因组是否存在碳水化合物活性酶，结果表明所有分析的基因组都包含多种参与逐步水解的酶，包括糖苷水解酶（GH)、碳水化合物酯酶（CE)，并验证了其功能性。Herbinix和Caproiciproducens的最适温度范围为40～65 ℃，为高温厌氧消化过程中的次优势菌种，其中Herbinix主要作用于纤维素，将纤维二糖降解为乙酸、乙醇、丁酸和氢气等产物[35]。Caproiciproducens可将果糖作为底物，转化为乳酸、乙酸、正丁酸、正己酸、H2和CO2，ESQUIVEL-ELIZONDO et al[36]将其全基因组和反向β氧化基因与其他细菌进行了比较，同样验证了这一观点。
通过对中高温16S rRNA测序结果细菌群落基因功能预测，分析中高温细菌群落在基因功能上的差异，见图5。
细菌结构域中注释的序列主要分为6个功能组：细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢和有机系统，其中细胞之间的膜运输、遗传信息的复制与修复、碳水化合物和氨基酸的代谢所占基因数量最高，可作为细菌基因的主要功能表达。通过对比中高温细菌群落功能预测可以看出，高温厌氧消化细菌基因表达在6个功能组中均高于中温组。造成这种现象的原因是高温会促进细胞的新陈代谢，提高细胞与环境之间的物质交换效率，促进细胞内遗传信息的表达。TIAN et al[37]也指出随着温度的升高，水解酸化细菌代谢明显增多，且涉及水解、产酸阶段的细菌多样性明显增加，细菌在高温环境的刺激下，通过提高新陈代谢，促进肽链中二硫键的形成，增加双链DNA分子的空间位阻，来保证其在高温下的活性。
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中高温厌氧消化古菌门水平优势菌种主要为Euryarchaeota，Euryarchaeota在16S rRNA物种进化树上属于一个单系群，包含了古菌中大部分群落，产甲烷阶段的产甲烷菌以及嗜热、嗜盐的厌氧菌等均来自Euryarchaeota门。中高温厌氧消化古菌菌群相对丰度，见图6。
图6(a)可知，中温厌氧消化属水平优势菌种主要为：Methanosarcina、Methanosaeta、Methanosphaera、Methanospirillum、Methanoregula，相对丰度最高分别可达到45.38%、24.73%、29.68%、21.50%和18.24%，其中Methanosaeta属于食乙酸产甲烷古菌，主要将乙酸和H2转化为CH4，在厌氧消化过程中，也可在一定程度上利用其他类型底物，例如将甲基胺或甲醇歧化为CH4和CO2[38]。在中温厌氧消化实验中由于底物逐渐被降解，其丰度随着反应进行逐渐降低，符合微生物生态学变化规律。Methanosarcina是已知的唯一一种可利用所有甲烷代谢途径的菌群，最适pH为6.5～8，由于受pH影响，主要作为在实验后期优势菌种，Methanosarcina的第一种代谢途径为利用乙酸，并转化为H2和CO2，然后将H2和CO2作为原料合成CH4；第二种代谢途径是在甲基转移酶的作用下将甲醇、甲胺等化合物转化成甲烷[39]。值得注意的是，Methanosarcina是厌氧消化过程中最重要的产甲烷菌群，还可根据环境温度划分为嗜温甲烷八叠球菌和嗜热甲烷八叠球菌[39]。
高温厌氧消化产甲烷古菌属水平优势菌种相对丰度如图6(b)，可以看出其在属水平上的优势菌种主要为Methanosarcina、Methanothermobacter、Methanospirillum、Methanosaeta和Methanoregula，由于高温厌氧消化pH一直处于6.5以上，所以Methanosarcina在实验前期即表现出较大的优势，并且丰度随着有机底物消耗而逐渐下降。Methanothermobacter是一种热自养氢营养型甲烷嗜热杆菌，最适生长温度为65～70 ℃，为实验前期优势菌种，可以将H2、甲醇等物质转化为CH4和CO2，以提供自身细胞生理活动需求[40]，麻婷婷等[41]同样发现Methanothermobacter是高温条件下石油烃降解产甲烷的优势古菌之一。在实验后期优势菌种主要为Methanospirillum和Methanosaeta，通过对比可以看出中温厌氧消化大部分产甲烷优势菌种同样出现在高温厌氧消化过程中，造成这种现象的原因是这些产甲烷菌对高温具有较好的耐受性，细胞中的DNA在高温条件下触发损伤诱导反应（DDR），激活修复蛋白，修复DNA损伤，维护细菌基因组的稳定性[42]。SUTER[43]指出DDR是多层次、多水平调控，与损伤信号转导和DNA修复有关的基因多达500多个；当DNA受到外界环境胁迫造成损伤时MRN (X)、ATRIP、Rad17等损伤识别蛋白会通过ATM、ATR等蛋白酶将信号传递给效应蛋白，进而影响DNA合成、细胞周期、细胞凋亡、衰老以及DNA修复等细胞进程[44]。中高温古菌群落功能预测，见图7。
通过利用16S rRNA基因测序数据与代谢功能已知的微生物基因组数据库进行对比，实现了中高温产甲烷古菌基因的功能预测，见图7，古菌结构域中注释的序列同样分为六个功能组：细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢和有机系统，其代谢通路主要为能量代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、膜运输、遗传信息翻译与表达，KUNDU et al[45]在中高温连续式厌氧消化实验中发现，与在55 ℃下运行的反应器相比，37 ℃下的反应器能够承受更高的有机负荷且微生物群落更加多样化，这与本实验研究一致。中温厌氧消化过程中基因的代谢通路均高于高温厌氧消化，造成这种现象的原因是高温阻断了部分乙酸营养型产甲烷菌的代谢通路，主要以氢营养型产甲烷代谢通路为主，并得到了其他属明确定义的共生产氢细菌的支持，这与GAO et al[46]研究结果一致。
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为了进一步探究微生物群落结构，基于16S rRNA数据集对中高温厌氧消化α多样性指数进行评估[47]，细菌和古菌的α多样性见表2与表3，本研究每组样品生物覆盖率均在0.99以上，可以认为测序深度已基本覆盖样品中的所有物种。
