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由于国内污水处理排放标准日益严格，污水处理厂普遍面临氮磷达标的难题。目前，国内大部分采用的A2/O工艺及以其为基础的前置反硝化工艺自身脱氮效果受硝化液回流比限制，难以实现深度脱氮[1-3]。此外，我国的污水普遍存在碳源不足的特点，而脱氮除磷又存在碳源竞争，导致了氮磷不易达标[4-5]。目前，对于低C/N水质的污水，常采用投加碳源、增设反硝化滤池、分段进水A2/O工艺等[6-8]来提高脱氮效率；除磷方面，则通过投加大量化学除磷药剂来满足日趋严格的出水标准。但这些方法大都存在处理流程长、运行成本高、控制复杂等问题。因此，研发经济高效的脱氮除磷新工艺成为一大热点。
后置反硝化AOA (厌氧\好氧\缺氧) 工艺因可利用内碳源来反硝化，且工艺简单无需硝化液回流，而被广泛研究。WINKLER等[9]和许德超等[10]研究了后置缺氧序批式反应器 (SBR) 工艺，VOCKS等[11]研究了连续流后置缺氧膜生物反应器 (MBR) 工艺，ZHAO等[12]研究了连续流AOA工艺，均取得了良好的脱氮除磷效果。这些研究表明，原水中有机物在厌氧段和好氧段被微生物消耗储存，在缺氧段则利用胞内糖原或PHA 来反硝化脱氮。但相比外碳源反硝化，后置缺氧区的内源反硝化速率较低，所需缺氧区停留时间往往较长[12-13]。ZHANG等[14]和GAO等[15]报道了一种污泥双回流-AOA (SDR-AOA) 新工艺，该工艺通过设置二沉池到缺氧池的第二污泥回流，提高缺氧区污泥质量浓度，强化脱氮效果，在小试规模的实验中，该工艺处理低C/N污水，无需外加碳源，TN去除率可达90%以上。但是目前尚缺乏对该工艺中试以上放大规模的实验报道，且除磷效果如何也缺乏研究报道。本研究建立了处理规模100 m3·d−1的SDR-AOA中试系统，在大规模中试条件下对工艺的脱氮除磷性能重点考察，并对无第二污泥回流的AOA工艺和SDR-AOA工艺处理效果进行对比，分析SDR-AOA工艺设置第二污泥回流的优势，以期为该新工艺的推广应用提供参考。
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本实验处理的污水来自海口某污水处理厂曝气沉砂池出水，具体水质特征见表1。污水平均COD/TN为6.34，据研究报道，COD/TN>8时，脱氮效果较好[16]，显然实验水质并不满足。污泥接种自该污水处理厂生化池。
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SDR-AOA工艺中试系统如图1所示。中试装置由碳钢防腐的AOA生化池和二沉池2个主体反应器组成。AOA生化池为长方形反应池，总有效体积为45 m3，反应器分7个格室，依次划分为厌氧区、好氧区、缺氧区，其中厌氧区体积11.25 m3，好氧区体积11.25 m3，缺氧区体积22.5 m3。厌氧区第一格室填充有悬浮填料，填充比约12%，缺氧区第一、二格室填充悬浮填料，填充比约12%。二沉池为竖流式，澄清区体积为27 m3。其工艺流程为：潜污泵将污水处理厂曝气沉砂池出水抽到本中试系统，依次流经生化池的厌氧段、好氧段、缺氧段，生化池出水进入二沉池，泥水分离后，上清液排出，沉淀污泥分两路回流到AOA生化池，一路回流到厌氧池前端 (第一污泥回流) ，一路回流到缺氧池前端 (第二污泥回流) 。污水进水量和回流污泥量通过电磁调节阀控制。好氧段通过回转式风机曝气，变频控制。本研究实验阶段反应器填料已挂膜2个月，挂膜稳定，中试运行条件见表2。
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取SDR-AOA中试系统好氧末端污泥，用去离子水清洗3次，确保泥水混合液中没有溶解态的有机物、NH4+-N、NO3−-N和NO2−-N。然后分别取300、500、700、900 mL混合液分别加入4个有效容积为1 L的锥形瓶中，用去离子水定容至1 L后，在DO小于0.1 mg·L−1条件下，加入KNO3，使混合液初始NO3−-N质量浓度约为20 mg·L−1。在室温25 ℃的条件下，采用封口膜隔绝外部空气，磁力搅拌器进行搅拌，并定时取样测定NO3−-N和NO2−-N质量浓度。
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COD采用美国哈希 (HACH) 快速测定仪法。TN、NH4+-N、NO3−-N、NO2−-N、TP、MLSS根据国标法检测：TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法；NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法；NO3−-N采用紫外分光光度法；NO2−-N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；TP采用钼酸铵分光光度法；MLSS、MLVSS采用重量法。DO、温度采用美国哈希在线监测仪监测。微生物多样性检测委托上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。
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式中：
CODintra 为内碳源转化率，%；CODi 、CODe 和CODan 分别为进水、回流污泥和厌氧末COD，mg·L−1；2.86和1.71为去除每mg NO3−-N和NO2−-N消耗COD量；NO−3,i 和NO−2,i 为进水NO3−-N和NO2−-N质量浓度，mg·L−1；NO−3,e 和NO−2,e 为回流污泥中NO3−-N和NO2−-N质量浓度，mg·L−1；NO−3,an 和NO−2,an 为厌氧末NO3−-N和NO2−-N质量浓度，mg·L−1；R1 为回流到厌氧区的第一污泥回流比。为量化SDR-AOA工艺各单元氮和磷的变化情况，应用物料平衡分析方法，对各单元氮磷的去除情况进行计算，计算公式如下。
式中：
ΔMan 、ΔMo 、ΔMd 和ΔMs 为厌氧段、好氧段、缺氧段和二沉池物料变化，g·d−1;Si 、Se 、San 、So 和Sd 为进水、出水、厌氧末、好氧末、缺氧末氮磷质量浓度，mg·L−1；Q为进水流量，m3·d−1；R1为回流到厌氧区的第一污泥回流比；R2为回流到缺氧区的第二污泥回流比。 -
1) 对COD的去除效果。中试实验阶段对COD的去除效果见图2。由图可知，phase2增设第二污泥回流后，COD去除率较phase1有所提升。phase1进水COD平均为177.28 mg·L−1，出水COD平均为33 mg·L−1，平均去除率81.4%；phase2进水COD平均为156.36 mg·L−1，出水COD平均为17.54 mg·L−1，平均去除率88.8%。
