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随着人民生活水平的提高和“乡村振兴”的大力推进，近年来我国农村生活污水排放量呈现出飞速增长的趋势，年排放量达到202万吨，如果不加治理任其排放，会对环境带来极大的污染。我国西北区域干旱和半干旱地区面积广大，河湖稀少，水资源贫乏，生活污水未得到有效的资源化利用。同时，西北地区农村居民居住较为分散，排水管网等设施的建立还不够完善，污水接入管网比例较低，大多生活污水直接排放，需要一种成本低、运维简单方便的处理工艺针对分散式居民生活污水进行适当的处理。目前针对农村生活污水的治理，大多还停留在照搬城市污水处理模式的层面，存在污水处理工艺复杂、基建和运维成本较高等问题[1]。
国外发达国家已针对分散式农村生活污水进行了大量的实验和研究。美国农村地区分散式污水处理技术包括传统土地处理系统[2]、生物膜系统、SBR系统、厌氧流化床系统、土地渗滤和人工湿地等，实际应用中多为2种或多种技术组合，以应对不同污水水质、水量情况[3-4]。欧美发达国家研发的高效藻类塘技术是一种具有自我净化能力的生态系统，其施工投资及运行费用少、便于管理和维护，适用于处理分散式生活污水，但处理效果易受环境影响[5]。日本研发的净化槽系统简单实用，发展已相当成熟，并根据不同应用场景开发出多种单元工艺的净化槽，包括生物转盘、接触、活性炭吸收和硝化液循环式活性污泥法[6]等工艺。澳大利亚的分散式生活污水处理技术FILTER（Filtration and Irrigated cropping for Land Treatment and Effluent Reuse）污水土壤处理系统，能够高效处理生活污水，出水可用于灌溉和地下水补充[7]，但造价较高，推广应用受到限制[8]。
目前我国针对分散式农村生活污水的处理技术主要有以下类型：人工湿地[9]、土地处理[10]、稳定塘、净化沼气池及其他一体化小型污水处理装置。处理分散式农村生活污水，如果一味追求高标准的处理出水水质，需要大量的资金投入，这与我国农村实际经济状况等条件不符。如果将农村生活污水进行就地资源化，与农村水资源实际需求相结合，就能在开发农村生活污水处理模式与解决部分地区农村水资源短缺方面找到突破口。
农村的生活污水主要包括黑水和灰水，灰水产生量最大而污染程度较低，处理后可进行资源化回用。农村常见的厌氧沉淀池、沼气池等处理方式虽然造价低廉、施工简单，但是日常使用中存在处理效果不佳、异味明显的问题[11]；膜生物反应器工艺处理效果较好，但是后期维护成本较高[12]。且现有的处理工艺较少针对生活灰水进行单独处理，未能形成有效的农村生活污水资源化利用模式[13]。
本研究设计一种多介质庭院生态处理技术，该技术将微生物代谢和滤料过滤吸附处理机理相结合，以农村居民生活灰水为处理对象，以农田灌溉回用为排放情景。处理装置主要由土壤层和多介质滤料层构成，上层土壤还可种植植物，美化庭院的同时加强污水处理效果。该技术有利于解决西北村镇污水治理率不高且非传统水源利用率普遍偏低的问题，实现良好的节水效果，还可将灰水中利于农作物生长的氮磷元素保留下来，在降低污水处理成本的同时实现资源化利用，带来一定的经济效益。技术针对单户型排水规模进行设计，装置具有模块化特点，可针对具体使用人数组合使用，有助于解决农村居民分散式生活污水难以统一收集处理、水质水量波动大以及缺少专业人员维护水处理设备的问题。
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为验证处理技术设计的合理性、探究处理装置的污染物去除效率，设计实验室实验进行验证。实验装置由有机玻璃制成，装置具体规格及示意图见图1。其中，滤料区自上而下由砾石（粒径：4～8 mm）、陶粒（粒径：4～8 mm）、沸石（粒径：4～8 mm）按照1∶1∶1的比例进行填充，底部填充粒径12～14 mm的石英砂作为承托层，由上部多孔配水管进水。顶层填充土壤取自实验基地旁当地土壤。灰水经土壤和滤料的共同处理后，通过底部的出水口进行排水。
装置采用进水-静置反应-出水的方式运行，水力停留时间设置为24 h，实验共运行28 d。每隔3 d在同一时段取样，进水样本取样后24 h对装置出水进行取样，作为一组进出水数据，并进行相关污染物指标的测定，分析装置的污染物去除效果。
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本实验用水取自内蒙古呼和浩特市某村居民生活灰水，经沉淀池沉淀后使用，污水水质变化范围见表1。
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该处理技术针对农村居民生活灰水进行处理，使出水达到《农田灌溉水质标准：GB5084—2021》（下称《标准》），因此实验针对《标准》中的CODCr、SS、阴离子表面活性剂和pH进行监测。另外对进出水中的氨氮进行检测，验证装置对进水中氮元素的保留效果。各项指标均采用国家规定的标准方法[14]进行测定。
