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人工湿地处理含盐富营养化水的植物根际与非根际菌群分析

王芬, 段洪利, 刘亚飞, 王天弋. 人工湿地处理含盐富营养化水的植物根际与非根际菌群分析[J]. 环境工程学报, 2020, 14(7): 1844-1851. doi: 10.12030/j.cjee.201909029
引用本文: 王芬, 段洪利, 刘亚飞, 王天弋. 人工湿地处理含盐富营养化水的植物根际与非根际菌群分析[J]. 环境工程学报, 2020, 14(7): 1844-1851. doi: 10.12030/j.cjee.201909029
WANG Fen, DUAN Hongli, LIU Yafei, WANG Tianyi. Analysis of bacterial community at the rhizosphere and non-rhizosphere of plants in constructed wetland treating brackish eutrophic water[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(7): 1844-1851. doi: 10.12030/j.cjee.201909029
Citation: WANG Fen, DUAN Hongli, LIU Yafei, WANG Tianyi. Analysis of bacterial community at the rhizosphere and non-rhizosphere of plants in constructed wetland treating brackish eutrophic water[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(7): 1844-1851. doi: 10.12030/j.cjee.201909029

人工湿地处理含盐富营养化水的植物根际与非根际菌群分析

    作者简介: 王芬(1979—),女,博士,副教授。研究方向:人工湿地处理技术。E-mail:wangfen@tju.edu.cn
    通讯作者: 王芬, E-mail: wangfen@tju.edu.cn
  • 基金项目:
    国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07106)
  • 中图分类号: X52

Analysis of bacterial community at the rhizosphere and non-rhizosphere of plants in constructed wetland treating brackish eutrophic water

    Corresponding author: WANG Fen, wangfen@tju.edu.cn
  • 摘要: 为了探究盐胁迫对于人工湿地植物根际与非根际微生态环境的影响,将垂直流人工湿地应用于含盐富营养化水体处理,考察了0.05%、0.50%和1.00%盐度水平下的脱氮效果,并采用高通量测序方法分析湿地植物千屈菜根际与非根际的菌群变化。结果表明:在0.50%和1.00%盐胁迫下,系统的硝化作用受到抑制;然而在各盐度水平下,NO3-N的去除率均大于95%,盐度胁迫下反硝化菌更能适应环境。对人工湿地系统在0.05%、0.50%和1.00%盐度水平下千屈菜根际与非根际基质样品的OTU聚类情况分析可知,在盐胁迫下,千屈菜根系丰富了土壤中微生物的多样性,根际环境中的微生物多样性明显高于非根际环境。盐度胁迫抑制了硝化菌的生长,仅在0.05%盐度的非根际组和0.50%盐度的根际组检测到有硝化作用菌群的存在。与硝化菌相比,反硝化菌更耐盐冲击,0.05%、0.50%与1.00%盐度水平下,均检测到反硝化菌,在1.00%盐度水平下检测出耐盐反硝化菌黄杆菌属Flavobacterium
  • 随着我国经济的快速发展和人民生活水平的提高,汽油的使用量日益增长。由于汽油等轻质油品挥发性强[1],在储运销过程中会产生挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs,行业俗称其为“油气”),对环境及人类健康造成一定的危害[2],同时也造成油品损失和浪费[3-5]。2018年,国内汽油使用量超过1.3亿t[6],排入空气中油气达到6亿m3。因此,油气回收治理已成为我国重要的环保工作之一。

    目前,油气回收与净化技术主要包括吸收法、吸附法、冷凝法和膜分离法等。吸附法由于回收率高、净化后尾气排放浓度低及一次性投资成本低等优点,单独或与其他技术集成的处理工艺已成为当前国内外油气回收的主要技术,其中,作为吸附法油气回收技术的核心,吸附剂的选择至关重要[7-9]。油气回收工艺中使用的吸附剂几乎都采用活性炭(activated carbon,AC)[10],能有效地吸附不同的有机烃类物质。但是普通的活性炭吸附油气时存在吸附容量较小、穿透时间较短等缺点[11-14],因此,活性炭表面改性一直是人们关注的焦点[15],可以采用合适的方法对活性炭进行改性处理以制备高效的炭基VOCs吸附剂。