表2可知，高温厌氧消化过程中样品observed species指数较高，所含物种较为丰富，且其自身丰富度变化与厌氧消化系统内的底物浓度呈正相关变化，与WITTEBOLLE的研究结果一致[48]。Shannon和Simpson能够评估物种的均匀度，值越大表示各物种分配越均匀[49-50]，可用来评估优势菌群在反应系统中的地位和作用，可以看出中高温各组样品均匀度指数相差不大，物种分配较为均匀。Chao1和ACE的作用与物种数指数类似，数值越大表示表示物种丰富度和多样性越高[51]，通过对比中高温多样性指数发现，在细菌域中高温厌氧消化的Chao1和ACE指数整体高于中温厌氧消化，而在古菌域中高温厌氧消化的Chao1和ACE指数整体较低，造成这种现象的原因是水解酸化细菌所覆盖的菌群数量远比产甲烷古菌多，样本中的OUT数目即可验证这一观点，温度的变化使水解酸化阶段衍生出更多细菌，产甲烷古菌在受到温度的影响后，在底物充足的情况下，尚且可以通过调节自身代谢来适应环境胁迫，但随着底物浓度不断被消耗，没有足够能量来维持自身生理活动，多样性指数开始下降，这与前文的研究可以形成呼应。
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（1）高温厌氧消化比中温厌氧消化提前6 d达到产甲烷峰值，由于底物浓度相同，中高温累计产甲烷量相差不大，高温组pH始终高于中温组，能够在更短时间达到相对稳定的pH，系统不易产生酸化现象，且VFAs与SCOD的变化与甲烷产量变化相似，说明高温条件更有利于有机物的水解酸化和甲烷的生成。
（2）中温厌氧消化水解酸化阶段优势菌种为unidentified_ Spirochaetaceae、Lactobacillus和Megasphaera，对酸性环境具有较好的抗逆性，产物为乙酸和丁酸等脂肪酸类物质；高温水解阶段的优势菌种主要为Defluviitoga、Proteiniphilum、Herbinix和Caproiciproducens等，其对高温环境具有较好的抗逆性，其中Defluviitoga可将大部分多糖类物质当做电子受体，并降解为醋酸盐、H2和CO2，提高了水解酸化效率，使厌氧消化反应周期缩短12%，同时高温环境减少了病原体的产生。中高温厌氧消化产甲烷优势菌群也存在较大差异，且分别属于不同的功能性产甲烷菌。
中高温鸡粪厌氧消化微生物调节机制对比及耐热机理研究
Comparison of microbial regulation mechanisms and heat-resistant mechanism of anaerobic digestion of chicken manure at medium and high temperature
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摘要: 温度对厌氧消化系统内微生物调节机制的影响尚不清楚，通过对比中高温厌氧消化实验，分析了其各自微生物调节机制以及高温厌氧消化耐热机理。结果表明，在底物浓度相同的情况下高温厌氧消化比中温提前6天达到产甲烷峰值，高温条件能够缩短厌氧消化反应周期，更有利于有机物的水解酸化和甲烷的生成；Defluviitoga作为高温厌氧消化过程水解阶段优势菌种，对高温环境具有较好的抗逆性，可将大部分多糖类物质当作电子受体，并降解为醋酸盐、H2和CO2；Methanosarcina作为中高温厌氧消化产甲烷阶段优势菌种，能够适应中温高温两种不同环境，且可利用所有甲烷代谢途径（食乙酸、食氢、食甲基化合物），产甲烷潜力巨大。Abstract: The influence of temperature on the microbial regulation mechanism in the anaerobic digestion system is unclear. The microbial regulation mechanisms and the mechanism of heat resistance of high-temperature anaerobic digestion by comparing the anaerobic digestion experiments at medium and high temperatures were analyzed. The results showed that under the condition of the same substrate concentration, high-temperature anaerobic digestion reached the peak of methane production 6 days earlier than medium-temperature, and high-temperature conditions could shorten the reaction cycle, which was more conducive to the hydrolysis and acidification of organic matter and the formation of methane. Defluviitoga, as the dominant strain in the hydrolysis stage of the high-temperature anaerobic digestion process, had good stress resistance to high-temperature and could use most polysaccharides as electron acceptors and degrade them into acetate, H2 and CO2. Methanosarcina, as the dominant strain in the methanogenic stage of medium-high temperature anaerobic digestion, could adapt to two different environments, use all methane metabolic pathways (eating acetic acid, hydrogen, and methyl compounds), and has great potential for methane production.