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处理装置对进水中CODCr的处理效果，见图2。
图2可知，随着实验的进行，装置的处理效果趋于稳定，对进水中CODCr的去除效率略有上升。若仅依靠滤料的吸附作用去除进水中的污染物，随着时间的推移，滤料的吸附将趋于饱和，装置的去除效率应当呈现下降的趋势。而实验结果中CODCr的去除效率并未发生大幅降低，这说明滤料表面在连续运行过程中可能有一定量生物膜的生成，处理过程中，土壤与多介质滤料除了对进水中的污染物进行物理吸附[15]，还通过微生物的代谢作用提升了CODCr去除效率。整个实验过程的最后2次取样检测结果发现，装置对CODCr的处理效率略有下降，可能是由于实验基地地区逐渐进入冬季，环境温度的降低影响了装置内部微生物的活性[16]。实验期间实验基地地区温度日变化，见图3，实验污染物浓度去除效率变化曲线与其趋势相接近。
与其他带有曝气环节的处理工艺相比，本实验处理装置的CODCr去除率较低，去除率范围在61%～68%，但出水CODCr浓度能够满足《标准》中灌溉旱作农作物的要求，且由于处理过程中不需要曝气，减少了能源的消耗，较适合西北农村地区应用。通常西北农村居民生活灰水中不包含冲厕带来的粪便水，因而水质中CODCr浓度较低，经本装置处理后的出水能够满足《标准》要求。
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实验装置出水氨氮浓度的变化情况，见图4。相较于进水氨氮浓度来说，出水氨氮浓度虽然呈现一定波动性的变化，但是就整个实验过程来看，出水氨氮浓度并没有出现较大幅度的下降，这与其他生活污水处理技术的处理效果不同，以往研究中对氨氮的去除率通常在50%以上[17-18]。
有研究表明，氨氮作为一种无机氮，有利于被农作物吸收利用[19]。因此保留进水中的氨氮并将出水用于农田灌溉，一方面降低了污水处理过程中的能耗，另一方面也使得污水资源得到再次利用。因为本技术设计的处理流程中不存在曝气环节，装置中的污水始终处在缺氧甚至厌氧的条件下，氨氮的代谢路径缺失，故能够保留进水中的氨氮，利于后续灌溉回用，为农作物增加肥效。由于土壤中含有多种微生物，进水流经土壤时，会发生微生物对氨氮的代谢作用[20]，使氨氮的浓度出现一定波动，当水解酸化总氮生成的氨氮含量低于微生物的代谢吸收量时，就可能会出现出水中氨氮浓度减少的情况，这是本实验中出水氨氮浓度不总是增加的原因。有研究表明，沸石对氮元素具有较好的处理效果。本实验中沸石对氨氮的去除效果并不明显，可能因为多介质滤料中沸石部分的比例仅为33.3%，另一方面由于实际生活灰水中污染物组成较为复杂，可能造成沸石的吸附点位被其他有机物占据，降低了沸石对氮元素的吸附能力，使得进水中的氮元素作为肥效资源得到了一定程度的保留。吴晓莺等[18]所研究的人工湿地处理农村生活污水中，氨氮去除率达到54.2%～69.4%，可能是由于处理过程中能够更多地借助氧气实现硝化作用，因而更多地实现了氨氮的去除而非保留。
实验结果表明，经多介质庭院生态处理技术处理后的污水，通过减少处理过程中消耗氨氮的反应路径，能够得到较好地保留进水中的氨氮，增加出水后续灌溉利用的肥效。
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实验装置对阴离子表面活性剂的处理效率，见图5。在实验过程中，装置出水的阴离子表面活性剂浓度能够符合旱田作物的农田灌溉水质标准。
直链烷基苯磺酸盐 (linear alkylbenzenesulfonates，LAS) 应用广泛，是一种典型阴离子表面活性剂[21]，在生活污水中的质量浓度一般为3～20 mg/L。有研究表明，在污水处理过程中LAS会有一定程度的降解，但受自身结构及所处环境（好氧或厌氧）影响，其降解程度不一[22]。任刚等[23]通过对LAS和浊度、COD去除相关关系进行分析，认为LAS在水中主要以和其他有机物结合的方式存在，因此对污水中LAS的去除和对有机物的去除存在统一性。郭伟等[24]研究认为，在人工快滤系统中，LAS的去除效果与土层深度有关，因此认为LAS的去除主要通过土壤的吸附来实现。
实验装置对SS的处理效率，见图6。在28 d的实验过程中，装置出水SS在前7 d略高于农田灌溉水质标准要求，随后出水SS有所下降，初期可能是由于滤料清洗过程中有残留细杂质未冲洗干净，之后随着进水的冲洗，有一定量的微生物生长附着在多介质滤料的空隙处[25]，提高了装置对SS的截留效果。但随着微生物的世代更替，可能会有脱落生物膜随出水流出，造成出水SS升高，若装置在实际应用中存在SS高于标准要求的情况，可以考虑在装置出水口处加装过滤网，或出水经适当的沉淀处理后作为灌溉水使用。
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多介质庭院生态处理技术通过结合微生物代谢和滤料过滤吸附等处理机理，在无需外加药剂及能源投入的情况下，对西北农村分散式居民生活灰水能够实现较好的处理效果，CODCr的去除率维持在65%左右，阴离子表面活性剂去除率维持在60%左右，SS去除率达到50%以上。