2) 对NH4+-N和TN的去除效果。中试实验阶段对NH4+-N和TN去除效果见图3。由图3可见，无第二污泥回流时 (phase1) 出水NH4+-N质量浓度高于设置第二污泥回流时 (phase2)；phase1出水NH4+-N质量浓度平均值为1.58 mg·L−1，平均去除率为94.0%；phase2出水NH4+-N质量浓度平均值为0.86 mg·L−1，平均去除率为96.3%。phase1出水TN质量浓度平均值为5.14 mg·L−1，TN平均去除率为82.3%，最低值至78.0%；phase2设置第二污泥回流后，TN去除率上升且保持平稳，TN平均去除率达85.8%，出水TN稳定小于5 mg·L−1，平均值仅为3.45 mg·L−1。可见，SDR-AOA工艺较AOA工艺强化了脱氮效果。
3) 对TP的去除效果。中试实验阶段对TP的去除效果见图4，由图可见，增加了第二污泥回流后 (phase2)，TP去除率逐渐提升。无第二污泥回流时 (phase1)，平均出水TP质量浓度0.72 mg·L−1，TP平均去除率只有78.4%；而phase2出水TP质量浓度平均降低至0.17 mg·L−1，可稳定满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》 (GB 18918-2002) 一级A标准，TP平均去除率高达94.1%。这说明SDR-AOA工艺除磷方面也有良好的效果。
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实验分析了phase1和phase2有代表性的2天 (第8 d和第28 d) 的COD、N和P质量浓度的沿程变化，见图5。
1) 系统脱氮过程分析。由图5可知，phase1和phase2，AOA工艺在厌氧初因回流污泥稀释作用，TN下降到进水的1/2左右，且在厌氧区主要以氨氮形式存在，说明回流污泥中的硝酸盐氮在厌氧初迅速被反硝化去除；在好氧段，氨氮逐渐被氧化成硝酸盐，好氧末几乎全部转化成硝酸盐氮，亚硝酸盐氮含量较低，可见在本系统中主要以全程硝化反应为主。这点不同于ZHANG等[14]和GAO等[15]对SDR-AOA工艺的小试研究结果，其在好氧段实现了稳定的短程硝化反应。这主要是因为短程硝化影响因素较多且不易控制，在大规模工程应用中难以稳定实现[17]。实验系统在缺氧段，因硝态氮被反硝化，TN有明显去除，但phase1和phase2 硝态氮的去除效果有明显不同。phase1，NO3−-N质量浓度由好氧末11.7 mg·L−1到缺氧末下降到3.3 mg·L−1 (图5(a)) ；phase2，NO3−-N质量浓度由好氧末11.3 mg·L−1到缺氧末下降到1.4 mg·L−1 (图5(b)) 。可见，设置第二污泥回流后系统在缺氧段的反硝化效果显著提升，这主要是与缺氧区污泥浓度增大有关。值得注意的是，phase1在缺氧末的亚硝酸盐积累质量浓度较phase2要高，主要是因为phase1碳源的缺乏造成缺氧末短程内源反硝化比例增大。由图5中COD的沿程变化可见，COD的去除主要发生在厌氧区和好氧区，且以厌氧区去除为主；经计算，phase1和phase2好氧末到出水COD分别去除0.4 kg∙d−1和1.6 kg∙d−1，而phase1和phase2从好氧末到出水用于反硝化的COD理论需求量分别为4.1 kg∙d−1和5.5 kg∙d−1，可见外源COD的减少远远不足以提供反硝化COD需求量，说明反硝化利用的碳源主要来自于污泥内碳源。
另外，phase1和phase2在TN变化趋势上不同的一点是，phase1在二沉池TN有小幅地回升，由图5(a)可知主要是因为NH4+-N质量浓度的回升所致。phase1，NH4+-N质量浓度由缺氧初0 mg·L−1到缺氧末提升到0.5 mg·L−1，到二沉池出水提升到1.52 mg·L−1；而在phase2，NH4+-N质量浓度在缺氧段和二沉池保持平稳。可能的原因为在取消第二污泥回流时，缺氧区污泥浓度低，可利用的内碳源少，污泥处在饥饿状态，且污泥在缺氧池和二沉池的缺氧环境停留时间较长，加之中试所在地海口水温较高，容易发生污泥自身水解，释出NH4+-N[18-19]。而设置第二污泥回流后，加速了污泥的循环，可避免污泥因长期处于底物匮乏的厌氧状态而发生水解，保证了NH4+-N和TN良好的出水效果。
根据物料平衡计算公式，可计算出厌氧段、缺氧段、好氧段、二沉池去除TN量，进一步可计算出各阶段TN去除量占进水TN的比例，因好氧段和二沉池对TN去除影响较小，故将两者合并，结果见图6。从各单元对TN去除的贡献率可见，缺氧段对TN去除贡献率最大，厌氧段其次。phase2缺氧段去除TN贡献率较phase1大幅提升，缺氧段TN去除量占进水TN的比例由44.7% (phase1) 提升到73.9% (phase2)，提高了65.18%。可见，SDR-AOA工艺强化缺氧内源反硝化效果显著，这也是TN去除率提升的主要原因。
2) 缺氧区脱氮负荷、比反硝化速率和内碳源转化率。缺氧区NOX-N去除容积负荷 (以下简称脱氮负荷) 可直接反映缺氧区脱氮效果，脱氮负荷与比内源反硝化速率直接相关，而内碳源转化率是比反硝化速率的重要因素之一 [15]。因此，对phase1和phase2缺氧区脱氮负荷、比反硝化速率和内碳源转化率进行测算，结果见表3。由表3可知，phase2设置第二污泥回流后比反硝化速率有所上升，是phase1的1.07倍；而另一方面，设置第二污泥回流后缺氧区的污泥浓度提高，MLSS均值是phase1的1.17倍，则phase2缺氧区反硝化菌群的数量较phase1更多；比反硝化速率和反硝化菌群数量的提高使得系统的脱氮负荷升高。由表3可知，phase2的脱氮负荷明显高于phase1，phase1缺氧区的脱氮负荷平均值为0.070 kgN·(m−3·d−1)，phase2的脱氮负荷平均值提升至0.086 kgN·(m−3·d−1)，较phase1提升了22.8%。GAO等[15]的研究结果表明，以NO2−-N为电子受体的脱氮负荷是以NO3−-N为电子受体时的2.2倍，其实验过程短程硝化亚硝盐氮积累率94%左右时，脱氮负荷达0.17 kgN/(m−3·d−1)。约是本研究中脱氮负荷的2倍，而本研究则主要是以NO3−-N为电子受体，与其研究结果相符。
