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党的十九大提出了2035年“生态环境根本好转，美丽中国目标基本实现”的奋斗目标。2019年9月18日，习近平总书记在黄河流域生态保护和高质量发展座谈会强调，黄河流域生态保护和高质量发展是重大国家战略。水是黄河流域高质量发展的重要生态要素之一，水生态环境好坏直接关系到美丽中国和高质量发展能否实现。系统总结黄河流域水生态环境保护成效，分析存在的问题及成因，借鉴国外治理经验，提出黄河流域水生态环境保护对策建议具有重要现实意义。
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党中央历来重视黄河流域水生态环境保护，自“十一五”起编制实施了3期流域水污染防治规划；“十三五”期间实施《水污染防治行动计划》、碧水保卫战等，各地大力推进水环境质量达标、黑臭水体整治等行动，取得了一系列成效。
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《中国环境状况公报》2006～2020年显示，黄河流域Ⅰ～Ⅲ类断面比例由2006年的50%升至84.7%，增加了34.7个百分点，劣V类断面比例由2006年的25%降至0，下降25个百分点，水质状况由中度污染改善为良好，主要污染指标为氨氮和COD；高锰酸盐指数、生化需氧量、氨氮、COD和总磷浓度相比2006年，分别降低67.8%、77.5%、93.0%、61.8%和62.8%，见图1。
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针对不同时期黄河流域的突出问题，采取了不同的治理措施。“十一五”黄河中上游流域优先解决集中式饮用水水源地、跨省界水体、城市重点水体等突出环境问题，以饮用水水源地保护、工业污染治理、城市污染控制、湖库污染治理为主要任务，安排工业污染防治、城镇污水处理设施建设、重点区域污染防治共528个项目以落实规划任务。“十二五”突出黄河干流兰州、银川、石嘴山、包头段环境风险防范，以湟水、乌梁素海、大黑河、汾河、渭河、伊洛河6条支流和西宁、兰州、三门峡等14个城市的水污染防治为重点，安排工业污染防治、饮用水源地污染防治、区域水环境综合整治等5类725个项目，提升流域综合治污水平。“十三五”除传统的水污染治理任务外，提出在黄河流域分期分批确定生态流量（水位），维持河湖基本生态用水需求，水污染防治从单纯的治污向水环境、水资源、水生态统筹转变。
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借鉴美国、欧洲等流域分区管理的做法，黄河中上游流域“十一五”时期分为黄河干流水质改善区、渭河污染控制区、汾河污染控制区3个区域提出保护目标和治理措施。“十二五”以流域—控制区—控制单元三级分区体系为框架，将黄河中上游划分为47个控制单元，对于水环境问题突出、环境风险防范能力薄弱、水体功能高、经济社会发展压力大的16个优先控制单元，按照水质维护型、水质改善型、风险防范型3种实施分类指导[1]。“十三五”实施流域、水生态控制区、水环境控制单元三级分区分级分类管理，将黄河流域划分为150个控制单元，按照水环境质量“只能更好，不能变坏”的原则，明确了115个控制单元自2016年起断面水质不下降；考虑水环境问题严重性、水生态环境重要性、水资源禀赋、人口和工业聚集度等因素，将150个控制单元分为50个优先控制单元和100个一般控制单元，结合地方水环境管理需求，50个优先控制单元又进一步细分为23个水质改善型和27个防止退化型单元，分区管理体系逐渐精细化。
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新中国成立以来，黄河治理的体制机制逐渐完善。自《黄河可供水量分配方案》实施以来，通过平衡与分配河道内生态环境用水和河道外经济社会用水，控制断面预警流量和入黄断面最小流量，实现了黄河干流不断流，改善了河流生态系统功能和水环境质量。依据《深化党和国家机构改革方案》，组建了黄河流域生态环境监督管理局，提升了黄河流域生态环境监管能力。水功能区、排污口监管等职能划归生态环境部，黄河流域水功能区与“十四五”国控断面实现了衔接整合，入河排污口排查有序开展。财政部、生态环境部、水利部和国家林草局研究制定了《支持引导黄河全流域建立横向生态补偿机制试点实施方案》，以持续改善流域生态环境质量和推进水资源节约集约利用为核心，逐步建立黄河流域生态补偿机制，建立健全生态产品价值实现机制。
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锚定2035年美丽中国目标，结合重点流域水生态环境保护“十四五”规划提出的“有河有水、有鱼有草、人水和谐”的目标[2]，黄河流域水生态环境保护仍然存在差距。
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《生态环境部通报11月和1～11月全国地表水、环境空气质量状况》显示，2021年1～11月黄河流域劣V类断面比例最高。根据《2021全国地表水水质月报》，11月份黄河流域仍有1.6%的劣V类断面，四道沙河、皇甫川、马莲河重度污染，大黑河、涑水河等为中度污染，汾河、浍河、葫芦河等支流轻度污染，东平湖轻度富营养；66个省界断面中劣V类占1.5%，其中陕甘马莲河黑城岔断面污染较重。
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与第一次全国污染源普查结果相比，黄河流域单位地表水资源COD排放强度增加了10%[3]。分析2015年环境统计数据，陕西、山西是主要排放区域，两省COD和氨氮排放量分别占总排放量的38.5%和43.5%。农业源是COD排放的主要来源，占44.06%，主要来自中游地区，水污染物排放量和畜禽养殖量均占流域总量的40%[3]左右，农田退水、农膜、畜禽粪便等农业面源污染导致部分地区水环境质量出现反弹或恶化。生活源是氨氮排放的主要来源，占59.6%，主要来自中下游，河南、陕西、山西、山东生活污水排放量占整个流域城镇生活污水排放的74.86%[4]。根据2015年环境统计数据分析，化学原料和化学制品制造业是主要排污行业，COD和氨氮排放量分别占总排放量的20.1%和24.1%，见图2和图3。
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根据2007～2021年《中国水资源公报》数据分析，黄河流域水资源总量占全国的1.9%～3.2%，占长江的5%～9.4%。人均水资源量仅有473 m3，约为全国的23%，水资源实际开发利用率远超一般流域40%的生态警戒线，已达86%。黄河流域综合规划及部分支流综合规划确定了全年生态水量目标的21个断面中，2008～2018年生态水量达标比例高于75%的断面仅有5个，窟野河、汾河、沁河、石川河等众多重要支流在非汛期断流。