该工艺主要针对处理生活灰水进行设计，实际应用中应与“黑灰分离”式污水处理系统相结合进行应用。该工艺建设简单、维护较少，适合于西北农村地区的实际情况，且灰水中有利于农作物生长的氮元素得到了保留，用于灌溉可为农作物增添肥效，带来一定的经济效益。同时，处理装置具有模块化的特点，可根据不同居民排水量的不同进行设计，多个模块进行组合串并联使用，在居民生活灰水量减少的季节，通过控制水阀的开闭选择投入使用的处理模块数量，应对进水水质、水量的波动。
由于西北地区具有冬季气候寒冷，冬寒时间长的特点，而低温状态下由于植物生长停滞和微生物活性降低，该工艺的处理效果会受到影响，在技术的实际应用中还应对设备的保温方面进行考虑。如在地表设置温室大棚，或将地表种植的植物收割后用于覆盖保温。同时也可在大棚中种植经济作物，实现原位资源化利用，同时提升工艺的经济价值。
针对西北村镇生活灰水的多介质庭院生态处理技术
Multi-media ecological courtyard treatment technology for domestic grey water in villages and towns of Northwest China
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摘要: 我国西北地区干旱缺水，作为非传统水源的生活灰水资源化利用率普遍偏低。针对我国西北村镇居民生活灰水的收集排放情况和水质特点，结合土壤和多介质滤料对水中污染物的去除效果，设计多介质庭院生态处理技术，将处理后居民生活灰水作为农田灌溉水进行利用。设计实验装置以内蒙古呼和浩特市某村居民生活灰水为进水，连续运行28 d，对处理效率进行研究。结果表明，装置对CODCr的去除率维持在65%左右，阴离子表面活性剂去除率维持在60%左右，SS去除率达到50%以上，并且灰水中的氮元素得到了保留，用于灌溉可为农作物增添肥效，论证了该技术在处理西北农村灰水方面的可行性。Abstract: As a non-traditional water source, the utilization rate of domestic gray water resources is generally low in northwest China due to drought and water shortage. According to the collection and discharge of domestic grey water and water quality characteristics in northwestern villages and towns in China, the multi-medium courtyard ecological treatment technology combing with the effect of soil and multi-media filter material on the removal of pollutants in water was designed. The treated domestic grey water was used as the farmland irrigation water. The experimental device was designed to take the domestic grey water of a village in Hohhot, Inner Mongolia as the inlet water. It operated continuously for 28 days to study the treatment efficiency. The results showed that the removal rate of CODCr was maintained at about 65%, and the removal rate of anionic surfactant was maintained at about 60%. The SS removal rate reached more than 50%, and the nitrogen element in the grey water was retained, which could increase the fertilizer efficiency of crops for irrigation. The experiment demonstrated the feasibility of the technology in the treatment of grey water in the villages and towns of Northwest China.