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生物质能作为世界能源消费体系中的第四大能源，仅次于煤炭、石油和天然气，近年来得到了国家的重点鼓励和扶持，在未来能源结构中，生物质能作为可再生能源将发挥不可替代的作用[1-2]。近十年来，我国畜禽粪便年产量基本稳定在37亿吨，畜禽粪便中含有丰富的水分（50.5%）、有机质（25.5%）、氮（1.63%）、磷（1.54%）、硫化氢以及大量的病原菌等，由于产量巨大且综合利用率不足，是造成环境污染的主要污染源之一[3]，主要表现为易产生面源污染、粪便中病原体释放、气味恶劣等[4-5]，存在分散性、累积性和模糊性等特点，控制难度较大[6]。然而其作为一种生物质能，得到有效利用可以缓解能源紧张带来的压力并减少其对环境造成的污染。厌氧消化作为畜禽粪便等有机污染物的处置方法之一，可以将有机物转化为CH4、CO2和各类小分子脂肪酸，实现资源的进一步利用[7]。
温度作为厌氧消化的主要影响因素之一，将厌氧消化划分为常温厌氧消化（15～25 ℃）、中温厌氧消化（30～40 ℃）和高温厌氧消化（50～60 ℃）[8]，由于常温厌氧消化甲烷产量和有机物降解效率较低，中高温厌氧消化目前应用较为广泛。近年来很多研究表明，在高温厌氧消化过程中，有机物的降解效率、甲烷产量以及挥发性脂肪酸（VFAs）的去除率均高于中温厌氧消化[9-10]。KJERSTADIUS et al[11]通过在35、55和60 ℃下进行厌氧消化实验发现高温能够很好地减少沙门氏菌及大肠杆菌等病原体的释放。FERNÁNDEZ-RODRIGUEZ et al[12]利用Romero模型对中高温厌氧消化微生物最大生长速率（mu(MAX)）进行拟合，结果表明高温过程生长速率较中温过程提高27%～60%，并在更短时间内实现相同水平有机物的降解；同时WANG et al[13]指出通过改变温度进而改变水解酸化细菌和产甲烷菌相对丰度来提高厌氧消化工艺性能。但高温厌氧消化中的菌群易受外部环境的影响，其在厌氧消化过程中的耐热机理及微生物调节机制还有待进一步研究。所以本研究通过对比中高温厌氧消化产气特性及微生物群落结构变化，从分子生物学角度分析其各自微生物调节机制以及高温厌氧消化耐热机理，为实际沼气工程提供理论指导，实现能源高效回收。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
原材料鸡粪取自沈阳市某养鸡场，接种污泥取自沈阳市北部污水处理厂污泥浓缩池，取回后利用鸡粪进行驯化处理，保持接种污泥中微生物活性，鸡粪与接种污泥特性，见表1。
表 1 鸡粪与接种污泥的性质Table 1. Properties of chicken manure and inoculated sludge% 实验材料 TS VS pH C N 粗蛋白 粗脂肪 粗纤维 钙 鸡粪 27.29 23.33 − 46.07 4.73 22.34 2.44 10.72 10.00 接种污泥 18.12 8.36 6.41 − − − − − − | Show Table
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1.2 实验设计
本实验采用自行设计的4个3 L独立厌氧消化反应器，见图1。
图 1 厌氧消化实验装置Figure 1. Diagram of anaerobic digestion experiment device1.取料口；2.恒温培养箱；3.厌氧消化反应罐；4.进料口；5.搅拌器；6.排气口；7.湿式气体流量计罐体容积为3 L，反应有效容积为2.5 L，反应器设置2组，每组反应器内一次性添加鸡粪150 g、接种污泥500 mL，后用去离子水定容至2.5 L，启动前通过向其通入氮气，保证其严格厌氧的环境。温度分别设置为37和55 ℃，每组实验设置一组平行实验，实验结果取其平均值。实验过程中每隔6 h搅拌一次，每次2 min，待测样品由取料口取出，产生沼气通过湿式气体流量计实时监测，并定期检测pH、SCOD、氨氮、VFAs、菌群多样性等参数变化。
1.3 分析方法
沼气产量通过湿式气体流量计（LMF-1）测得，甲烷产量通过甲烷气体检测仪（JK60-CH4）测量并计算测得，物料初始TS和VS通过重量法（GB/T28731—2012）测得，溶解性化学需氧量（SCOD）采用重铬酸钾法进行测量（GB/T32208—2015)，利用纳氏试剂分光光度法测量氨氮（TAN）(HJ535—2009)，利用比色法测量总挥发性脂肪酸（VFAs）。
采用16S rRNA基因测序来分析微生物多样性，首先将样品中的DNA采用CATB方法进行提取[14]，并用琼脂糖电泳检测DNA的纯度和浓度。选用特异引物分别对细菌和古菌进行PCR扩增。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，后进行文库的构建和上机测序。并利用PICRCUt进行基因代谢功能预测，将本实验的基因测序数据与代谢功能已知的菌群全谱系基因功能预测谱数据库进行对比，从而实现对基因代谢功能的预测。其中中高温微生物群落样本分别用M（Medium）和H（High）表示，M1—M8与H1—H8分别代表中高温序批式厌氧消化实验随时间变化的8次测量结果。
2. 结果与讨论
2.1 中高温厌氧消化产甲烷性能对比
温度是影响厌氧消化过程有机物降解效率的关键因素，中高温厌氧消化过程中甲烷产量、pH、SCOD、氨氮等常规参数的变化，见图2。