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《中国水资源公报》数据显示，黄河流域农业用水占比由2006年的73.8%降至2020年的66.9%，但仍超过2/3，见图4。约为全国平均水平的1.08倍，长江流域的1.33倍。2019年黄河农田灌溉取水量304.06亿m3，占地表水取水量的68.8%，宁夏、内蒙古等灌区大引大排导致的水资源浪费问题突出。黄河干流甘肃白银，宁夏中卫，内蒙古包头、乌海、阿拉善盟、巴彦淖尔，山东东营段，汾河山西临汾，沁河河南焦作市、济源地表水超载。2021年4月中央生态环境保护督察集中通报典型案例中河南郑州、开封大量人工造湖，山西晋中违规取水、超量取水等进一步加剧了水资源紧张。
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黄河流域产业结构以第二产业为主，1978～2018年流域内地区生产总值年均增长率10.76%，但经济增长效率仅增加了2倍，年均增长率不到2%[5]。目前宁夏、陕西、内蒙古等现代煤化工行业用水量偏高，占黄河工业用水的比例达9%～18%；煤电产业用水量更大，约占黄河工业用水总量的25%[6]。据2015年环境统计数据分析，黄河流域工业用水重复利用率不到60%，其中甘肃省工业用水重复利用率仅为33.9%。根据《2019年城市建设统计年鉴》数据分析，太原、兰州、西安、吴忠市政再生水利用率不足20%。
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黄河源区湿地面积占流域湿地总面积的40.9%，具有水源涵养、生物多样性保护等重要生态功能。根据文献[7]研究，2007年与1996年和1986年相比，流域湿地面积总体上呈萎缩趋势，分别减少了10.2%和15.8%，其中源区湿地减少最多。若尔盖草原湿地生态功能区出现草场退化沙化，退化沙化面积占可利用草原面积的43%，上游地区天然草地生态功能退化率在60%～90%。
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黄河干流鱼类资源由20世纪80年代的125种减少到2007年的47种[8]。潘保柱[9]、张军燕[10]、洪欢[11]等不同年份对黄河源区不同河段的大型底栖动物、浮游植物、鱼类等的研究也表明水生生物多样性较低。冯慧娟[12]、冯慧[13]、谢元[14]、张芮[15]等分别对黄河上中下游、支流及河口地区的鱼类、底栖动物等的研究表明鱼类种类呈衰退趋势，底栖动物种类较少。
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文献[16]统计，黄河流域风险企业占比约9%，煤炭采选、煤化工等高耗水、高污染企业多，其中煤化工企业占全国总量的80%，且大多沿河分布；黄河干流及支流重点断面与风险企业交织分布，1 km范围内共有1 800多个风险源。
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我国煤炭产能主要集中在黄河流域中上游地区，据《中国能源统计年鉴》2019，2017年黄河流域中上游地区煤炭产量约28 亿吨，占全国煤炭产量的78%，14个亿吨级大型煤炭基地，有7个分布在黄河流域中上游，其中陕甘地区煤化工企业较多，各类化学品生产、运输及使用频次高、密度大，2006～2019年在生态环境主管部门调度处理的水污染事件共773起，其中黄河流域112起[16]。
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墨累—达令河流域、以色列、莱茵河流域曾经面临用水矛盾突出、农业用水比例高、跨流域协同治理难度大等问题，通过政策机制等措施取得了积极成效，这些为黄河流域水生态环境保护提供了有益参考。
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墨累—达令河流域水资源短缺，多年平均天然径流量为316亿m3、经济社会发展用水量占全国的75%，用水矛盾突出，与黄河流域水资源禀赋与经济社会发展矛盾突出具有极大相似性。在流域管理中特别重视基于河流健康、生物多样性保护、湿地保护等生态系统的流域综合管理。采用河流状况指数对河流水生态状况进行评估，从水文、河流自然形态、岸边带、水质和水域生物5个方面进行评估，每一方面又划分为若干参数，最高分为10分，为最理想状态，总积分为50分。为保障河道生态用水，制定了《全流域生态用水战略》，以重点保护河流连通性、植被、水鸟和鱼类为生态目标对生态环境用水进行规划管理[17]；2012年实施了《墨累—达令流域规划》，通过生态用水需求分析和综合效益评估，以经济、社会和生态环境协同发展为目标，确定了29个地表水分区和80个地下水分区的长期平均可持续分水限额，并作为流域水资源利用总量控制指标；同时规定每年将27.5亿m3的流量还给生态系统，并从2014年起开展了为期5年涵盖生态系统、植被、河流和鱼类等指标的流量监测。
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以色列淡水资源极度匮乏，2018年人均淡水资源量约为150 m3，不足黄河流域的1/3，农业是以色列第一用水大户，农业用水占比由1990年的67%降低至2016年的57%，水资源禀赋差，农业用水占比高与黄河流域具有极大相似性。以色列农业节水主要采取的举措：一是农业种植结构调整，用单位用水效益高的作物逐渐替代效益低的作物，开展节水抗旱品种培育、发展滴灌；二是配合分级水价，实行农业用水配额管理，即水资源归国家所有，必须专门用于满足居民需要及国家发展需要，以色列水利委员会负责全国水资源的管理，每年将一定比例的用水配额分配给农业生产者。目前农业用水配额为11.5亿m3/a，2008年起以色列不同农场的农业用水配额可相互转让，出让额度不能超过其用水配额的30%，受让方的用水总量不能超过其配额；农业用水配额50%以内的基本水价约3.8元/m3，用水量在配额的50%～80%、80%～100%范围水价进一步提高，用水量超过用水配额后水价为基本水价的2～3倍，并有可能减少供水。三是重视再生水利用，以用定质制定再生水标准。以色列通过《国家污染水再利用工程》计划，将城市生活、农业、工业等污水回收再利用，92%的生活污水处理后再利用，绝大部分用于农田灌溉，少部分用于补充河道流量，再生水利用从1990年的1.59亿m3增加到2016年的5.06亿m3，年均增速4.6%，2016年再生水利用量占到23%。以色列用于灌溉的再生水分为两类，第一类是污水二级处理后的再生水，用于经济作物（如棉花和饲料作物）、在阳光下干燥至少60 d的作物（如玉米和小麦）及果树灌溉；第二类是污水三级处理后的再生水，可以不受限制地灌溉食用作物。2010年以色列提出全部实现不受限制的灌溉农作物的再生水目标，并提出了应用于灌溉和河流生态修复的再生水水质标准。