    活性炭的改性方法主要包括酸碱改性法、负载杂原子和化合物改性法、低温等离子体改性法、微波改性法等[16],在活性炭改性的诸多方法中,酸碱改性方法由于操作简单且效果较好而被广泛应用[17-19]。常用的酸碱改性剂包括硫酸溶液、硝酸溶液和氢氧化钠溶液等[20-22],其他研究中的改性方法多为碱改性和酸碱改性,对常见的酸碱盐改性并未进行系统的对比。因此,本研究采用酸碱盐分别对活性炭进行改性实验,通过表征方法分析改性对活性炭微观结构的调变,结合性能评价实验和动力学模拟参数计算,探讨改性与吸附性能的内在联系;通过原位红外简要分析吸附过程机理,为材料改性的研究和活性炭吸附油气的工业应用提供参考。

    将活性炭装入锥形瓶中,加入的改性液体浓度均为1%,室温下,在摇床中振荡2 h后,抽滤,用去离子水清洗至中性后放入烘箱,150 ℃烘干6 h。

    将未改性活性炭命名为0#样品,按浸渍液将改性活性炭分别命名为1#样品(盐酸改性)、2#样品(醋酸改性)、3#样品(氨水改性)、4#样品(氢氧化钠改性)、5#样品(氢氧化钾改性)、6#样品(硝酸铜改性)、7#样品(磷酸二氢钾改性)、8#样品(磷酸氢二钾改性)。

    XRD分析采用日本岛津公司的XRD-7000型X光衍射光谱仪。测试条件:Cu靶,Kα射线,Ni 滤光片,光源波长λ=0.154 18 nm,管压40 kV,管电流30 mA。扫描角度为10˚~80˚,扫描速度10(˚)min−1,扫描步长0.018˚。

    比表面积和孔结构分析采用美国康塔仪器公司Autosorb-iQ全自动比表面积和孔径分布分析仪。测试条件:样品测定前在150 ℃下真空脱气3 h以上。

    SEM采用美国FEI公司的Quanta 200F场发射扫描电子显微镜,对材料进行微观形貌分析。测试条件:加速电压为200 V ~ 30 kV,分辨率<1.2 nm,放大2 000~20 000倍。

    Situ-IR采用德国布鲁克公司的Tensor27红外光谱仪(配有高真空系统)。测试条件:LN-MCT检测器,测量范围为600~4 000 cm−1,分辨率为4 cm−1。在50 mL·min−1纯氮气气氛下,吹扫30 min,通入C4H10-N2反应气,每隔3 min扫描一次;脱附实验也在50 mL·min−1纯氮气气氛下进行吹扫,每隔3 min扫描一次,直到谱图基本不变为止。

    本研究在固定床吸附装置(如图1所示)上进行对油气动态吸附性能评价。汽油在一定条件下气化后通过氮气吹扫产生,通过调节氮气平衡气的流量,控制油气体积浓度为1.5%,气体总流量为60 mL·min−1。将吸附剂样品装入内径为6 mm的U型石英管,氮气保护,加热到110 ℃,去除表面吸附的水分子和其他有机小分子杂质,待冷却到室温后,再进行吸脱附实验。从固定床出来的气流通过六通阀与北分BF-3420气相色谱仪相连,在线检测吸附前后尾气中油气的浓度,直至峰面积不再变化为止。在吸附后尾气中油气浓度CA为0.1C0时,对应的时间为穿透时间。

    图 1  活性炭吸附汽油油气性能评价装置
    Figure 1.  Evaluating equipment of oil vapour adsorption onto AC

    气相色谱检测的条件:总烃柱宽×高为3 mm×1 m,FID检测器,进样口温度为100 ℃,柱箱温度为80 ℃,检测器温度为150 ℃;氢气流量为40 mL·min−1,空气流量为300 mL·min−1,载气(氮气)流量为30 mL·min−1;定量管的体积为0.1 mL。

    样品的吸附容量计算方法如式(1)所示。

    q=m2m1m2m0 (1)

    式中:q为吸附容量;m0为U型管质量,g;m1m2为吸附前、后样品和U管的质量,g。

    1)活性炭的XRD表征。改性前后样品均在2θ=44.04°、64.38°和77.42°有特征峰,说明不同溶液改性基本不会影响活性炭的结构,这可能与活性炭材料的无定型结构有关,但是碱改性和盐改性之后的峰强略有变宽,表明经过改性处理后,活性炭材料的完整性和对称性可能会受影响。