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高氮磷废水的过量排放会导致水体富营养化和生态破坏[1]。微藻是一种光合微生物，能够吸收氮、磷和有机物等，被用处理各种废水[2]。另一方面，微藻细胞脂类含量高是生物柴油生产的主要原料[3-9]，因此，将废水处理与微藻生物量生产相结合可以降低二者生产成本。由于微藻对废水中氮/磷的去除是藻细胞生长代谢的结果即平均去除速率和去除率与藻细胞生长速率和生物量呈正相关，而部分细菌和真菌能够促进微藻的生长(如地衣中的细菌和真菌促进其共生绿藻的生长)，因此，将微藻与细菌[10-16]或者真菌[17-26]混合培养，利用微藻和细菌或者真菌之间的协同效应促进微藻生长进而提高氮/磷的去除率成为研究热点。
雨生红球藻能够在适宜的条件下快速吸收氮和磷进行自养/混合营养生长，而在不利条件下大量合成脂类和高附加值的虾青素(一种红色类胡萝卜素)[27-28]，目前已被用于处理不同的废水，并取得了良好的效果[29-33]。然而，与其他藻类相比，雨生红球藻对有害细菌更敏感，这些细菌严重抑制藻细胞生长，限制了其在废水处理中的应用。实际上，有害细菌对所有微藻的生长均构成严重威胁[34]。为了控制微藻培养过程中的有害细菌，通常采用的方法为添加抗生素、高温处理、强光照射[35-36]，以及使用次氯酸钠对废水进行预处理[37]。因此，有效控制有害细菌是利用微藻尤其是雨生红球藻处理废水的关键问题。
在此前的研究[37-38]中我们分离到一种蓝藻共生真菌Simplicillium lanosoniveum(DT06)。DT06能够合成一种新抗生素[39]并且能促进衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)生长和脂类合成[40]。因此，本研究将雨生红球藻与真菌DT06在高含氮磷废水中混合培养，以期提高雨生红球藻类生长速率和产量以及废水氮/磷的去除速率和去除率。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1)废水样本。废水来自天津市的某污水处理厂。废水通过0.45 µm滤膜去除不溶性大分子物质，并在4 ℃保存。废水主要性质如下：pH为6.5±0.4；总氮(TN)质量浓度为(553.8±17) mg·L–1；总磷(TP)质量浓度为(90.7±8) mg·L–1，化学需氧量(COD)为(750±22) mg·L–1。
2)微生物菌株。雨生红球藻购自中国武汉水生生物研究所；真菌Simplicillium lanosoniveum DT06由河北工业大学代谢工程与生物合成实验室分离获得，并保藏于中国科学院微生物学研究所菌物标本馆(编号HMAS 242045)。
1.2 微藻接种液以及真菌孢子的制备
1)微藻接种液：5 mL雨生红球藻培养液接种到装有60 mL BBM培养基[27]的100 mL锥形瓶中，置于光照摇床中培养7 d(115 r·min–1、25 °C恒温、60 μmoL·(m2·s)–1持续光照)。雨生红球藻接种液最终的细胞浓度为1.5×105 细胞·mL–1。
2)真菌孢子悬浮液：将真菌DT06划线于PDA培养基平板上，于培养箱(28 ℃)中恒温培养7 d后，从菌落表面轻轻刮取收集DT06孢子，并悬浮于50 mL无菌水中。真菌孢子悬浮液最终细胞浓度为5×106 细胞·mL–1。雨生红球藻细胞和真菌DT06孢子的数量均通显微镜进行计数。
1.3 培养体系的构建
雨生红球藻与真菌DT06混合培养(简称M组)：按10%接种量将雨生红球藻接种到含有200 mL废水的500 mL锥形瓶中，并分别接种对应体积的DT06孢子悬浮液，以达到5∶1、10∶1、30∶1、50∶1的细胞数量接种比例(雨生红球藻：DT06)。以雨生红球藻单独培养(1∶0，雨生红球藻：DT06)作为对照(CK)。
雨生红球藻-DT06混合添加NaHCO3培养(简称MC组)：在每组含有200 mL废水的500 mL锥形瓶中分别添加不同体积的NaHCO3母液(10 g·L–1)，使NaHCO3质量浓度达到0(对照，MCK)、0.2、0.4、0.6和0.8 g·L–1，以最佳细胞接种比例分别接种雨生红球藻和DT06孢子悬浮液。