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莱茵河流经欧洲多个国家，曾经因为污染被称为欧洲公共厕所，通过跨流域协同治理，实现了流域生态环境的改善，跨行政辖区的生态环境治理与黄河流域生态环境监管具有极高的相似性。莱茵河流域1950年成立了保护莱茵河国际委员会，建立了政府间、政府与非政府、专家学者与专业团队多层次、多元化协调与合作机制；设置由政府组织和非政府组织参加的观察员小组、技术和专业协调工作组，将治理、环保、防洪和发展统筹考虑，监督各国实施莱茵河保护措施。签署了一系列莱茵河流域治理协议，如控制化学污染公约、控制氯化物污染公约。建立了莱茵河监测网络、水质预警系统和信息互通平台，在莱茵河及其支流从瑞士至荷兰共设有57个监测站点及水质预警系统，在瑞士、法国、德国和荷兰设置7个警报中心，通过连续生物监测和水质实时在线监测，及时对短期和突发性的环境污染事故进行预警，迅速确认污染物来源，并发布警报，防止突发水污染事故。
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基于以上对国际实践的总结，结合黄河流域水生态环境保护现状与问题，提出如下建议。
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国外如墨累达令河大多数已经建立了以水生态为核心的管理体系，而黄河流域刚开始从理化指标改善向水生态转变。两个流域地理和行政区跨度大，以农业用水为主，水资源利用矛盾突出，具有极大的相似性，为此应充分借鉴墨累—达令河流域等以水生态系统为核心的理念，结合黄河流域水生态环境特点，构建水环境、水资源、水生态、水风险“四水”统筹的管理制度，以黄河流域水生态环境全面整体性保护为目标，构建“一干（黄河干流）两区（黄河源区、黄河三角洲）三湖（乌梁素海、红碱淖、东平湖）十廊（湟水、洮河、窟野河、无定河、延河、汾河、渭河、沁河、伊洛河、大汶河）”水生态环境保护空间格局。目标上，应客观分析水生态环境现状与人民群众需求之间的差距，注重目标的合理性和可达性，建立体现黄河特色的“四水”目标指标体系和评价方法，做到可监测、可评价、可考核。任务措施上，应系统全面分析面临的突出水生态环境问题及成因，考虑黄河上中下游“四水”特征，制定行之有效的措施，确保任务措施对“四水”目标指标的全面支撑。战略路径上，应综合考虑“四水”的现状和工作基础，按照轻重缓急分步分类推进，对水资源、水生态等基础薄弱的应先摸清底数，试点后全面推进。
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黄河流域要抓住水环境质量改善的重点领域，编制实施黄河流域水环境质量改善行动，明确黄河流域水环境治理目标、任务、重点工程和实施机制。要开展农业面源等重点问题、中下游等重点区域和煤化工等重点行业环境污染治理集中攻坚，实施汾河、涑水河、窟野河、都思兔河、马莲河等污染严重水体消劣达标行动；重点实施城镇污水、农田退水治理，推进湟水、甘肃沿黄、宁蒙、汾渭等大中型灌区农田退水污染综合治理；因地制宜持续推进西宁、渭南等城镇雨水、污水收集管网改造和建设，补齐污水处理短板，加快城镇污水处理厂提标改造，提升中上游城市群污水处理能力。
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黄河流域农业用水占比高，用水效率低，要参考以色列农业结构调整举措，在保障粮食安全的前提下，合理调整种植结构和布局，扩大单位用水效益高、低耗水、高耐旱作物比例。以宁蒙灌区、河套灌区、引黄灌区等为重点，分区域推进滴灌等高效节水灌溉。推进黄河流域农业用水计量全覆盖，制定科学的灌水定额和灌溉制度。逐步建立体现水资源稀缺性， 以用定质、以质定价的农业用水价格机制，倒逼农业节水。
区域再生水循环利用可有效缓解水资源供需矛盾。要结合黄河上中下游特点，上游重点针对内蒙古和宁夏两大引黄灌区，再生水优先考虑用于周边农业生产、生态用水。中游汾河流域等地区水质污染问题突出，再生水优先考虑回用于河道生态补水。下游大汶河等支流生态水量不足，再生水优先补给生产生活用水需求。参考以色列再生水标准制定情况，根据上中下游不同的再生水用途和用水户，确定再生水水质标准，实现再生水以用定质，低水低用、高水高用。
黄河流域产业结构以粗放式开发为主，应严控水资源消耗总量、严守水生态保护红线、发挥水环境承载能力刚性约束作用，改变传统生产模式，严格限制缺水和水资源超载地区高耗水产业规模。选取水资源严重短缺、水资源开发利用价值高、水资源重复利用率低的区域，实施水资源节约试点示范。加快中游区域产业结构转型，合理控制煤炭产业规模，适度发展新型煤化工产业，促进经济发展绿色转型。
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黄河流域水生态基础比较薄弱，要从水生态系统整体性出发，坚持生态优先、自然恢复，分类实施黄河流域生态环境保护修复。清理整治三江源、甘南、若尔盖、祁连山等水源涵养区侵占河湖生态空间的各类行为，系统开展河源区生态保护与修复。开展黄河宁蒙、中下游河段及大通河、渭河、无定河、伊洛河等重点支流天然湿地，乌梁素海、红碱淖等重要湖泊水生态系统，黄河干流及大通河、洮河、伊洛河等重要支流珍稀濒危和土著鱼类栖息地的保护和修复。
借鉴墨累—达令流域以生态系统为目标综合考虑生态用水的经验，针对黄河流域不同河湖，强化生态用水和水生态保护目标之间的对应关系，优先开展黄河干流、渭河等重要支流，湟水、大通河、洮河、伊洛河、沁河等水电开发集中河流水生态基础调查评估，以水质达标和维护重要物种、种群等生物多样性和河流生态系统完整性保护为目的，制定量化的、差异性的、可操作的生态流量目标。同时依托卫星遥感、大数据等手段对生态流量实施跟踪监测，建立体现黄河流域特色的生态流量监测体系。
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黄河流域地跨9个行政辖区，涉及生态环境、水利、自然资源等多个部门，长期以来统分结合、整体联动的工作机制尚不健全，参考莱茵河流域的多层次、多元化协调合作机制，建立跨区域、多部门的协同治理机制。在国家层面，健全黄河流域生态环境保护协调机制，建立由国家相关部门、沿黄9省（自治区）共同参加的黄河生态环境保护统一协调监管机制，统筹流域国土空间开发保护、水资源利用与管理、生态环境风险防范等。在流域尺度上建立行政区间协调机制，强化在水电开发、水利工程建设、水资源分配等方面的生态环境统一监管，推进黄河上下游、左右岸协同治理，统筹社会经济和生态环境协调发展。在省级层面完善跨行政区域上下游联动机制，充分发挥黄河流域生态环境监督管理局的作用，着重在联合执法、应急联动、信息共享等方面健全跨区域、流域水生态环境保护议事协调机制。