为进一步探究污泥浓度对内源反硝化的影响，开展了批次实验，结果见图7。在起始硝酸盐质量浓度相同时，随着MLSS的升高，比反硝化速率也逐渐升高，当MLSS由3634升高到10521 mg·L−1时，比反硝化速率由0.0167 kgN·(kg−1VSS·d−1)升高到0.0204 kgN·(kg−1VSS·d−1)，即提升至1.22倍，这与王少坡等的研究结果相似[20]。而系统的脱氮负荷计算是比反硝化速率与MLVSS的乘积，因此，当MLSS由3634 mg·L−1升高到10521mg·L−1时，脱氮负荷提升至3.67倍。经线性拟合，脱氮负荷与污泥浓度呈正相关 (R2=0.9881)。根据ZHANG等[14]的研究结果，SDR-AOA系统二沉池污泥有高含量的PHA和Gly。因此，二沉池回流到缺氧池的污泥既增加了缺氧池反硝化菌数量，也补充了更多的内碳源，两者共同作用，使脱氮负荷提升。
另外，缺氧区内碳源的另一主要来源为厌氧区内碳源的储存量，内碳源转化率体现了微生物在厌氧区内碳源储存量的多少。由表3可见，内碳源转化率在phase2高于phase1，平均值由90%提升到94%。内碳源转化率与厌氧区COD的总利用量和用于反硝化的COD相关。在进水稳定、厌氧区停留时间和污泥浓度稳定的情况下，厌氧区COD的总利用量相对稳定，则用于反硝化的COD决定了内碳源转化率。phase2设置第二污泥回流后，脱氮负荷提升，出水硝态氮质量浓度降低，在厌氧区因还原污泥回流液携带的硝态氮而被利用的外碳源也随之减少，进而促进了有机物转化为内碳源。由图5可知，phase1出水NO3−-N质量浓度3.8 mg·L−1，NO2−-N质量浓度1.2 mg·L−1，而phase2出水硝态氮质量浓度降低，NO3−-N质量浓度仅为1.38 mg·L−1，NO2−-N质量浓度0.7 mg·L−1，会使得phase2在厌氧区因反硝化消耗的COD减少。虽然phase2进水的NO3−-N质量浓度较phase1低1.67 mg·L−1，因进水差异在厌氧区会较phase1少消耗一部分COD，但显然phase2由于出水硝态氮质量浓度降低而引起的COD消耗减少作用更大。可见，设置第二污泥回流促进了内碳源转化率提升。而内碳源转化率的提升会进一步提升缺氧段的脱氮负荷。内碳源转化率和内源脱氮负荷两者相互促进，系统形成良性循环。
3) 系统除磷过程分析。由图5可知，phase1和phase2的除磷过程主要发生在好氧段。由图5(a)可知，phase1进水TP质量浓度3.10 mg·L−1，厌氧段释磷后TP质量浓度升至3.45 mg·L−1，好氧段吸磷后TP质量浓度下降至0.43 mg·L−1，在缺氧末端和二沉池TP质量浓度却有小幅回升，升至0.9 mg·L−1。由图5(b)可知，phase2进水TP质量浓度3.48 mg·L−1，厌氧段释磷后TP质量浓度升至4.20 mg·L−1，好氧段吸磷后TP质量浓度下降至0.52 mg·L−1，在缺氧段TP质量浓度继续下降至0.10 mg·L−1。phase2在缺氧段发生了吸磷现象，说明系统中反硝化聚磷菌 (DPAOs) 发挥了作用[21]。研究表明，富磷污泥的释磷机制主要有2种：一种是聚磷菌利用体内聚磷释放时的能量吸收有机物合成PHA的生物释磷机制；另一种是污泥水解或细菌解体释磷机制。通常这两种情况都存在[22]。但推测phase1的释磷应以污泥水解或细菌解体释磷机制为主，因为phase1中缺氧末和二沉池中的硝酸盐会抑制生物释磷，且缺乏可直接利用的碳源。phase1，无第二污泥回流时，缺氧区内碳源量较少，且在缺氧区和二沉池实际停留时间较长。若细菌处于底物匮乏的时间较长，内碳源消耗完后易导致聚磷菌的过分衰减引起Poly-P释放或污泥自身水解、死亡解体等[19,23]。phase2，第二污泥回流的设置，加快了系统的循环且补充了缺氧区内碳源，避免了缺氧区释磷，使得DPAOs有效发挥作用。
根据物料平衡计算公式，可计算出各单元磷的变化量，结果见图8。虽然两者进水TP质量浓度相差不大 (3.10和3.48 mg·L−1) ，但phase2厌氧段释磷量显著高于phase1，是phase1释磷量的1.7倍。这是因为phase2脱氮效果更佳，回流到厌氧池的NO3−-N较少，厌氧段脱氮与除磷对碳源竞争较弱，PAOs可以吸收更多碳源并释磷，从而提供更足的除磷动力。phase2在好氧段的吸磷量也高于phase1。值得关注的是，phase2反硝化吸磷量占总吸磷量的比例达10.4%，在phase2实现好氧吸磷和缺氧反硝化吸磷协同作用，强化了系统除磷效果。
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通过高通量测序技术对phase2运行后期系统的活性污泥进行微生物多样性分析，属水平上主要功能菌的相对丰度如图9所示。Candidatus_Competibacter和Defluviicoccus已被证明是可利用内碳源的反硝化聚糖菌 (DGAOs)[24]，两者相对丰度分别为3.42%和0.51%，其中Candidatus_Competibacter菌属的丰度显著高于系统中的其他菌属成为优势菌。系统中聚磷菌 (PAOs) 有Tetrasphaera、Dechloromonas和Candidatus_Accumulibacter，其中Tetrasphaera丰度最高为0.5%。Tetrasphaera可以通过降解大分子有机物进行发酵除磷，具有更加稳定高效的除磷性能[25]。Dechloromonas和Candidatus_Accumulibacter被证明具有反硝化除磷功能[26-27]，两者的存在是系统缺氧区除磷的原因。系统中还存在Ottowia、Rhodoplanes、Haliangium等多种普通反硝化菌 (DNB)[13,28-29]，辅助内源反硝化菌共同脱氮。Nitrospira为亚硝酸氧化菌 (NOB)[28]，其丰度为0.23%，氨氧化菌 (AOB)检出两个菌属，分别为Ellin6067和Nitrosomonas[28]，其丰度分别为0.83%和0.03%。
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本研究的SDR-AOA工艺通过设置二沉池到缺氧区的第二污泥回流强化脱氮除磷效果，在百吨级中试中TN、TP平均去除率分别达85.8%和94.1%。与GAO等[15]在SDR-AOA小试研究中97.7%的TN去除率相比有所降低，这主要是因为在本文的放大中试中未实现稳定、高水平亚硝酸盐积累率的短程硝化现象。众所周知，短程硝化影响因素复杂，在大规模市政污水处理工程中难以稳定实现，但是，本研究的SDR-AOA工艺在全程硝化反硝化为主的情况下依然实现了高效的脱氮除磷效果。本文中试所在水厂采用A2/O工艺，与本研究相同进水条件下二级生物处理工艺TN、TP平均去除率为61.2%和85.2%，可见本研究SDR-AOA工艺脱氮除磷效果优于A2/O工艺。对于A2/O类前置反硝化工艺若要达到与SDR-AOA中试相同的TN去除率，理论上需要内外总回流比达到600%。而总回流比为400%时，再增加回流比，对脱氮效果的提高不大。总回流比过大，会使系统由推流式趋于完全混合式，导致污泥性状变差；在进水质量浓度较低时，会使缺氧区/池氧化还原电位ORP升高，导致反硝化速率降低。因此，SDR-AOA工艺可实现前置反硝化类工艺难以实现的深度脱氮效果。此外，中试SDR-AOA工艺好氧停留时间仅为2.7 h，较所在地污水处理厂A2/O工艺 (6.7 h)大幅缩短，SDR-AOA工艺占地与对照水厂A2O工艺占地降低约25%。中试SDR-AOA工艺平均吨水曝气电耗为0.062 kW·h，约是对照水厂A2O工艺吨水曝气电耗的80%。较常规A2/O工艺，SDR-AOA工艺无大比例的硝化液回流，无外碳源投加，即可保障出水TN小于8.0 mg·L−1。该工艺具有高效脱氮除磷和节能降耗的优势，在处理低C/N污水或深度脱氮要求的应用场景十分具有推广价值。