所有实验均置于光照培养箱中培养12 d(25 °C恒温、60 μmoL·(m2·s)–1持续光照)，每天手摇2次，每组实验设置3个重复。
1.4 参数测定方法
1)雨生红球藻生物量。雨生红球藻生物量以细胞干重表示，每隔2 d取培养液并采用显微镜计数法计数，根据式(1)计算雨生红球藻生物量，根据式(2)计算雨生红球藻比生长速率。
X=4.64×10−8N+0.0035 (1) μ=(lnXn−lnX0)/(tn−t0) (2) 式中：X为细胞干质量，g·L–1；N为细胞浓度, 细胞·mL–1；μ为比生长速率，d−1；X0和Xn分别为第t0天和第tn天的雨生红球藻生物量，g·L–1。
2)细菌总数。根据实验室之前的方法[40-42]对废水中细菌总数做了部分修改。灭菌的LB琼脂板接种1 mL稀释105倍的废水样品，并在培养实验相同的条件下培养3 d。总细菌数表示为每毫升菌落形成单位(CFU·mL−1)。
3)废水水质。每隔两天取废水样本进行分析。总氮使用过硫酸钾氧化紫外分光光度法；总磷使用钼锑抗分光光度法；COD 使用重铬酸盐法测定；氮、磷的去除率和去除速率根据式(3)和式(4)进行计算。
N=(N0−Nt)/N0×100% (3) R=(N0−Nt)/(tn−t0) (4) 式中：N为COD和氮、磷的去除率，%；R为COD和氮、磷的去除速率，mg·(L·d)–1；N0和Nt分别为第t0天和第tn天的COD和氮、磷质量浓度，mg·L–1。
4)脂类和虾青素含量。 雨生红球藻脂类和虾青素含量参照我们此前的方法[43]测定。
2. 结果与讨论
2.1 雨生红球藻-真菌DT06混合培养
1)混合培养对微藻生长的影响。如图1(a)所示，CK中雨生红球藻的生物量在前8 d内缓慢上升，第10天后趋于平稳，最终达到0.27 g·L–1；而雨生红球藻与DT06混合培养过程中雨生红球藻的生物量在前4 d缓慢上升(适应期)，在第6天(10:1、30:1)和第8天(5:1、50:1)快速上升，第8天后趋于平稳。最终，雨生红球藻的生物量在5:1、10:1、30:1和50:1下分别为0.64、1.08、 1.39 和 0.74 g·L–1。
图 1 混合培养不同接种比例下雨生红球藻生物量和比生长速率的变化Figure 1. Changes of biomass and specific growth rate of H. pluvialis in mixed cultures under different cells ratios生长动力学分析结果(图1(b))显示， CK中雨生红球藻的比生长速率在第4天达到最大值(0.18 d–1)，第6天后逐渐降低至0。雨生红球藻与DT06混合培养过程中雨生红球藻的比生长速率均高于CK。比生长速率在10∶1和30∶1时在第6天达到最大值，分别为0.45 d−1和0.54 d−1；在5∶1和50∶1时在第8天达到最大值，分别为0.34 d−1和0.36 d−1。比生长速率此后逐渐降低至0。雨生红球藻与DT06混合培养过程中30∶1表现出最高的生长速率和最高平均比生长速率(0.25 d−1)，因此，后续实验以最佳藻菌细胞比30∶1进行实验。
混合培养中藻类生物量的增加是由于比生长速率的提高，这可归因于2个方面：1)藻类(雨生红球藻)和真菌DT06的共生作用。DT06释放CO2促进雨生红球藻光合作用，并吸收雨生红球藻释放的O2进行有氧代谢，从而解除O2对藻类生长的抑制作用，这与其他菌藻混合培养类似[27,44-47]；2)抑制有害细菌的生长。与混合培养相比，对照的生物量异常低，比生长速率过早地下降，表明废水中有害细菌对藻类的生长有显著的抑制作用，混合培养中的生物量持续增加表明DT06释放的抗生素表现出对有害细菌显著的抑制作用。
2)总细菌数。如图2所示，实验结束时5∶1、10∶1、30∶1和50∶1中细菌总数分别为1.3、1.5、1.6、1.9×106 CFU。雨生红球藻与DT06混合培养过程中的细菌总数与CK(2.8×106 CFU)相比分别下降了54.8%、46.4%、42.9%和30.4%。这表明DT06能够抑制废水中细菌的增长。