黄河流域水生态环境保护促进高质量发展的战略研究
Strategy promoting high-quality development through water ecological environment protection in the Yellow River Basin
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摘要: 文章总结了黄河流域水生态环境保护取得的成效，分析了在水环境、水资源、水生态、水风险方面存在的问题；梳理了墨累—达令河流域、以色列、莱茵河流域等国际实践，对黄河流域水生态环境保护提出了推进“四水”统筹、持续改善水环境质量、转变高耗水方式、推进水生态系统保护修复、强化协同治理等建议，以期通过高水平保护促进黄河流域高质量发展。Abstract: This paper systematically summarized the achievements of water ecological environmental protection in the Yellow River Basin, analyzed the existing problems in water environment, water resources, water ecology and water risks. Some international practices in the Murray-Darling River Basin, Israel and the Rhine River Basin were analyzed. Suggestions were put forward such as promoting the overall planning of the "four waters", continuously improving the water environment quality, changing the high water consumption mode, promoting the protection and restoration of the water ecosystem, and strengthening the collaborative governance to promote the high-quality development of the Yellow River Basin through a high-level protection.
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羟基化多溴联苯醚（OH-PBDEs）是一类与母体多溴联苯醚（PBDEs）结构类似的化合物，由于其具有较强的内分泌干扰效应，因而受到了广泛的关注[1-3]. 研究表明，OH-PBDEs能够通过酶或者金属氧化物介导的氧化耦合反应发生转化[4-7]. 其中，由于酶介导氧化耦合反应能够生成土壤有机质等，因此在自然腐殖化过程中扮演者重要的角色[6, 8]. 在众多氧化酶中，漆酶是一组结合了多个铜原子的内源性多酚氧化酶，由多种真菌以及高等植物以胞外分泌物的形式产出，广泛存在于自然界中，因此漆酶介导的氧化耦合反应过程对有机污染物在环境中的迁移、转化过程起着重要的作用[6, 9].
漆酶作为氧化还原酶，可以直接氧化酚类污染物. 但是由于自身氧化还原电位较低（通常在0.5—0.8 V），导致其对于氧化还原电位高的物质氧化效果不够理想[10]. 例如，仅仅依靠反应体系中单一的漆酶无法完成木质素、多环芳烃等大分子的转化过程[11]. 研究发现一些小分子化合物可以充当介体，使得漆酶在介体的辅助作用下，通过介导电子的转移过程，生成具有较高氧化还原电位的活性物种，进而实现对其他非酚类物质的高效催化氧化[11-12]. 目前，常用的介体主要是人工合成介体，如2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1-羟基苯并三唑（HBT）、紫尿酸（VIO）、N-羟基-N-乙酰基-苯胺（NHA）等，其中ABTS是目前应用最广泛的介体[13-14]. 而漆酶与这些介体构成的系统成为漆酶-介体系统（laccase-mediator-system, LMS ），能够实现高效、快速的降解高氧化还原电位或不能进入漆酶活性中心的底物分子[11].
尽管对漆酶催化转化酚类化合物的动力学过程已经有了较好认识，但是这些认识主要集中在单一酶催化体系[9, 15]. 例如，已有研究报道了四溴双酚A、三氯生、对氨基苯酚、雌激素等微污染物在单一漆酶作用体系下的转化动力学过程[9, 15-17]. 然而，在实际环境中，无论是人工合成的介体还是天然的介体都将与漆酶形成LMS[11]. 此外，其他共存物质，如天然有机质，也将不可避免参与这些污染物的转化过程[18-19]. 因此，探究污染物在LMS中的动力学过程对认识其在真实自然环境下的转化过程十分重要. 然而，目前关于这一方面的仍然较为缺乏.
本研究选取3-OH-BDE-7为典型的OH-PBDEs，系统探究了3-OH-BDE-7在基于ABTS的LMS中的转化动力学过程，考察了ABTS投加量、漆酶投加量、pH值和温度对LMS介导3-OH-BDE-7转化过程的影响. 此外，还探究了天然有机质（natural organic matter, NOM）对LMS介导3-OH-BDE-7转化动力学过程的影响，并揭示了NOM抑制LMS转化3-OH-BDE-7的内在机制. 研究结果不仅对认识羟基化多溴联苯醚在自然环境中的转化过程具有重要意义，而且为合理设计基于LMS的废水处理工艺具有重要参考价值.
1. 实验部分（Experimental section）
1.1 材料与试剂
漆酶（Laccase，分离自Trametes versicolor）、2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS，纯度＞98%）、3-OH-BDE-7（纯度＞97%）购自美国Sigma-Aldrich公司. Suwannee天然有机质（natural organic matter，NOM购自国际腐殖质协会（IHSS）. 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自南京化学试剂有限公司. 有机试剂（甲醇、乙酸）均为色谱纯，购自Tedia公司. 其他实验室常用试剂为分析纯. 实验所用水均来自Milli-Q纯化系统的去离子水（18.25 MΩ·cm）.