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1) 建立了处理规模为100 m3·d−1的SDR-AOA中试系统考察工艺处理效果，并对比了无第二污泥回流时的AOA工艺处理效果。结果表明，工艺设置第二污泥回流时，处理效果显著优于无第二污泥回流时，COD、NH4+-N、TN、TP平均去除率分别达88.8%，96.3%，85.8%，94.1%，说明SDR-AOA工艺通过设置第二污泥回流有效地强化了脱氮除磷效果，具有推广应用价值。
2) 内源脱氮负荷与污泥浓度呈正相关，第二污泥回流提高了缺氧区MLSS，进而提升比反硝化速率和内碳源转化率；其中，无第二污泥回流时，系统缺氧区脱氮负荷为0.070 kgN·(m−3·d−1)，第二污泥回流比100%时，提升至0.086 kgN·(m−3·d−1)，表明污泥双回流的设计可有效促进生化系统脱氮效率。
3) SDR-AOA工艺设置第二污泥回流可有效避免系统在缺氧末和二沉池的NH4+-N和TP质量浓度小幅回升，保证系统高效脱氮除磷。
4) 高通量测序结果表明，属于DGAOs的Candidatus_Competibacter为系统的优势菌属。
污泥双回流-AOA中试系统处理低C/N城镇污水的脱氮除磷性能
Nitrogen and phosphorus removal performance on pilot-scale Sludge Double Recirculation-AOA system in treating low C/N municipal wastewater
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摘要: 为解决低C/N污水脱氮除磷难题，建立了基于污泥双回流-AOA新工艺的中试系统来处理低C/N城镇污水，处理规模为100 m3·d−1，考察了系统对COD和氮磷的处理效果，并对比了无第二污泥回流时的AOA工艺处理效果，分析了设置第二污泥回流的优势。结果表明，污泥双回流-AOA工艺污水处理效果显著优于无第二污泥回流时的AOA工艺，COD、NH4+-N、TN、TP平均去除率分别达88.8%，96.3%，85.8%，94.1%。内源反硝化批次实验表明，内源脱氮负荷与污泥浓度呈正相关。设置第二污泥回流，提高了缺氧区MLSS，缺氧段比反硝化速率和内碳源转化率均提升，缺氧区脱氮负荷提高，促进系统TN去除率提高；系统第二污泥回流比100%时，缺氧区脱氮负荷为0.086 kgN·(m-3·d−1)。此外，设置第二污泥回流可有效避免系统在缺氧末和二沉池NH4+-N和TP质量浓度小幅回升。高通量测序结果表明，属于反硝化聚糖菌 (DGAOs) 的Candidatus_Competibacter为系统的优势菌属。本研究结果可为污泥双回流-AOA新工艺实现高效脱氮除磷提供参考。
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关键词:
- 污泥双回流-AOA工艺 /
- 低C/N /
- 内源反硝化 /
- 脱氮除磷 /
- 反硝化除磷
Abstract: To address the challenging issue of nitrogen and phosphorus removal from low C/N sewage, a pilot system of the innovative Sludge Double Recirculation-AOA (SDR-AOA) process was established to treat low C/N municipal wastewater at a treatment scale of 100 m3·d−1. The study investigated the removal effect of COD, nitrogen, and phosphorus, and compared the treatment effect of the AOA process without the second sludge recirculation to analyze the advantages of setting up the second sludge recirculation in the SDR-AOA process. The results indicated that the SDR-AOA process was significantly more effective than the AOA process without the second sludge recirculation, with average removal rates of COD, NH4+-N, TN, and TP at 88.8%, 96.3%, 85.8%, and 94.1%, respectively. The experiment on endogenous denitrification rate demonstrated a positive correlation between the endogenous denitrification rate and the sludge concentration. The second sludge recirculation improved the MLSS in the anoxic zone, resulting in an increase in both the specific denitrification rate and intracellular carbon storage efficiency, which increased the nitrogen removal load of the anoxic zone to promote TN removal of the system. When the ratio of the second sludge recirculation was 100%, the