图 2 中高温厌氧消化常规参数对比Figure 2. Comparison of conventional parameters of medium and high temperature anaerobic digestion图2(a)可知，在实验前期底物基质相同的情况下，中高温甲烷日产量变化趋势大致相同，在实验中期高温组甲烷日产量于第19天率先达到峰值，产量为39.77 mL/gVS，中温组于第25 d达到峰值，产量为43.18 mL/gVS，结果表明高温对厌氧消化中有机物具有更高的降解效率[15]，但倘若反应系统内有机质含量过高，高温厌氧消化内会出现较高的碱度和氨氮水平，从而对微生物活性产生抑制。图2(b)可知，中高温厌氧消化累计产甲烷量分别为734.75和699.50 mL/gVS，由于底物中有机质含量较高，首先在高温条件下嗜热菌群对温度具有较高耐受性展现出强大的活性，其他菌群在高温环境下会通过提高自身新陈代谢来提高自身耐受性，使系统产生更多的VFAs，从而影响有机质的降解效率[16]；但与中温组相比，高温组累计产甲烷量曲线能够较快增长并趋于平缓，同样表明高温下有机物降解率更高，能够有效缩短厌氧消化反应周期。
厌氧消化系统内最适pH为6.8～7.2，过高或过低的pH均会对水解酸化细菌和产甲烷菌等微生物产生不同程度的抑制效果。图2(c)反映了pH和VFAs的变化关系，研究发现中高温实验组pH均呈现出前期较低对着反应进行逐渐升高的变化趋势，VFAs也整体呈现出先上升后下降的变化趋势。这是由于大分子有机物在水解酸化细菌的作用下降解为脂肪酸等小分子有机物，从而使VFAs含量逐步上升，其间同时产生大量游离H+导致pH下降。随着反应进行，产甲烷菌逐渐适应了环境并开始利用系统中游离的H+与VFAs合成CH4，VFAs含量开始下降，pH值升高，这与YANG et al[17]的研究结果相似。通过对比发现高温组在整个实验过程中的pH均高于中温组，且VFAs也率先达到峰值，原因是底物中含有较多粗蛋白，蛋白质在高温条件下的转化速率更快，从而提高了系统内的总碱度，对VFAs起到了一定的中和作用[8,18]。ALMEIDA et al[19]发现高温厌氧消化在不需要人为干预的情况下能够使pH稳定在7.0左右，而中温厌氧消化则需要加碱来维持反应系统pH的稳定。
SCOD的含量能够直观地反映出厌氧消化系统内有机质的含量，图2(d)可以看出SCOD随有机质水解呈现出先上升后下降的变化趋势，且高温组在第16 d率先达到峰值（25 170 mg/L），中温组在28 d达到峰值（24 470 mg/L），在序批式实验中底物浓度保持不变，SCOD浓度会随着产甲烷菌对有机质的利用而逐渐降低，产甲烷古菌OTU数目明显上升。在反应结束时，中高温SCOD去除率分别达到66%和63%，SCOD含量的变化能够从侧面反映出系统中的有机物得到有效降解[20]。DUAN et al[21]研究发现TAN浓度会对厌氧消化系统产生不同的抑制效果，当TAN浓度在0～3 000 mg/L时不会对系统产生抑制现象，高温产甲烷菌对氨氮的耐受性阈值为8 000 mg/L，中温产甲烷菌为16 000 mg/L，所以温度的升高会增加氨氮抑制的风险[22-23]。本研究中高温厌氧消化实验氨氮浓度变化如图2(e)所示，由于底物浓度较低，氨氮浓度均在3 000 mg/L以下，不会产生明显的氨抑制现象。由于高温厌氧消化比中温厌氧消化更易受到氨氮抑制，所以在实际工程中尤其在高温厌氧消化工艺中，应避免氨氮浓度过高，使厌氧微生物处于可承受范围之内，保障系统稳定运行。
2.2 中高温厌氧消化细菌菌群丰度变化
本研究基于16S rRNA测序所得的有效数据进行OTUs物种聚类分析，分别得到1 717和1 941个细菌的OTU，中高温细菌样本群落变化，见图3。
图 3 中高温细菌样本群落热图Figure 3. Heat map of bacterial community in medium and high temperature samples中温厌氧消化在门水平上优势菌种主要为Firmicutes、Spirochaetes、Bacteroidetes和Proteobacteria，相对丰度最高分别为69.11%、45.83%、36.30%、17.84%。这4种细菌门下的大部分微生物均可对有机质进行降解并转化为丙酮酸进而产生VFAs和乙醇等代谢产物[24]。Firmicutes中含有众多功能性微生物，在实验前期对大部分有机物（蛋白质、纤维素类、碳水化合物等）进行降解[25]，随着有机质不断被消耗，菌群相对丰度逐渐降低。Bacteroidetes和Proteobacteria作为肠道菌群的优势菌种，主要作用于蛋白质，将其水解为氨基酸，并为自身及其他微生物提供维生素、乳酸和短链脂肪酸等营养物质[20,26]。高温厌氧消化在门水平上的优势菌种主要为Firmicutes、Thermotogae、Bacteroidetes和Proteobacteria，相对丰度最高分别可以达到72.61%、33.39%、35.15%、39.95%。其中Thermotogae是一类嗜热或超嗜热菌群，如热袍菌等细胞内具有错配修复机制（MMR），在受到热损伤后会使DNA片段发生碱基对错位配对，导致遗传信息发生改变，MMR会切除错误的碱基对，然后通过DNA聚合酶和连接酶的作用，合成配对正确的双链DNA分子。因此嗜热菌在DNA重组反应中发挥介导作用，细胞内部含有识别损伤、启动修复的重组介导功能的蛋白以提高细菌的耐热性。中温（左）和高温（右）温厌氧消化细菌菌群相对丰度柱形，见图4。