1.2 漆酶活性的测定
漆酶的酶活性通过ABTS法测定[9]. 其中1个漆酶酶活性单位（U）定义为每分钟催化氧化1 μmol ABTS所需要的漆酶酶量. 具体测定反应体系如下：2.8 mL醋酸钠缓冲溶液（10 mmol·L−1，pH = 5.0）. 1 mL ABTS （20 mmol·L−1）溶液，以及0.1 mL稀释的漆酶储备溶液，反应启动后，通过紫外分光光度计（Cary 100，Varian，USA）监测溶液在420 nm的吸光度在3 min内随时间的变化，重复3次，取其斜率k的平均值。酶活性通过公式（1）计算可得[20].
漆酶酶活性(U⋅mL−1)=k(cm−1⋅min−1)×30/36((mmol⋅L−1)−1⋅min−1) (1) 1.3 LMS系统对3-OH-BDE-7的降解实验
LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的反应在8 mL玻璃反应管中进行. 反应体系设置如下：反应体系总体积为2.0 mL，其中3-OH-BDE-7的浓度为2.0 μmol·L−1，初始漆酶活性设置为0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U·mL−1，ABTS的浓度分别设定为0、1.0、1.5、2.0、4.0 μmol·L−1. 反应溶液为10 mmol·L−1的磷酸钠缓冲溶液（pH=6.0）. 反应管置于恒温振荡培养箱中（转速为150 r·min−1），在不同的反应时间点（0、1、5、10、20、30、60 min）下将反应管从培养箱中取出，并向其中加入2 mL的甲醇终止反应. 取1 mL的反应液置于离心机进行离心，离心条件设置为：转速20000 r·min−1，离心时间10 min. 离心后，取上清液置于棕色液相小瓶中，用高效液相色谱分析测定上清液中剩余的3-OH-BDE-7浓度. 每个实验样品至少设置3个重复.
为探究溶液pH值和温度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响，使用同样的反应装置进行实验. 实验条件设置为：反应体系总体积为2 mL，其中3-OH-BDE-7的浓度为2.0 μmol·L−1，初始漆酶活性为0.1 U·mL−1，ABTS的浓度为2.0 μmol·L−1. 溶液pH设置为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0. 反应温度控制在25 ℃，反应时间为60 min. 对于温度的影响，实验条件设置为：反应体系总体积为2 mL，其中3-OH-BDE-7的浓度为2 μmol·L−1，初始漆酶活性为0.1 U·mL−1，ABTS的浓度为2.0 μmol·L−1，溶液pH控制在6.0，反应温度控制在4、10、25、35、45、55、65 ℃，反应时间为60 min. 反应结束后，按照以上步骤取样，并用高效液相色谱分析测定测定溶液中剩余的3-OH-BDE-7浓度. 每个实验样品至少设置3个重复.
为探究NOM对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响，使用同样的反应装置进行实验. 实验条件设置为：反应体系总体积为2 mL，其中3-OH-BDE-7的浓度为2.0 μmol·L−1，初始漆酶活性为0.1 U·mL−1，ABTS的浓度为2.0 μmol·L−1，NOM的浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg·L−1，溶液pH设置为6.0，温度控制在25 ℃. 在不同的反应时间点（0、1、5、10、20、30、60 min）下将反应管从培养箱中取出，按照以上步骤取样，并用高效液相色谱分析测定溶液中剩余3-OH-BDE-7的浓度. 每个实验样品至少设置3个重复.
1.4 分析方法
安捷伦高效液相色谱仪（HPLC，Agilent 1200）用以分离及定量检测溶液中3-OH-BDE-7的浓度. 具体分析测定条件如下：流动相为甲醇-水（85∶15，V∶V），流速设定为1 mL·min−1；Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4 mm, 5 μm） （安捷伦，美国）；检测器为可变波长扫描紫外检测器（VWD），检测波长为230 nm，进样量设置为20 μL，柱温为25 ℃. 降解产物的液相色谱-质谱联用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC/MS）分析条件：采用 Thermo LCQ 质谱检测器（Quest LCQ Duo, USA），通过XDB C18色谱柱（150 mm×4.6 mm, 5 µm）进行分离. 流动相组成为甲醇和水（85∶15，V∶V），流速设置为0.2 mL·min−1，进样量为10 µL. ESI源参数设置为：毛细管和锥管电压分别设置为4.5 kV和25 V，去溶剂和离子源温度设置为300 ℃ 和 120 ℃. N2作为雾化气和辅助气，流速分别为350 L·h−1和50 L·h−1.
2. 结果与讨论 （Results and discussion）
2.1 ABTS促进漆酶催化氧化3-OH-BDE-7
首先探究3-OH-BDE-7在只有漆酶存在下的降解过程，结果如图1A所示. 从图1可以看出，漆酶能够转化3-OH-BDE-7，且随着漆酶投加量的增加，3-OH-BDE-7的去除率也不断增加. 但是，即使当漆酶浓度增加到0.5 U·mL−1时，去除率依然只有~40%。此外，当漆酶含量从0.4 U·mL−1增加到0.5 U·mL−1时，反应60 min后，3-OH-BDE-7的去除率只增加了2%左右. 这可能是由于漆酶自身氧化还原电位较低（通常在0.5—0.8V），导致其对于3-OH-BDE-7氧化效果较差[10]. 3-OH-BDE-7在介体ABTS存在下的降解动力学如图1A所示，在只有漆酶（0.1 U·mL−1）的反应体系中，反应60 min后，只有8.5%的 3-OH-BDE-7被去除. 而加入介体ABTS （2 μmol·L−1）后，3-OH-BDE-7的去除速率显著提高. 例如，反应30 min后，62.5%的3-OH-BDE-7被去除，而反应60 min后，3-OH-BDE-7去除率高达84.7%. 值得注意的是，在只含有介体ABTS的条件下，3-OH-BDE-7几乎不会被去除. 以上研究结果表明介体ABTS能够显著促进漆酶催化氧化3-OH-BDE-7.