nitrogen removal load of the anoxic zone was 0.086 kgN·(m-3·d−1). Additionally, the second sludge recirculation effectively prevented the slight rise of NH4+-N and TP mass concentration at the end of the anoxic zone and secondary sedimentation tank. High-throughput sequencing revealed that Candidatus_Competibacter, belonging to denitrifying glycogen accumulating organisms (DGAOs), was the dominant genus in the system. The results of this study can provide a reference for efficient nitrogen and phosphorus removal by a novel SDR-AOA process. -
已有研究[1-2]表明，生活污水中包含一定量的潜在致病微生物(大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)。因此，在污水处理系统末端需增加消毒，处理达标之后方可排放。近2年，随着新冠疫情的全球肆虐，不同层面的生物安全问题受到了广泛关注。我国于2021年4月15日起全面实施《生物安全法》，标志着我国生物安全问题进入了依法治理的新阶段[3]。目前，我国现行城市污水生物处理过程中已全部覆盖消毒工艺。但是，对于卫生设施相对薄弱的农村地区，污水中潜在致病微生物的分布、相应污水处理设施的消毒效果等仍存在认识不清、运维不稳等问题，从而对农村地区居民身体健康及区域生态安全造成了极大的潜在风险。
截至2020年，全国共有约5.1亿农村人口，占全国总人口的36%，生活污水排放量很大，而目前针对已有农村污水处理设施的监测重点仍然为COD、NH3-N、TP等基础水质排放控制指标[4-5]。农村生活污水主要来源于厨房污水、生活洗涤污水和冲厕水等，其具有分散性强、水质水量变化大等特点；同时，我国农村区域相对城市而言，经济水平比较低。因此，成本低廉、高度集成、占地面积较小、施工工程量小、运行维护简便的小型化、装备化污水处理设施在农村地区得到广泛应用，净化槽即是其中一种[6-10]。基于其在单户或联用处理中的优势，目前净化槽已经在上海、江苏、云南、山东、黑龙江等地多数农村投入实际使用[11]。调研发现，目前市场上销售的净化槽在工艺单元是配有消毒设施的。但在实际运用中，由于消毒工艺投入成本高，投入的化学消毒试剂如次氯酸钠等在维护不当时可能会造成泄露而引起二次污染，因此，大部分农村地区一体化污水处理设备的消毒设施处于闲置状态，农村污水处理后，未经消毒就直接排放[10]。基于以上研究现状，本研究选取江苏省常熟市虞山街道(N 120°40′48″，E 31°40′48″)处理量为1 m3·d−1的一体化污水处理设施，解析不同工段潜在致病微生物的分布特征，为后续村镇小型污水处理设施运行过程中的健康风险评估研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 设备简介
本研究选择江苏省常熟市虞山街道(N 120°4′48″，E 31°40′48″)处理量为1 m3·d−1的一体化污水净化槽(HJA-10，江苏中车环保设备有限公司；长×宽×高=2 190 mm×1 120 mm×1 550 mm)进行研究。净化槽采用A/O处理工艺，主要由夹杂物去除槽-厌氧滤床槽-载体流动槽-沉淀槽-消毒槽处理单元组成(图1)。其中厌氧滤床槽采用PE滤料，载体流动槽即为加有曝气设施和圆球状填料的生物处理单元，消毒槽设定为添加三氯异氰尿酸消毒剂消毒。该村现有农户370多户，共计1 500余人，其中青年人(非假期外出务工、上学等)和老年人(长期在当地居住)的占比分别为60%和40%。净化槽主要收集处理村民家中排放的生活污水(厨房洗涤废水、洗漱用水、马桶废水等)，实际运行时，槽中污水依次经过夹杂物去除槽、厌氧滤床槽、载体流动槽和沉淀槽，载体流动槽出水处设有回流管，向夹杂物去除槽回流。
1.2 样品采集
样品按照《水质采样技术指导》( HJ 494-2009 ) 和《水质采样样品的保存和管理技术规定》( HJ 493-2009 ) 要求[12-13]，分别从净化槽进水口(A1)、夹杂物去除槽(A2)、厌氧滤床槽(A3)、载体流动槽(A4)、沉淀槽(A5)、出水口处(A6)、出水受纳水体(A7)，各采集1 L水样。采样容器材质为聚乙烯，容器采样前均进行灭菌处理，以满足采样需要。水样分别采集于夹杂物去除槽液面下0.8 m，厌氧滤床槽、载体流动槽、沉淀槽液面下0.3 m。各处理单元所采样品分成2份：1份于4 ℃保存，用于理化指标测定；另1份存于−20 ℃，用于微生物多样性分析。
1.3 理化指标测定
采用重铬酸钾法(HJ 828-2017)测定COD值[14]；采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)测定NH3-N浓度[15]；采用哈希法测定TN浓度；采用重量法(GB 11901-1989)测定SS浓度[16]。
1.4 16S rDNA高通量测序
利用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对 16S rRNA基因V3~V4 可变区进行 PCR 扩增[17-18]，产物纯化定量后通过Illumina Miseq平台进行测序。使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行聚类并剔除嵌合体，然后利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对数据库，设置比对阈值为70%，最终生成操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU) [19-21]。利用mothur进行微生物群落的α多样性分析，计算参数分别为Ace、Chao1、Shannon和Simpson指数。Ace和Chao1指数反映微生物种群丰度，其值越高表明微生物丰度越高；Shannon和Simpson指数反映微生物种群多样性，高Shannon指数和低Simpson指数代表高多样性，其数值受样品群落中丰度和物种均匀度的影响[22]。多样性指数根据式(1)~式(3)计算[23]。