    图 2  典型活性炭样品的XRD图谱
    Figure 2.  XRD patterns of typical AC samples

    2)活性炭的孔结构性质。样品的比表面积和微观结构测试结果见表1

    表 1  样品的表面及孔道结构数据
    Table 1.  Surface property and pore structure data of the samples
    编号比表面积/(m2·g−1)总孔容/(cm3·g−1)微孔孔容/(cm3·g−1)平均孔径/nm
    0#1 072.570.500.441.87
    1#1 080.230.490.441.82
    2#1 264.330.650.561.83
    3#1 189.560.600.492.07
    4#1 131.840.620.541.94
    5#1 088.550.590.511.85
    6#1 062.310.520.441.94
    7#1 090.170.550.481.90
    8#1 103.420.560.501.87
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    未改性活性炭的比表面积为1 072.57 m2·g−1,平均孔径为1.87 nm,微孔孔容占总孔容的88%,改性后样品(除6#外)的比表面积均有所增加,其中以2#(醋酸改性)比表面积的增加最为明显,增加到1 264.33 m2·g−1。对于酸改性而言,醋酸改性样品的微观结构数据都优于盐酸改性的样品;在碱改性样品中,3#样品的比表面积1 189.56 m2·g−1和平均孔径2.07 nm最大,4#样品的总孔容0.62 cm3·g−1和微孔孔容0.54 cm3·g−1最大;对于盐改性样品而言,总孔容均不断增加,相比未改性样品,6#样品的比表面积减小到1 062.31 m2·g−1,8#样品的比表面积增加到1 103.42 m2·g−1

    图3表1可知,1#样品总孔容和平均孔径减少,这是由于盐酸的强酸性对于活性炭具有强烈的蚀刻作用,一方面导致活性炭内部某些孔道被腐蚀,同时活性炭内部分微孔被盐酸氧化侵蚀交联,导致活性炭孔容和平均孔径均有减少[23-24]。另一方面,活性炭经过碱改性后,原来附着在活性炭表面或者堵塞在孔道里的杂质得以清除或者溶解在改性溶剂里,从而“腾出”了新的孔道空间[25-26],使得改性后样品微孔表面积及微孔容积有所增加;活性炭经过盐溶液浸渍后,可能会改变活性炭内部的孔道结构,拓宽孔道,使得改性后的平均孔径和总孔容增加。

    图 3  典型活性炭样品的孔径分布
    Figure 3.  Pore size distribution of typical AC samples

    活性炭孔道结构的改变会影响油气蒸气的吸附性能,内部空间增大能容纳更多的油气分子,也相应增加了油气的吸附容量。

    3)活性炭SEM表征和EDS能谱。图4图5分别为样品的扫描电镜SEM图和典型样品的EDS能谱图。

    图 4  活性炭材料的SEM图
    Figure 4.  SEM images of AC material
    图 5  典型样品的EDS能谱图
    Figure 5.  EDS spectra of typical samples

    图4可知,经过酸浸渍液浸渍之后的活性炭样品(1#和2#)较未处理的样品表面均出现了不同程度的凹凸不平、烧蚀现象[27],使活性炭表面孔结构有不同程度的破坏,其平均孔径从1.87 nm减少到1.83 nm左右;碱改性的3#和4#样品堵塞的孔道较少,活性炭微孔体积有所增加,从而增加了活性炭的比表面积及孔容,活性炭的炭层经过碱改性处理后,出现了新的断层,这也在一定程度上扩大了活性炭的孔道,其中3#、4#和5#样品微孔孔容均有增加,从0.44 cm3·g−1分别增加至0.49、0.54和0.51 cm3·g−1;盐改性后,6#、7#和8#样品的孔道结构均出现堵塞,其中8#样品堵塞最为严重,孔径内壁增厚,使孔径变得最小,为1.87 nm。

    EDS分析可以提供活性炭改性前后表面的元素分布信息,因为活性炭表面吸附活性位点与含氧官能团有关,含氧官能团作为表面官能团可以决定活性炭表面一些物化性质,如极性、亲/疏水性等,所以会对吸附物质产生一定的影响[28]。未改性活性炭及典型的酸碱盐改性后的EDS能谱图见图5,由图5以及表2可知,在未改性活性炭表面和孔内部主要是C、O元素,其他样品中出现Cl、N、Na、K、Cu、P等新元素。所有的样品中均含有氧元素,这表明在样品表面都含有含氧官能团,含氧基团是影响有机蒸气吸附的一个重要因素,说明改性后的样品会对蒸气吸附有影响[28]