图 1 （A）3-OH-BDE-7在不同浓度漆酶（无ABTS)下的去除率；（B）3-OH-BDE-7在不同反应条件下（只有ABTS、只有漆酶和漆酶+ABTS)的去除率；（C）漆酶在有无ABTS介体条件下催化氧化3-OH-BDE-7的假一级动力学拟合曲线实验条件：[Laccase]0=0.1 U·mL−1、[ABTS]=2.0 μmol·L−1Figure 1. （A）The removal of 3-OH-BDE-7 mediated by Laccase with different dosage； （B）3-OH-BDE-7 removal efficiencies at various reaction conditions （only ABTS, only Laccase and Laccase-ABTS)； （C）Pseudo first-order rate plots for 3-OH-BDE-7 removal mediated by Laccase with and without the presence of ABTS Experimental condition: [Laccase]0=0.1 U·mL−1, [ABTS]=2.0 μmol·L−1此外，从图1A发现，随着反应的进行，溶液中的3-OH-BDE-7的浓度持续降低. 根据公式（2），以ln（C0/Ct）对反应时间作图，如图1B所示. 结果发现，无论是否存在ABTS，都呈线性关系，这说明3-OH-BDE-7的去除过程符合假一级反应动力学规律，之前的研究也发现了类似的酶催化反应的特征[9].
lnC0Ct=kobst (2) 式中，kobs为表观一级反应动力学常数，C0为底物起始浓度，Ct为反应t时刻后溶液中剩余的底物浓度，t为反应时间. 通过计算可知，只有漆酶存在的条件下，假一级动力学常数为0.0016 min−1；加入ABTS后，假一级动力学常数为0.0318 min−1. 因此，加入ABTS的漆酶体系催化氧化3-OH-BDE-7的速率约是单纯漆酶体系下的20倍.
ABTS促进漆酶催化氧化3-OH-BDE-7的作用机理如图2所示. 在只有漆酶的反应体系下，漆酶与氧气反应后形成氧化态漆酶，然后氧化态漆酶再对底物进行氧化. 而在介体存在情况下，介体首先被漆酶氧化形成活性高且具有一定稳定性的氧化态介体，氧化态介体再作为氧化剂去氧化底物. 因此，在本研究中，漆酶-ABTS介体系统催化氧化3-OH-BDE-7的机制为：ABTS优先于3-OH-BDE-7迅速与漆酶发生反应，产生ABTS+和ABTS++，然后ABTS+和ABTS++再高效催化氧化3-OH-BDE-7，与此同时自身被还原为ABTS[14].
图 2 漆酶直接（A）和间接（B）催化氧化反应示意图Figure 2. Schematic diagram of direct and indirect catalytic oxidation reaction by laccase2.2 ABTS浓度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响
为进一步明确ABTS在反应体系中的作用，本文探究了不同浓度ABTS对漆酶催化氧化3OH-BDE-7的影响. 如图3A所示，随着ABTS投加量的增加，3-OH-BDE-7的去除率不断增加. 例如，当ABTS投加量为1 μmol·L−1时，反应60 min后，3-OH-BDE-7的去除率为46%；而当ABTS投加量增加到4 μmol·L−1时，反应60 min后，3-OH-BDE-7的去除率为高达97%. 尽管研究结果已经证明了ABTS能够显著促进漆酶催化氧化3-OH-BDE-7，但是仍然有必要定量评估3-OH-BDE-7在漆酶-ATBS介体系统下的去除动力学过程. 从图3B可以看出，3-OH-BDE-7的去除过程在不同ABTS投加量的条件下依然符合假一级动力学规律. 通常情况下，根据假一级动力学规律，在酶浓度一定的情况下，3-OH-BDE-7的反应速率仅和其自身浓度相关，而与溶液中的酶浓度无关，这符合酶作为催化剂的规律，同时也证明了酶活性在反应过程中保持稳定[15]. 但是在漆酶-介体系统下，3-OH-BDE-7的降解过程依然符合这一规律，这说明ABTS的加入并不改变酶催化氧化3-OH-BDE-7的特征规律. 此外，本文进一步分析了kobs与ABTS浓度之间的相关关系，结果如图2C所示. 在漆酶浓度固定的条件下，kobs与ABTS浓度之间具有较好的正相关关系. 考虑到漆酶-ABTS介体系统介导3-OH-BDE-7氧化的速率远远高于漆酶单独氧化3-OH-BDE-7的速率（图1）， 因此推测在ABTS存在下，漆酶-ABTS组成了新的催化活性中心，即ABTS将优先与漆酶发生反应产生ABTS+和ABTS++，然后ABTS+和ABTS++再介导3-OH-BDE-7的转化过程.
图 3 （A）ABTS投加浓度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响。（B）LMS在不同ABTS投加量条件下催化氧化3-OH-BDE-7的假一级动力学拟合曲线。（C）假一级动力学常数与ABTS投加量之间的关系Figure 3. （A）Influence of ABTS dosage on the removal of 3-OH-BDE-7. （B）Pseudo first-order rate plots for 3-OH-BDE-7 removal at different ABTS dosages. （C）Relationship between pseudo first-order rate constants and ABTS dosage2.3 漆酶投加量对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响
为了验证以上推测，本文进一步探究了在ABTS投加量固定的情况下，漆酶投加量对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响. 从图4A可以看出，在ABTS固定的情况下，随着漆酶投加量的增加，3-OH-BDE-7的去除率逐渐增加. 例如，当漆酶浓度为0.02 U·mL−1时，kobs为0.006 min−1；而当漆酶浓度增加到0.5 U·mL−1时，kobs增加到0.040 min−1. 此外，3-OH-BDE-7的去除过程仍然符合假一级动力学规律，这也验证了之前的推测.