SChao1=Sobs+n1(n1−1)2(n2+1) (1) 式中：SChao1表示估计的OTU数；Sobs表示实际测得OTU数；n1表示只含1条序列的OTU数；n2表示只含2条序列的OTU数。
DSimpson=Sobs∑i=1ni(ni−1)N(N−1) (2) 式中：Sobs表示实际测得OTU数；ni表示第i个OTU所含序列数；N表示所有序列数。
HShannon=−Sobs∑i=1niNlnniN (3) 式中：Sobs表示实际测得OTU数；ni表示第i个OTU所含序列数；N表示所有序列数。
2. 结果与讨论
2.1 一体化污水净化槽运行效果
对首次投入使用的一体化污水净化槽进行长期连续进出水水质监测，时间为200 d。结果如图2所示。运行期内，设备进水中COD值为27~537 mg·L−1，NH3-N和TN的质量浓度分别为13~174 mg·L−1和15~238 mg·L−1。50 d内，设备运行处于启动状态，COD去除效果较好， NH3-N和TN去除波动较大。随着设备的运行，在50 d后，其出水COD值稳定在(35.5±22.5) mg·L−1，NH3-N和TN的质量浓度稳定在(5±3) mg·L−1和(22±10) mg·L−1，表明该设备出水水质达到了《农村生活污水处理设施水污染物排放标准》(DB 32/ 3462-2020)[24]。
图 2 净化槽污水进、出水水质变化Figure 2. Changes of water quality of the influent and effluent in the the Johkasou在装置运行约100 d后，考察不同工段污水中NH3-N、SS质量浓度和COD值的沿程变化，结果如图3所示。沿设备运行工段流程，NH3-N、SS质量浓度和COD值均呈逐步下降趋势，NH3-N在A2、A3、A4、A5、A6单元的去除率分别为55.42%、67.47%、70.48%、92.77%、93.98%；SS在A2、A3、A4、A5、A6单元的去除率分别为54.35%、82.61%、86.30%、96.09%、96.52%；COD在A2、A3、A4、A5、A6单元的去除率分别为13.50%、32.43%、54.46%、89.19%、94.59%。以上结果表明，该设备处于长期稳定运行状态，并且不同处理单元对污染物的去除率有所不同。
图 3 污水处理过程主要污染物去除效率变化Figure 3. Changes in removal efficiency of key pollutants in wastewater treatment process2.2 一体化污水净化槽各处理单元中微生物群落多样性
采用高通量测序分别对不同处理单元中样本进行了细菌多样性分析，其中Ace和Chao1指数用来表征不同处理单元微生物种群丰度，Shannon和Simpson指数用来表征微生物种群多样性，具体结果如表1所示。由表1可以看出，A3单元Chao1和Ace值最高，分别为2 404.32和2 396.72；Shannon指数最高、Simpson指数最低，分别为5.49和0.01。在该设备中，A3单元中细菌不仅丰度最高，而且多样性也是最高的。这可能与本设备中污水的流程有密切的关系，污水经夹杂物去除槽后，首先进入厌氧滤床槽。因此，该单元有机物更为丰富，异养微生物快速繁殖，从而导致该单元细菌种类及丰度均相对较高。这一结果与前人研究结果存在一定的差异。黄潇等[22]发现，当采用多级A/O工艺处理城市污水时，最高的Shannon和Simpson指数出现在第2好氧区，这可能与工艺流程和污水来源的差异有关。
表 1 不同处理单元微生物群落丰度和多样性Table 1. Microbial community abundance and diversity in different treatment units处理单元 Ace Chao1 覆盖率/% Shannon Simpson A1 1 252.21 1 025.01 99.30 2.25 0.26 A2 1 986.92 1 965.48 98.93 4.13 0.15 A3 2 396.72 2 404.32 98.75 5.49 0.01 A4 2 260.19 2 221.75 98.95 5.01 0.02 A5 1 910.35 1 841.82 99.16 4.92 0.02 A6 2 029.49 1 981.27 98.68 5.06 0.03 | Show Table
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2.3 一体化污水净化槽各处理单元中的种群结构
进一步分析受纳水体和设备运行稳定状态下不同单元中细菌种群结构特征，其差异如图4所示。在门水平上，进水中Proteobacteria和Firmicutes是优势菌门，其相对丰度分别为56.21%和37.65%。随着污水流经各处理单元，这2个菌门虽然仍然处于优势地位，但其相对丰度却逐步下降。由图4可见，由A2到A5，Proteobacteria相对丰度分别为48.00%、45.33%、44.58%和41.47%。Proteobacteria在各单元中检测片段数基本不变，在A2~A5单元相对丰度降低是由于各单元其他菌门种类和丰度的增加。由A2到A5，Firmicutes相对丰度分别为15.04%、6.14%、5.21%和5.27%。A2单元Firmicutes相对丰度下降主要是由其门下Chryseomicrobium属相对丰度急降所导致；在A3~A5单元，Firmicutes所测片段数基本不变，其相对丰度变小是由各单元其他菌门种类和丰度的增加所导致。在出水中，检测到的细菌总片段变少，导致Proteobacteria相对丰度增高，此时Firmicutes门下梭菌纲丰度上升是导致Firmicutes相对丰度上升的主要原因，梭菌纲适合在氧气浓度相对较低的出水中繁殖。同时，图4中的结果也表明，进水中Bacteroidota相对丰度较低，为1.08%，但在各单元中Bacteroidota相对丰度呈现逐步升高趋势，尤其是在A4和A5单元，其相对丰度分别可达31.43%和37.42%，这与已有研究结果基本一致 [25-26]。Bacteroidota相对丰度变化主要由其门下Flavobacterium属相对丰度变化引起，Flavobacterium是一种好氧反硝化细菌，适合在含氮物质和氧气含量充足的环境中生存。 本研究中，净化槽消毒单元处于关闭状态，因此，出水中检出的细菌多样性也较高，Proteobacteria仍是优势菌门，其相对丰度为53.41%，Firmicutes、Bacteroidota、Patescibacteria、Actinobacteriota的相对丰度也分别达到了11.31%、11.73%、11.86%、4.68%。与净化槽出水相似，排水口处受纳水体中Proteobacteria也是优势菌门，相对丰度为89.09%，且Patescibacteria、Actinobacteriota相对丰度则显著降低，这可能是由受纳水体中微生物相互作用导致的。