图 4 中温（左）和高温（右）温厌氧消化细菌菌群相对丰度柱形图Figure 4. Histogram of relative abundance of bacterial flora in anaerobic digestion at medium (left) and high (right) temperatures图4（左）可知，中温厌氧消化过程中属水平上优势菌属主要有unidentified_ Spirochaetaceae、Lactobacillus、Megasphaera和unidentified_Lentimicrobiaceae，其中unidentified_ Spirochaetaceae和Lactobacillus相对丰度最高可达43.08%和20.19%，unidentified_Spirochaetaceae属于螺旋体科（Spirochaetaceae），是一种常见的人畜共患病的病原体，大多存在于被污染的水体及其他环境中，可利用糖类、氨基酸及长链脂肪酸等以维持自身能量需求[27]。Lactobacillus隶属于乳杆菌科，可产生乳酸及多种脂肪酶，可将有机质主要转化为丁酸等脂肪酸类物质，通过PENG et al[28]研究发现其在酸性环境中仍然具有较高活性，能够为其他细菌提供可利用的有机硒等微量元素，这些微量元素在一定程度上可减缓细胞凋亡，但Lactobacillus与其他细菌的互营共生关系还有待进一步研究[29]。Lactobacillus随着反应进行丰度逐渐下降，这与底物浓度及反应系统内的pH变化有关。Megasphaera属于实验前期优势菌种，主要利用Lactobacillus产生的乳酸及果糖[30]，其丰度会随着Lactobacillus变化而变化。unidentified_Lentimicrobiaceae是一种严格厌氧、短棒状革兰氏阴性细菌，最适pH为7.0左右，由于实验后期pH升高致使其丰度主要体现在中温厌氧消化后期；SUN et al[31]指出Lentimicrobiaceae主要作用于碳水化合物，发酵终产物是乙酸盐、苹果酸盐、丙酸盐、甲酸盐和氢离子。
高温厌氧消化属水平优势菌种主要为Defluviitoga、Proteiniphilum、Herbinix、Caproiciproducens等，相对丰度最高分别可达22.14%、16.68%、15.39%、15.34%。图4（右）可知，值得注意的是高温厌氧消化中发现的菌群对温度耐受性较高。Defluviitoga 作为高温厌氧消化优势菌种，属于Thermotogae门，是一种嗜热微嗜盐厌氧的化学有机营养型细菌，最适温度为55 ℃，最适pH为6.5～7.9，具有发酵广谱碳水化合物和酵母提取物的能力，可将大部分的多糖类物质（如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖等）用作电子供体，降解并转化为醋酸盐、H2和CO2，还可将硫代硫酸盐和元素硫还原为H2S[32-33]。Proteiniphilum是一种嗜蛋白质嗜纤维素的功能性细菌，最终产物为乙酸，其在高温厌氧消化反应前中期丰度较高，并随着反应进行丰度逐渐下降，这与系统内底物浓度变化有关。WU et al[34]检索并筛选了该属四个基因组是否存在碳水化合物活性酶，结果表明所有分析的基因组都包含多种参与逐步水解的酶，包括糖苷水解酶（GH)、碳水化合物酯酶（CE)，并验证了其功能性。Herbinix和Caproiciproducens的最适温度范围为40～65 ℃，为高温厌氧消化过程中的次优势菌种，其中Herbinix主要作用于纤维素，将纤维二糖降解为乙酸、乙醇、丁酸和氢气等产物[35]。Caproiciproducens可将果糖作为底物，转化为乳酸、乙酸、正丁酸、正己酸、H2和CO2，ESQUIVEL-ELIZONDO et al[36]将其全基因组和反向β氧化基因与其他细菌进行了比较，同样验证了这一观点。
通过对中高温16S rRNA测序结果细菌群落基因功能预测，分析中高温细菌群落在基因功能上的差异，见图5。
图 5 中高温细菌群落功能预测Figure 5. Prediction of bacterial community function at medium and high temperatures细菌结构域中注释的序列主要分为6个功能组：细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢和有机系统，其中细胞之间的膜运输、遗传信息的复制与修复、碳水化合物和氨基酸的代谢所占基因数量最高，可作为细菌基因的主要功能表达。通过对比中高温细菌群落功能预测可以看出，高温厌氧消化细菌基因表达在6个功能组中均高于中温组。造成这种现象的原因是高温会促进细胞的新陈代谢，提高细胞与环境之间的物质交换效率，促进细胞内遗传信息的表达。TIAN et al[37]也指出随着温度的升高，水解酸化细菌代谢明显增多，且涉及水解、产酸阶段的细菌多样性明显增加，细菌在高温环境的刺激下，通过提高新陈代谢，促进肽链中二硫键的形成，增加双链DNA分子的空间位阻，来保证其在高温下的活性。
2.3 中高温厌氧消化古菌菌群丰度变化
中高温厌氧消化古菌门水平优势菌种主要为Euryarchaeota，Euryarchaeota在16S rRNA物种进化树上属于一个单系群，包含了古菌中大部分群落，产甲烷阶段的产甲烷菌以及嗜热、嗜盐的厌氧菌等均来自Euryarchaeota门。中高温厌氧消化古菌菌群相对丰度，见图6。