图 4 （A）LMS在不同漆酶投加量条件下催化氧化3-OH-BDE-7的假一级动力学拟合曲线；（B）假一级动力学常数与漆酶投加量之间的关系Figure 4. （A）Pseudo first-order rate plots for 3-OH-BDE-7 removal at different Laccase dosages； （B）Relationship between pseudo first-order rate constants and ABTS dosage本文进一步分析了kobs与酶活性之间的相关关系. 如图4B所示，在整个漆酶投加量范围内（0.02—0.5 U·mL−1），kobs与酶活性之间并不存在正相关关系，这明显不符合酶催化反应的特征. 基于对LMS系统的作用机理的分析，本文推测漆酶与介体ABTS之间存在一个最佳配比. 由于ABTS也是漆酶的一个潜在反应底物，因此ABTS的投加量并不是越多越好，这是因为过多的ABTS会跟底物形成竞争关系，从而导致底物的去除率降低. 本文进一步对实验数据进行了分段拟合，结果如图4B所示. 漆酶投加量在0—0.1 U·mL−1和0.1—0.5 U·mL−1范围内时，kobs分别与漆酶的活性均呈现出了较好的线性关系. 在第一阶段，即漆酶投加量在0—0.1 U·mL−1范围内时，漆酶含量是3-OH-BDE-7降解的主要限速因素，由于ABTS本身不与底物发生反应，因此随着酶浓度的增加3-OH-BDE-7的去除率快速增加. 而当漆酶投加量在0.1—0.5 U·mL−1范围内时，ABTS的含量是3-OH-BDE-7降解的主要限速因素，因为此时漆酶含量足够多，但是由于漆酶自身的氧化还原电位较低，导致其直接与3-OH-BDE-7反应的速率低，所以即使再增大漆酶投加量，3-OH-BDE-7的降解速率也不会增加太多. 综上所述，这些结果进一步证明了本文前面的假设，即ABTS优先于3-OH-BDE-7迅速与漆酶发生反应，产生ABTS+和ABTS++，形成新的催化活性物种去介导底物的去除过程.
2.4 pH和温度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响
由图5A可以看出，在pH为4—7范围内，LMS体系对3-OH-BDE-7的去除率均可达80%以上，保持了较高水平. 当pH值增大或者减小时，3-OH-BDE-7的去除率都有所降低. 例如在pH为3和10的条件下，反应60 min后，3-OH-BDE-7的去除率分别只有63%和35%. pH会影响漆酶的活性是因为反应介质的pH值影响漆酶表面的电化学特性或反应中心，不同的pH值能够影响漆酶的稳定性，从而进一步影响漆酶的活性. 通常情况下，每种漆酶都有自身适宜的pH值范围. 从图5B可以看出，本实验所用的漆酶活性的最佳pH值是5.0. 当溶液pH值高于或低于5.0时，漆酶的活性都显著降低. 例如当溶液pH值为3时，漆酶的活性相比于pH等于5.0时降低了36%. 然而从图5A的去除率上来看，3-OH-BDE-7的去除率在pH为3时只降低了约20%, 类似的现象在之前的研究中也有被发现[21]. 有研究表明在漆酶-ABTS介体系统下，起主要作用是ABTS++[14]，而ABTS++在酸性环境下更容易保持其稳定性. 这也就解释了为什么在pH为3时，酶活性降低了36%，而3-OH-BDE-7的去除率只降低了约20%. 此外，对比图5A和5B，可以发现ABTS介体的加入，可以缓解pH改变致酶失活而对降低对底物去除率的趋势. 因此，ABTS的加入扩大了漆酶催化氧化底物的pH适用范围.
图 5 （A）溶液pH对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响， （B）溶液pH对漆酶活性的影响，（C）温度对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响， （D）温度对漆酶活性的影响Figure 5. （A）Influence of solution pH on the removal of 3-OH-BDE-7， （B）Influence of solution pH on the activity of Laccase ，（C）Influence of temperature on the removal of 3-OH-BDE-7， （D）Influence of temperature on the activity of Laccase温度也是影响酶活性的关键因素之一. 从图5C可以看出，本研究中LMS的反应最佳温度范围在25—35 ℃. 而当温度升高或者降低时，LMS对3-OH-BDE-7的去除率都显著降低. 例如，在温度为4 ℃时，3-OH-BDE-7去除率只有约20%. 通过对不同温度下酶活性的测定，可以发现本实验中所用的漆酶的最佳温度范围也在25—35 ℃. 此外，通过对比图5C和5D，可以发现不同温度下LMS对3-OH-BDE-7的去除率变化趋势与温度对酶活性的影响趋势基本一致，这说明ABTS的加入并不会改变漆酶催化氧化底物的温度适用范围.
2.5 NOM对LMS系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响
NOM的主要成分是溶解性的腐殖质，广泛存在于多个环境介质中，例如自然水体和土壤中. 因此，酶催化氧化污染的动力学过程不可避免的受到NOM的影响[9, 18]. 本文进一步探究了不同浓度的NOM对漆酶-ABTS介体系统催化氧化3-OH-BDE-7的影响. 从图6A可以看出，NOM的存在对LMS催化氧化3-OH-BDE-7具有一定的抑制作用，并且随着NOM浓度的增加，抑制程度越来越大. 木质素过氧化物酶（Lip）以及漆酶在催化去除雌激素和四溴双酚A的反应过程中也发现了类似的现象[9, 22]. 此外，3-OH-BDE-7的降解过程在NOM存在的情况下，同样呈现出假一级动力学规律，结果如图6B所示. 通过公式（2）计算可知，当NOM浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg·L−1时，其kobs分别为0.0122、0.0082、0.0058、0.0047、0.0038 min−1.
图 6 （A）不同浓度NOM对LMS催化氧化3-OH-BDE-7的影响； （B）LMS在不同NOM投加量条件下催化氧化3-OH-BDE-7的假一级动力学拟合曲线； （C）NOM对漆酶活性的影响； （D）不同浓度NOM分别LMS下随时间的吸光度变化； （E）NOM的吸附作用对3-OH-BDE-7去除率的影响； （F）假一级动力学常数与NOM投加量之间的关系Figure 6. （A）Influence of NOM dosage on the removal of 3-OH-BDE-7；（B）Pseudo first-order rate plots for 3-OH-BDE-7 removal at different NOM dosages； （C）Influence of NOM on the activity of laccase；（D）Time based UV absorbance of NOM treated by LMS；（E）The effect of NOM adsorption on the removal of 3-OH-BDE-7 mediated by LMS；（F）Relationship between pseudo first-order rate constants and NOM dosage有研究发现NOM中的羟基和羧基能和漆酶活性中心的铜离子发生配位反应，从而使得漆酶的活性降低[23]. 但是，本研究中NOM的存在对漆酶的活性并没有影响，如图6C所示，这与Xia等的研究结果一致，他们也发现腐殖酸并不会影响漆酶的活性[24]. 因此本实验中NOM对酶活性的影响不是其抑制作用的主要原因.