图 4 污水处理过程和受纳水体中细菌相对在门水平的丰度变化Figure 4. Changes in the relative abundance of bacteria at Phylum level during wastewater treatment and in receiving water为了更加准确地反映净化槽不同单元和受纳水体中细菌的组成，对所选样本中细菌种群特征进行了属水平上的分析。结果如图5所示，进水中细菌种群相对简单，其中优势菌属为Paracoccus(43.31%)、Chryseomicrobium(26.00%)、Trichococcus(6.60%)和Pseudomonas(5.00%)。同样在有夹杂物的去除槽内，其细菌种群相对也较为简单，不同之处在于其优势菌属发生了明显变化，分别为Acinetobacter(38.70%)、norank_f__norank_o__norank_c__Gracilibacteria(7.54%)和Romboutsia(3.48%)。其原因可能是，在物理去除污水中较大颗粒物的同时，附着在颗粒物上的细菌也一并被去除，从而导致其优势菌属种类发生了变化。与其形成明显对比的是，A3、A4、A5单元中细菌菌属多样性明显增加，并且该3个单元中细菌相似性明显升高。除无法鉴定种类的others之外，A3单元中主要细菌菌属分别为Acinetobacter(6.38%)、norank_f__norank_o__Saccharimonadales(5.11%)、Pseudorhodobacter(4.52%)、Flavobacterium(2.85%)、Pseudomonas(1.29%)等。在A4、A5单元里，这些细菌菌属种类并未发生明显变化，但其相对丰度呈现一定差异。在A3、A4、A5单元中，Flavobacterium相对丰度呈现逐步上升趋势，分别为2.85%、18.12%、23.19%。Flavobacterium是活性污泥工艺的常见的好氧反硝化菌[27]，适合在含氮物质和氧气含量充足的A4、A5单元中生存，A3单元的厌氧环境并不适合其生存。在A3、A4、A5单元中，Acinetobacter相对丰度呈现逐步下降趋势，分别为6.38%、3.95%、0.57%。Acinetobacter是水处理过程中常见的异养硝化-好氧反硝化细菌[28]，所以在有机物质量浓度相对较低的A4、A5单元中并不利于其生长，导致其相对丰度下降。在A3、A4、A5单元中，Pseudomonas相对丰度呈现逐步下降趋势，分别为1.29%、0.83%、0.72%。有研究[29]表明，在人工湿地等脱氮除磷工艺中发现了参与有机物去除的Pseudomonas，因此，对于有机物质量浓度相对较低的A4、A5单元，Pseudomonas相对丰度可能会有所下降。与出水相比，受纳水体细菌组成出现显著变化，其中C39和Pseudomonas为主要的优势菌属，相对丰度分别为67.61%、10.21%，二者总相对丰度超过75%。
图 5 污水处理过程和受纳水体中细菌在属水平的相对丰度变化Figure 5. Changes in the relative abundance of bacteria at Genus level during wastewater treatment and in receiving water2.4 一体化污水净化槽各处理单元中潜在致病细菌种群特征
进一步深入分析本研究中一体化污水净化槽各处理单元的细菌特征，结果发现，其检出的潜在人致病性细菌种类丰富，并且各个单元的种类及含量也存在一定差异。进水中共检测到16种潜在致病细菌属， 而出水中则检出了20种潜在致病细菌属。有研究[30-39]表明，出水中检出的相对丰度较高的Klebsiella、Aeromonas、Arcobacter、Neochlamydia、Clostridium_sensu_stricto_10、Mycobacterium、Pseudomonas、Bacteroides、Acinetobacter和Flavobacterium均对人体存在潜在危害。Aeromonas hydrophila普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻[30]；Klebsiella pneumoniae是人类呼吸道和肠道的常居菌，可引起下呼吸道、血液、泌尿道、消化道、手术切口、颅内、皮肤软组织等多个部位感染[31]；Arcobacter skirrowii与人类和动物的腹泻、菌血症等疾病密切相关[32]；属于易引起疾病衣原体目的Neochlamydia，对人体健康也存在潜在威胁[33]；Mycobacterium tuberculosis可引起人体结核病，一种传染性疾病，主要是通过呼吸道传播，以肺结核为最多见[34]；Pseudomonas aeruginosa为假单胞菌属中最为常见的一种机会致病菌，常可引起尿路感染、烧伤创面及褥疮感染、败血症和肺部感染等[35]；Bacteroides fragilis系革兰阴性厌氧菌，由于其具有黏附性、血细胞凝集素、多糖胶囊、菌毛等多种毒力因素，在拟杆菌属中致病性最强，其可引起腹腔感染、术后伤口感染、糖尿病足感染、菌血症等[36]；Acinetobacter bamnannii是我国医院感染最主要的致病菌之一，该菌最常引起的感染为下呼吸道感染，尤其为呼吸机相关性肺炎，其次为血流感染[37]；Clostridium perfringens广泛存在于自然界及人和动物的肠道中，是近年来我国家畜“猝死症”的主要病因，可引起气性坏疽和食物中毒的主要病原菌坏死性肠炎[38]；Flavobacterium可引起肺炎，也可招致脑膜炎、败血症等感染，该菌会在机体免疫力下降时引起感染[39]。以上结果表明，当污水生物处理设施末端出水不经消毒处理时，其出水中潜在致病微生物的危害可能存在升高趋势。本研究选取了9种对人体危害性较大的致病细菌，对其在不同单元中的相对丰度变化进行了分析，结果如图6所示。不同致病细菌的变化趋势各有差异，总体可分为以下3类。