图 2 混合培养不同接种比例细菌总数Figure 2. The total number of bacteria in mixed cultures under different cells ratios3)如图3所示，CK中pH持续上升，在实验结束时达到8.65。雨生红球藻与DT06混合培养过程中pH在前4 d持续升高，之后保持相对稳定且显著低于CK。实验结束时5: 1、10: 1、30: 1和50: 1的pH分别稳定在7.83、7.65、7.36和7.92。pH快速升高主要原因是雨生红球藻吸收了生理碱性盐(如硝酸盐)。混合培养中pH保持相对稳定，原因是真菌DT06释放的CO2中和培养液的碱性以及雨生红球藻吸收废水中的NH4+降低了培养液的pH。
4)混合培养对COD去除的影响。如图4(a)所示，CK中COD下降缓慢，最终的去除率仅为28.5%，平均去除速率为18.4 mg·(L·d)–1(图4(b))。这表明雨生红球藻和原有的微生物对耗氧有机物(以COD计)的降解能力有限。而在30∶1、10∶1、5∶1和50∶1中，COD分别在第4、6和8天内降至0(去除率100 %)(图4(a))，平均去除率分为183.9、127. 4、96. 8、93.1 mg·(L·d)–1 (图4(b))。结果表明，废水中的难降解耗氧有机化合物(以COD计)可被DT06完全降解为小分子物质和CO2，这些小分子物质被雨生红球藻利用进行混合营养生长。因此，在难降解有机化合物完全降解前后，雨生红球藻的比生长速率快速上升，之后迅速下降(图1(b))。
图 4 混合培养不同接种比例下COD的变化、去除率和平均去除速率Figure 4. Changes, removal rate and average removal rate of COD in mixed cultures under different cells ratios5)混合培养对氮磷去除的影响。如图5(a)所示，CK中TN质量浓度在前2 d迅速下降，之后缓慢下降，最终达到340 mg·L–1，去除率为37.9 %，平均去速除率为17.3 mg·(L·d)–1 (图5(b))。相比之下，雨生红球藻与DT006混合培养过程中TN质量浓度持续下降，下降速度均高于CK(图5(a))。其中， 30∶1中TN去除率最高为83.33%，平均去除速率为39.8 mg·(L·d)–1。而5∶1、10∶1、50∶1中TN的平均去除速率分别为24.8、33.0、27.0 mg·(L·d)–1；去除率分别为53.1%、69.1 %、57.9 % (图5(b))。
图 5 混合培养不同接种比例下TN和TP的变化及其去除率和平均去除速率的变化Figure 5. Changes of removal rate and average removal rate of TN and TP in mixed cultures under different cells ratiosTP变化与TN变化规律相似(图5(c))，TP在CK中下降最慢，最终为56.6 mg·L–1；在 30:1中下降最快，最终为10.6 mg·L–1。最低和最高的TP去除率分别为37.1%和88.2%，平均TP去除率分别为2.8 mg·(L·d)–1和6.6 mg·(L·d)–1 (图5(d))。
混合培养氮、磷去除率的提高归因于藻类生长速率的提高。如图6所示，在第6天和第8天之前，所有混合培养中的TN和TP去除速率持续增加，随后骤然下降，这与雨生红球藻比生长速率在初始升高和随后下降一致(图1(b))。而如上所述，雨生红球藻比生长速率的骤然下降主要是由于雨生红球藻进行快速异养生长对作为碳源的COD的快速消耗。也就是说，混合培养中有机碳源(如COD)的存在促进了雨生红球藻的生长，进而提高氮、磷的去除率。然而，在实验结束时，雨生红球藻与DT06混合培养组中残余的氮、磷含量仍然很高(图5(a)和5(c))。因此，在混合培养中需要添加额外的碳源来进一步提高氮、磷的去除率。