其次，NOM也可以作为底物，与酶发生反应，这主要是因为NOM分子结构中有许多酚类官能团[18]. 由于NOM对漆酶催化反应的影响主要取决于酚类官能团的含量及其周围的电子或空间微环境[24]. 因此，不同来源的NOM可能对酶催化反应表现出不同的影响. 例如，从泥炭中提取的NOM组分对漆酶反应具有一定的抑制作用，而来源于IHSS的NOM则对漆酶反应具有一定的促进作用[18]. 为探究本实验中NOM的LMS的影响，本文进一步利用紫外分光光度计表征了NOM在LMS下的吸光度变化. 如图6D所示，NOM的吸光度值并没有发生显著的变化，这表明NOM与LMS之间不发生反应，类似的现象在Lu等[25]的研究中也观测到. 此外，NOM也可能吸附3-OH-BDE-7，进而抑制其在LMS下的去除. 为探究NOM对3-OH-BDE-7的吸附作用对其去除率的影响，本文将NOM与3-OH-BDE-7先共同孵育24 h后，再进行降解实验，结果如图6E所示. 从图6E可以看出，共同孵育条件下3-OH-BDE-7的去除率与同时投加条件下的去除率并没有显著性差异，这说明NOM对3-OH-BDE-7的吸附作用并不是NOM抑制作用的主要原因.
有研究报道，腐殖质能够逆转漆酶介导的底物氧化过程[25]. 在漆酶催化氧化底物的过程中，分为两个阶段. 第一个阶段是底物（S）首先被酶氧化成活性自由基中间体（S*），第二个阶段是活性自由基中间体（S*）发生耦合进而生成耦合产物（P）. 这两个阶段很大程度上是不可逆的，然而在NOM存在的情况，生成的活性自由基中间体（S*）可能与NOM发生反应重新转化成底物（S）.
S+LMSk1→S∗ (3) S∗k2→P (4) S∗+NOMk3→S (5) d[S]dt=−k1[S]+k−1[S∗]CNOM (6) d[S∗]dt=k1[S]−k−1[S∗]CNOM−k2[S∗] (7) d[P]dt=k2[S∗] (8) 假设S*达到相对稳态，即ds/dt≈0，则根据公式，可知：
[S∗]=k1[S]k−1CNOM+k2 (9) 代入公式（8），可知
d[P]dt=k2k1[S]k−1CNOM+k2 (10) 假设S*的浓度非常小，并且变化慢，则产物的生成速率与反应物的消失速率近似相等. 则
d[S]dt=−d[P]dt=−k1k2[S]k−1CNOM+k2 (11) 因此，
kobs=k1k2k−1CNOM+k2 (12) 公式变换后，
1kobs=k−1k1k2CNOM+1k1 (13) 因此，1/kobs应该与NOM的浓度呈正相关,结果如图6E所示. 1/kobs与NOM的浓度之间具有较好的线性关系（R2=0.9990），这说明NOM可以与LMS中形成的底物有机自由基发生反应，使其返回到初始状态，所以NOM才表现出对3-OH-BDE-7转化的抑制作用.
2.6 3-OH-BDE-7的降解产物及降解路径
最后，利用LC-MS对3-OH-BDE-7在LMS下的中间产物进行了鉴定。通过分析LC-MS信息，并结合溴代待物的特征质谱图，识别出了3种降解产物，结果如图7A所示。根据鉴定到的中间产物，对3-OH-BDE-7的降解路径进行了推测，结果如图7B所示。在LMS作用下，3-OH-BDE-7失去一个电子生成3-OH-BDE-7自由基（R1）。3-OH-BDE-7自由基经过电荷重排后依次形成自由基R2和R3，R3中C—O断裂后生成自由基R4。路径1是自由基R4与水反应生成2,4-二溴酚（产物1）；路径2是自由基R1与自由基R2发生耦合反应1-（2,4-二苯氧基）-2,4-二溴苯甲醚（产物2）；路径3是两个自由基R4发生耦合反应生成1,3-二（2,4-二苯氧基）苯醚（产物3）。这与本课题组之前的研究结果类似，即漆酶催化反应过程中，生成的有机自由基容易发生耦合反应生成二聚物或者三聚物[9]。
图 7 （A）3-OH-BDE-7及其转化产物的LC-MS分析结果. （B）3-OH-BDE-7在漆酶/ABTS反应体系下可能的转化路径Figure 7. （A）Mass spectra of 3-OH-BDE-7 and its products resulting from LC-MS analysis. （B）Possible reaction pathways of 3-OH-BDE-7 in laccase/ABTS mediated reaction system3. 结论（Conclusion）
（1） ABTS能够显著促进漆酶催化氧化去除3-OH-BDE-7的速率. 加入ABTS （2 μmol·L−1）的漆酶体系催化氧化3-OH-BDE-7的速率约是单纯漆酶体系下的20倍.
（2） 当漆酶投加量固定时，随着ABTS浓度的增加，3-OH-BDE-7的去除率也不断提高，并且假一级动力学常数与ABTS的浓度呈正相关.
（3） 当ABTS投加量固定时，随着漆酶浓度的增加，尽管3-OH-BDE-7的去除率也不断提高，但是增加的程度在不断降低.
（4） ABTS的加入扩大了漆酶催化氧化3-OH-BDE-7的pH适用范围, 但是并不会改变漆酶催化氧化3-OH-BDE-7的温度适用范围.
（5） NOM能够抑制3-OH-BDE-7在LMS系统的降解，并且随着NOM浓度的增加，抑制作用逐渐增强. NOM抑制3-OH-BDE-7降解的主要原因是NOM能够淬灭催化反应过程中的底物有机自由基.
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图 1 黄河流域2006～2020年水环境质量状况
Figure 1. Water environment quality in the Yellow River Basin from 2006 to 2020
图 2 2015年黄河流域COD排放行业构成
Figure 2. Composition of COD emission industry in the Yellow River Basin in 2015
图 3 2015年黄河流域氨氮排放行业构成
Figure 3. Composition of ammonia nitrogen emission industry in the Yellow River Basin in 2015
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