图 6 中高温厌氧消化古菌菌群相对丰度Figure 6. Histogram of relative abundance of archaea in mid-high temperature anaerobic digestion图6(a)可知，中温厌氧消化属水平优势菌种主要为：Methanosarcina、Methanosaeta、Methanosphaera、Methanospirillum、Methanoregula，相对丰度最高分别可达到45.38%、24.73%、29.68%、21.50%和18.24%，其中Methanosaeta属于食乙酸产甲烷古菌，主要将乙酸和H2转化为CH4，在厌氧消化过程中，也可在一定程度上利用其他类型底物，例如将甲基胺或甲醇歧化为CH4和CO2[38]。在中温厌氧消化实验中由于底物逐渐被降解，其丰度随着反应进行逐渐降低，符合微生物生态学变化规律。Methanosarcina是已知的唯一一种可利用所有甲烷代谢途径的菌群，最适pH为6.5～8，由于受pH影响，主要作为在实验后期优势菌种，Methanosarcina的第一种代谢途径为利用乙酸，并转化为H2和CO2，然后将H2和CO2作为原料合成CH4；第二种代谢途径是在甲基转移酶的作用下将甲醇、甲胺等化合物转化成甲烷[39]。值得注意的是，Methanosarcina是厌氧消化过程中最重要的产甲烷菌群，还可根据环境温度划分为嗜温甲烷八叠球菌和嗜热甲烷八叠球菌[39]。
高温厌氧消化产甲烷古菌属水平优势菌种相对丰度如图6(b)，可以看出其在属水平上的优势菌种主要为Methanosarcina、Methanothermobacter、Methanospirillum、Methanosaeta和Methanoregula，由于高温厌氧消化pH一直处于6.5以上，所以Methanosarcina在实验前期即表现出较大的优势，并且丰度随着有机底物消耗而逐渐下降。Methanothermobacter是一种热自养氢营养型甲烷嗜热杆菌，最适生长温度为65～70 ℃，为实验前期优势菌种，可以将H2、甲醇等物质转化为CH4和CO2，以提供自身细胞生理活动需求[40]，麻婷婷等[41]同样发现Methanothermobacter是高温条件下石油烃降解产甲烷的优势古菌之一。在实验后期优势菌种主要为Methanospirillum和Methanosaeta，通过对比可以看出中温厌氧消化大部分产甲烷优势菌种同样出现在高温厌氧消化过程中，造成这种现象的原因是这些产甲烷菌对高温具有较好的耐受性，细胞中的DNA在高温条件下触发损伤诱导反应（DDR），激活修复蛋白，修复DNA损伤，维护细菌基因组的稳定性[42]。SUTER[43]指出DDR是多层次、多水平调控，与损伤信号转导和DNA修复有关的基因多达500多个；当DNA受到外界环境胁迫造成损伤时MRN (X)、ATRIP、Rad17等损伤识别蛋白会通过ATM、ATR等蛋白酶将信号传递给效应蛋白，进而影响DNA合成、细胞周期、细胞凋亡、衰老以及DNA修复等细胞进程[44]。中高温古菌群落功能预测，见图7。
图 7 中高温古菌群落功能预测Figure 7. Prediction of archaea community function at medium and high temperatures通过利用16S rRNA基因测序数据与代谢功能已知的微生物基因组数据库进行对比，实现了中高温产甲烷古菌基因的功能预测，见图7，古菌结构域中注释的序列同样分为六个功能组：细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢和有机系统，其代谢通路主要为能量代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、膜运输、遗传信息翻译与表达，KUNDU et al[45]在中高温连续式厌氧消化实验中发现，与在55 ℃下运行的反应器相比，37 ℃下的反应器能够承受更高的有机负荷且微生物群落更加多样化，这与本实验研究一致。中温厌氧消化过程中基因的代谢通路均高于高温厌氧消化，造成这种现象的原因是高温阻断了部分乙酸营养型产甲烷菌的代谢通路，主要以氢营养型产甲烷代谢通路为主，并得到了其他属明确定义的共生产氢细菌的支持，这与GAO et al[46]研究结果一致。
2.4 中高温厌氧消化α多样性变化
为了进一步探究微生物群落结构，基于16S rRNA数据集对中高温厌氧消化α多样性指数进行评估[47]，细菌和古菌的α多样性见表2与表3，本研究每组样品生物覆盖率均在0.99以上，可以认为测序深度已基本覆盖样品中的所有物种。
表 2 中高温厌氧消化水解酸化细菌α多样性变化Table 2. Changes in the α diversity of acidified bacteria during mid-high temperature anaerobic digestion组数 物种数/个 均匀度指数 多样性指数 生物覆盖率 Shannon Simpson Chao1 ACE M1 1593 6.432 0.934 1816.911 1898.458 0.993 M2 1742 7.819 0.987 1946.074 2056.014 0.993 M3 1293 7.341 0.984 1460.754 1564.026 0.994 M4 1848 7.876 0.983 2075.346 2171.558 0.992 M5 1758 7.461 0.970 2013.739 2124.699 0.992 M6 1857 7.474 0.968 2108.730 2193.657 0.992 M7 1756 6.936 0.962 2059.034 2163.817 0.991 M8 1869 7.331 0.973 2125.733 2238.300 0.992 H1 2245 8.053 0.979 2538.160 2607.659 0.991 H2 2056 7.666 0.980 2365.965 2487.267 0.990 H3 1921 7.275 0.976 2232.204 02382.96 0.990 H4 2391 8.597 0.991 2650.590 2772.402 0.990 H5 1897 6.837 0.961 2194.613 2335.348 0.990 H6 1615 7.161 0.978 1880.154 2005.092 0.992 H7 1769 6.784 0.898 1964.061 2037.415 0.992 H8 1634 6.802 0.968 1905.350 2043.547 0.991 | Show TableDownLoad:
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表 3 中高温厌氧消化产甲烷古菌α多样性变化Table 3. Variation of alpha diversity of methanogenic archaea during mid-high temperature anaerobic digestion组数 物种数/个 均匀度指数 多样性指数 生物覆盖率 Shannon Simpson Chao1 ACE M1 533 4.109 0.822 602.843 620.164 0.998 M2 584 5.413 0.946 631.616 644.214 0.999 M3 544 5.315 0.947 602.235 611.049 0.999 M4 514 5.456 0.951 569.836 573.337 0.999 M5 624 5.742 0.962 669.764 685.770 0.999 M6 316 4.421 0.854 341.161 339.959 0.999 M7 191 3.617 0.812 217.400 218.061 1.000 M8 189 3.780 0.847 204.750 209.107 1.000 H1 446 5.027 0.932 497.679 528.585 0.999 H2 553 5.184 0.939 613.061 633.953 0.998 H3 483 5.244 0.946 516.514 527.499 0.999 H4 664 5.414 0.943 758.897 757.104 0.998 H5 530 5.322 0.941 587.554 588.961 0.999 H6 276 2.899 0.681 298.000 308.641 0.999 H7 162 2.984 0.786 193.231 183.107 1.000 H8 191 3.153 0.805 204.034 211.344 1.000 | Show TableDownLoad:
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表2可知，高温厌氧消化过程中样品observed species指数较高，所含物种较为丰富，且其自身丰富度变化与厌氧消化系统内的底物浓度呈正相关变化，与WITTEBOLLE的研究结果一致[48]。Shannon和Simpson能够评估物种的均匀度，值越大表示各物种分配越均匀[49-50]，可用来评估优势菌群在反应系统中的地位和作用，可以看出中高温各组样品均匀度指数相差不大，物种分配较为均匀。Chao1和ACE的作用与物种数指数类似，数值越大表示表示物种丰富度和多样性越高[51]，通过对比中高温多样性指数发现，在细菌域中高温厌氧消化的Chao1和ACE指数整体高于中温厌氧消化，而在古菌域中高温厌氧消化的Chao1和ACE指数整体较低，造成这种现象的原因是水解酸化细菌所覆盖的菌群数量远比产甲烷古菌多，样本中的OUT数目即可验证这一观点，温度的变化使水解酸化阶段衍生出更多细菌，产甲烷古菌在受到温度的影响后，在底物充足的情况下，尚且可以通过调节自身代谢来适应环境胁迫，但随着底物浓度不断被消耗，没有足够能量来维持自身生理活动，多样性指数开始下降，这与前文的研究可以形成呼应。
3. 结论
（1）高温厌氧消化比中温厌氧消化提前6 d达到产甲烷峰值，由于底物浓度相同，中高温累计产甲烷量相差不大，高温组pH始终高于中温组，能够在更短时间达到相对稳定的pH，系统不易产生酸化现象，且VFAs与SCOD的变化与甲烷产量变化相似，说明高温条件更有利于有机物的水解酸化和甲烷的生成。
（2）中温厌氧消化水解酸化阶段优势菌种为unidentified_ Spirochaetaceae、Lactobacillus和Megasphaera，对酸性环境具有较好的抗逆性，产物为乙酸和丁酸等脂肪酸类物质；高温水解阶段的优势菌种主要为Defluviitoga、Proteiniphilum、Herbinix和Caproiciproducens等，其对高温环境具有较好的抗逆性，其中Defluviitoga可将大部分多糖类物质当做电子受体，并降解为醋酸盐、H2和CO2，提高了水解酸化效率，使厌氧消化反应周期缩短12%，同时高温环境减少了病原体的产生。中高温厌氧消化产甲烷优势菌群也存在较大差异，且分别属于不同的功能性产甲烷菌。
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图 2 中高温厌氧消化常规参数对比
Figure 2. Comparison of conventional parameters of medium and high temperature anaerobic digestion
图 3 中高温细菌样本群落热图
Figure 3. Heat map of bacterial community in medium and high temperature samples
图 4 中温（左）和高温（右）温厌氧消化细菌菌群相对丰度柱形图
Figure 4. Histogram of relative abundance of bacterial flora in anaerobic digestion at medium (left) and high (right) temperatures