图 6 水处理过程中潜在致病菌相对丰度变化Figure 6. Changes in the relative abundance of potential pathogenic bacteria during water treatment第1种为进水中相对丰度较低，但在设备不同单元随着污水流向相对丰度逐步呈升高趋势。Aeromonas和 Klebsiella在进水中几乎未检出，但在A2、A3、A4、A5、A6的相对丰度则分别升高至0.007 4%和0.002 5%、0.15%和0.004 5%、0.066%和0.001 9%、0.37%和0.005 9%、1.26%和0.70%。Arcobacter (0.01%)和Bacteroides(0.21%)在进水中有少量检出，但在不同单元中也均呈现上升趋势，A2、A3、A4、A5、A6的相对丰度分别为0.064%和0.80%、0.047%和0.34%、0.068%和1.06%、0.069%和1.22%、0.24%和2.63%。这可能是因为Aeromonas、Klebsiella、Arcobacter、Bacteroides、Pseudomonas等菌属细菌是活性污泥中大量存在且具有降解有机污染物功能的菌属[24,29,40]。因此，相对进水而言，后续各处理单元中这些细菌的相对丰度呈现出上升趋势。
第2种为进水中相对丰度较低，但在整个水处理过程中其相对丰度呈现先上升后下降趋势。Mycobacterium(0.04%)和Neochlamydia(0.02%)在A2、A3、A4、A5、A6的相对丰度分别为0.35%和0.045%、0.78%和0.54%、0.47%和0.24%、0.41%和0.39%、0.27%和0.26%。这2种致病细菌丰度的最大值均在A3单元，可能是由于这2种细菌均属于厌氧菌，当溶解氧浓度较高时会抑制其活性，甚至会影响其生存。同样，Flavobacterium (0.04%)在A2、A3、A4、A5、A6的相对丰度也呈现出先上升后下降趋势，分别为0.10%、2.85%、18.12%、23.18%、1.32%，但下降点在A5单元，这可能因为Flavobacterium同时是一种好氧反硝化细菌[24]，在氮物质、有机物含量相对较低环境中会影响其繁殖，导致其相对丰度下降。
第3种为进水中相对丰度较低，但在整个水处理过程中呈现先上升后下降再上升趋势。Clostridium_sensu_stricto_10在进水中的相对丰度为0.06%，而在设备其他处理单元的相对丰度分别为A2(1.30%)、A3(0.85%)、A4(0.30%)、A5(0.31%)、A6(1.84%)，其相对丰度的峰值分别在A2和A6中。高通量测序结果显示，各单元检测总片段分别为38 979、40 364、44 672、51 735、50 945、36 408。分析高通量测序结果表明，A1、A2、A3、A4、A5和A6单元中Clostridium_sensu_stricto_10的核酸检出片段量分别为23、525、378、154、159、669。造成这种现象的原因可能是：在功能单元中功能菌种类和相对含量增大，而Clostridium_sensu_stricto_10较功能菌对营养物质的竞争力较小，导致相对丰度下降，但具体原因需要进一步开展研究。以上分析结果表明，无论那种类型变化趋势，其设备出水中均包含一定量的潜在致病性细菌。
3. 结论
1)所研究的一体化污水净化槽设施处理农村生活污水时，不同处理单元细菌中群结构呈现一定差异，尤其是进水、夹杂物去除槽和后续生化处理单元之间。出水中也包含多样性丰富的细菌。
2)本研究在一体化污水净化槽中共检出21种潜在致病细菌，以Flavobacterium、Pseudomonas等为主。值得注意的是，在其出水中存在20种潜在致病细菌，并且有9种优势潜在致病细菌的相对丰度较进水存在明显升高现象。
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图 5 phase1和phase2 COD、N和P质量浓度的沿程变化
Figure 5. Variations of COD、N and P concentrations along the process in phase1 and phase2
图 6 phase1和phase2 TN在各反应段去除分布
Figure 6. Distribution of TN loss in different zones in phase1 and phase2
图 7 MLSS对脱氮负荷和比反硝化速率的影响
Figure 7. Effect of MLSS on Nitrogen removal load and specific denitrification rate
图 8 phase1和phase2 TP在各反应段去除分布
Figure 8. Distribution of TP loss in different zones in phase1 and phase2
图 9 phase2活性污泥中主要功能菌属相对丰度
Figure 9. Relative abundance of functional bacteria in phase2 activated sludge
表 1 进水水质特征
Table 1. Characteristics of influent quality
mg·L−1 检测项目 范围 平均值 COD 143~216 164.5 NH4+-N 20.01~28.68 24.53 TN 20.38~30.4 26.18 TP 2.14~4.52 3.05
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表 2 中试运行条件
Table 2. Operational conditions of the pilot scale test
参数 phase1 phase2 时间/d 1~13 14~30 第一污泥回流比R1/% 100 100 第二污泥回流比R2/% 0 100 进水量Q/(m3·d−1) 100 100 HRT/h 10.8 10.8 好氧池末端DO/(mg·L−1) 2 2 好氧区MLSS/(mg·L−1) 4 707±768 4 787±446 温度/ ℃ 26~30 26~30
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表 3 phase1和phase2缺氧段脱氮负荷、比反硝化速率、内碳源转化率和MLSS
Table 3. Nitrogen removal load, specific denitrification rate, intracellular carbon storage efficiency and MLSS
参数 phase1 (均值) phase2 (均值) 脱氮负荷/kgN·(m−3·d−1) 0.070±0.006 0.086±0.010 比反硝化速率/kgN·(kg−1VSS·d−1) 0.030±0.002 0.032±0.005 CODintra/% 90%±2% 94%±3% MLSS/mg·L−1 4707±798 5516±732
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