图 6 混合培养不同接种比例下TN和TP去除速率的变化Figure 6. Changes of TN and TP removal rates in mixed cultures under different cells ratios有研究表明，添加有机碳源会造成不可避免的二次污染[47]，并提高废水处理成本。廉价的无机碳源，例如碳酸氢盐(NaHCO3)，是产生HCO3−促进雨生红球藻光合营养生长的最佳替代物。因此，为了进一步提高氮磷去除率，本研究在最佳细胞接种比例30∶1的基础上添加NaHCO3进行后续的实验。
2.2 雨生红球藻-真菌DT06混合添加NaHCO3培养
1)添加NaHCO3混合培养对微藻生长的影响。如图7(a)所示，MCK中雨生红球藻生物量在第4天后快速上升，第6天后缓慢上升，最终达到1.36 g·L–1。而添加NaHCO3混合培养过程中雨生红球藻的生物量在第2天后快速上升，第8天后达到稳定期，最终添加0.2、0.4、0.6、0.8 g·L–1 NaHCO3中雨生红球藻的生物量分别为1.58、1.71、1.95、1.44 g·L–1。生长动力学分析结果表明(图7(b))，添加NaHCO3混合培养组中雨生红球藻的比生长速率在第2天上升，并在第4天达到最大值，随后快速下降。添加0.6 g·L–1 NaHCO3中雨生红球藻的比生长速率最高，为0.85 d–1，比MCK(0.51 d–1)高1.66倍。以上结果表明混合培养中添加0.6 g·L–1 的NaHCO3最适合雨生红球藻的生长。
图 7 添加不同质量浓度NaHCO3的混合培养中雨生红球藻生物量和比生长速率的变化Figure 7. Changes of biomass and specific growth rate of H. pluvialis in mixed cultures supplemented with different concentrations of NaHCO3与MCK相比，添加NaHCO3混合培养过程中雨生红球藻的适应期缩短，比生长速率有所升高。这表明NaHCO3产生的HCO3−被雨生红球藻同化为光合底物，从而促进微藻的光合作用。而延长的指数期和比生长速率的下降是由于以下2点：HCO3−的吸收导致pH升高限制了雨生红球藻细胞的生长, 这也是添加0.8 g·L–1 NaHCO3中雨生红球藻的生物量低于添加0.6 g·L–1 NaHCO3的原因(图8)；废水中氮、磷质量浓度的下降(图9)导致雨生红球藻细胞生长停止以及孢子的形成(图7)。
图 8 添加不同质量浓度NaHCO3的混合培养中pHFigure 8. pH in mixed cultures supplemented with different concentrations of NaHCO3
图 9 添加不同质量浓度NaHCO3的混合培养中TN和TP的变化及其去除率和平均去除速率Figure 9. Changes, removal rate and average removal rate of TN and TP in mixed cultures supplemented with different concentrations of NaHCO32)如图8所示，MCK 中pH在前4 d持续升高，之后稳定在7.3~7.5直到实验结束。由于添加了NaHCO3，添加NaHCO3混合培养过程中初始pH均高于MCK。添加0.2、0.4和0.6 g·L–1 NaHCO3的pH在前4 d逐渐升高，之后保持相对稳定，实验结束时pH分别7.71、8.12和8.55。而添加0.8 g·L–1 NaHCO3的pH持续升高，最终达到10.11。
3)添加NaHCO3混合培养过程中混合培养对氮磷去除的影响。如图9(a)所示，添加NaHCO3混合培养过程中TN质量浓度急剧下降。其中添加0.6 g·L–1 NaHCO3中TN质量浓度下降最快，在第10天达到检出限，达到最高去除率(100%)，平均去除速率为55.5 mg·(L·d)–1 (图9(b))。相比之下，添加0.2、0.4、0.8 g·L–1 NaHCO3和MCK中TN质量浓度下降缓慢，最终分别为30.8、10.9、71.5和95.7 mg·L–1。添加0.2、0.4、0.8 g·L–1 NaHCO3和MCK中TN平均去除速率分别为 43.6、45.4、40.4、38.1 mg·(L·d)–1，去除率分别为94.4%、98%、87.1%、82.7%。