图 5 中高温细菌群落功能预测
Figure 5. Prediction of bacterial community function at medium and high temperatures
图 6 中高温厌氧消化古菌菌群相对丰度
Figure 6. Histogram of relative abundance of archaea in mid-high temperature anaerobic digestion
图 7 中高温古菌群落功能预测
Figure 7. Prediction of archaea community function at medium and high temperatures
表 1 鸡粪与接种污泥的性质
Table 1. Properties of chicken manure and inoculated sludge
% 实验材料 TS VS pH C N 粗蛋白 粗脂肪 粗纤维 钙 鸡粪 27.29 23.33 − 46.07 4.73 22.34 2.44 10.72 10.00 接种污泥 18.12 8.36 6.41 − − − − − −
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表 2 中高温厌氧消化水解酸化细菌α多样性变化
Table 2. Changes in the α diversity of acidified bacteria during mid-high temperature anaerobic digestion
组数 物种数/个 均匀度指数 多样性指数 生物覆盖率 Shannon Simpson Chao1 ACE M1 1593 6.432 0.934 1816.911 1898.458 0.993 M2 1742 7.819 0.987 1946.074 2056.014 0.993 M3 1293 7.341 0.984 1460.754 1564.026 0.994 M4 1848 7.876 0.983 2075.346 2171.558 0.992 M5 1758 7.461 0.970 2013.739 2124.699 0.992 M6 1857 7.474 0.968 2108.730 2193.657 0.992 M7 1756 6.936 0.962 2059.034 2163.817 0.991 M8 1869 7.331 0.973 2125.733 2238.300 0.992 H1 2245 8.053 0.979 2538.160 2607.659 0.991 H2 2056 7.666 0.980 2365.965 2487.267 0.990 H3 1921 7.275 0.976 2232.204 02382.96 0.990 H4 2391 8.597 0.991 2650.590 2772.402 0.990 H5 1897 6.837 0.961 2194.613 2335.348 0.990 H6 1615 7.161 0.978 1880.154 2005.092 0.992 H7 1769 6.784 0.898 1964.061 2037.415 0.992 H8 1634 6.802 0.968 1905.350 2043.547 0.991
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表 3 中高温厌氧消化产甲烷古菌α多样性变化
Table 3. Variation of alpha diversity of methanogenic archaea during mid-high temperature anaerobic digestion
组数 物种数/个 均匀度指数 多样性指数 生物覆盖率 Shannon Simpson Chao1 ACE M1 533 4.109 0.822 602.843 620.164 0.998 M2 584 5.413 0.946 631.616 644.214 0.999 M3 544 5.315 0.947 602.235 611.049 0.999 M4 514 5.456 0.951 569.836 573.337 0.999 M5 624 5.742 0.962 669.764 685.770 0.999 M6 316 4.421 0.854 341.161 339.959 0.999 M7 191 3.617 0.812 217.400 218.061 1.000 M8 189 3.780 0.847 204.750 209.107 1.000 H1 446 5.027 0.932 497.679 528.585 0.999 H2 553 5.184 0.939 613.061 633.953 0.998 H3 483 5.244 0.946 516.514 527.499 0.999 H4 664 5.414 0.943 758.897 757.104 0.998 H5 530 5.322 0.941 587.554 588.961 0.999 H6 276 2.899 0.681 298.000 308.641 0.999 H7 162 2.984 0.786 193.231 183.107 1.000 H8 191 3.153 0.805 204.034 211.344 1.000
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