TP变化与TN变化规律相似，TP质量浓度在添加0.6 g·L–1 NaHCO3中的第8天便达到检出限，达到最高去除率100%，平均去除速率为8.9 mg·(L·d)–1。而添加0.2、0.4、0.8 g·L–1 NaHCO3和MCK中TP质量浓度在实验结束时分别为3.2、1.9、7.9和11.6 mg·L–1(图9(c))。添加0.2、0.4、0.8 g·L–1 NaHCO3和MCK中TP平均去除速率分别为7.2、7.2、6.9、6.6 mg·(L·d)–1；去除率分别为96.4%、97.9%、91.2%、87.9% (图9(d))。
添加NaHCO3混合培养过程和MCK中TN/TP的变化表明，混合培养中添加NaHCO3促进藻类生长，可提高氮、磷去除率。添加NaHCO3混合培养过程中的TN/TP去除率和平均去除速率(图9(b)和图9(d))与细胞比生长速率和生物量(图7)变化同步，在MC0.6中达到最大值。
2.3 不同培养体系对脂类和虾青素积累的影响
为了评估不同培养体系对雨生红球藻脂类和虾青素合成的影响，分析比较了雨生红球藻添加0.6 g·L–1 NaHCO3、 30:1(MCK)和CK中的脂类和虾青素含量。如图10所示，添加0.6 g·L–1 NaHCO3中脂类含量最高(392.2 mg·g–1)，分别比MCK(259.6 mg·g–1)和CK(194.7 mg·g–1)提高了51.1%和101.4%。添加0.6 g·L–1 NaHCO3中雨生红球藻的虾青素含量达到最高(27.9 mg·g–1)，分别是MCK(19.0 mg·g–1)和CK(5.9 mg·g–1)的1.5倍和4.7倍。脂类和虾青素的变化规律相似，主要是由于呈脂溶性虾青素分散在藻类细胞的脂滴中[48]，因此，与脂类的合成呈相同的变化趋势(图10)。
图 10 不同培养体系下脂类和虾青素的含量Figure 10. Contents of lipid and astaxanthin in different culture modes与CK和MCK相比，添加0.6 g·L–1 NaHCO3中雨生红球藻的脂类和虾青素含量逐渐增加。主要原因是氮、磷质量浓度的快速下降，尤其是氮(图7(a))。添加0.6 g·L–1 NaHCO3对总氮的快速去除导致早期氮的含量相对不足/缺乏(氮饥饿)，使得藻细胞将碳通量引导至脂类合成路径，从而促进脂类和虾青素的合成[48-49]。
3. 结论
1)与雨生红球藻的单独培养(CK)相比，雨生红球藻与DT06混合培养促进了雨生红球藻生长。雨生红球藻与DT06混合培养过程的COD先后均被完全去除，氮、磷的去除效果也得到显著提升。
2)添加NaHCO3的混合培养可进一步促进藻类生长和对氮、磷的去除。在NaHCO3质量浓度为0.6 g·L–1时，雨生红球藻比生长速率达到最高，氮和磷几乎被完全去除，其平均去除速率分别达到55.5 mg·(L·d)–1和8.9 mg·(L·d)–1。
3)在CK、M和MC体系中，MC中雨生红球藻的脂类和虾青素含量最高，分别达到259.6 mg·L–1和27.9 mg·L–1。
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图 4 装置处理前后氨氮浓度变化
Figure 4. The change in ammonia nitrogen concentration after the device treatment
表 1 居民生活灰水水质
Table 1. Residential grey water quality
mg·L−1 检测指标 变化范围 COD 220～350 氨氮 18～25 SS 80～220 阴离子表面活性剂 12～15 pH 7.5～7.9 
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