    表 2  0#~8#活性炭样品的EDS能谱元素含量
    Table 2.  Elements content determined by EDS spectra of AC samples 0#~8#
    元素0#1#2#3#4#5#6#7#8#
    质量分数原子占比质量分数原子占比质量分数原子占比质量分数原子占比质量分数原子占比质量分数原子占比质量分数原子占比质量分数原子占比质量分数原子占比
    C84.888.187.692.791.895.183.088.383.489.486.792.190.494.188.793.193.795.8
    O15.111.86.75.34.93.87.15.78.77.07.35.95.64.47.05.54.73.6
    N4.44.0
    Si0.40.20.90.4
    P0.50.20.50.20.20.10.20.1
    Cl2.91.01.40.50.40.10.40.10.70.20.30.10.60.2
    K2.50.81.80.52.70.82.60.85.01.62.50.82.30.71.20.3
    Ca1.10.3
    Al
    Na3.01.70.90.5
    Mg0.20.1
    Cu1.00.2
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    1)不同改性方法对吸附性能的影响。改性活性炭对油气的吸附性能见表3。改性后活性炭对油气的吸附容量和穿透时间都有所增加,其中碱改性3#样品吸附容量最大,从0.179 g·g−1增加到0.279 g·g−1,5#样品穿透时间从50 min延长到130 min,酸改性2#样品穿透时间仅增加了20 min,盐改性7#和8#样品仅增加了30 min,说明碱性溶液处理活性炭得到的吸附效果较好。

    表 3  活性炭样品对油气的吸附性能
    Table 3.  Adsorption performance of AC samples towards oil vapour
    编号实验数据拟合数据
    吸附容量/(g·g−1)穿透时间/(min)τ0/minK’ /min−1R2
    0#0.1795093.043 00.069 60.998 4
    1#0.2685589.143 20.081 60.997 8
    2#0.27070106.219 40.094 80.998 2
    3#0.279110148.597 30.096 30.999 4
    4#0.27175112.848 10.100 10.999 4
    5#0.269130196.225 70.075 40.996 6
    6#0.27260119.053 30.045 50.997 7
    7#0.27280117.298 80.078 80.998 7
    8#0.27180133.056 30.066 90.999 1
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    2)吸附过程动力学。为更好地分析出口气体浓度与时间的关系,本研究运用吸附理论经典模型对穿透曲线进行预测,计算方法[29]如式(2)所示。

    CAC0=11+exp[k(τ0t)] (2)

    式中:CAC0分别为吸附床层出口和进口气流中VOCs的浓度;τ0为化学计量时间(即在CA=0.5C0的时间点),min;k’为吸附速率常数,min−1

    ①不同酸溶液对AC改性后的分析。图6为未改性活性炭与酸改性活性炭的拟合曲线。酸改性能改善活性炭对油气的吸附性能,其中醋酸改性2#样品性能提升尤为明显,饱和吸附量为0.270 g·g−1,比0#样品增加了50.8%;吸附穿透时间为70 min,比盐酸改性的1#样品穿透时间延长15 min,说明醋酸改性样品吸附效果强于盐酸改性,这可能是因为强酸浸渍后活性炭的孔道结构坍塌,1#样品孔容和平均孔径均有减少[23-24]。根据动力学拟合计算结果,1#样品吸附速率常数为0.081 6 min−1,2#样品吸附速率常数为0.094 8 min−1,盐酸改性样品的吸附速率低于醋酸改性样品的吸附速率。

    图 6  酸改性活性炭样品的动态吸附曲线
    Figure 6.  Dynamic adsorption curve of oil vapour by AC modified by different acids

    ②不同碱溶液对AC改性后的分析。图7为未改性活性炭与碱改性活性炭吸附油气的拟合曲线。碱改性活性炭对油气吸附性能均有所提升。氨水改性3#样品对油气吸附量在110 min达到饱和,相比0#样品,饱和吸附量提高了约56%;氢氧化钾改性5#样品的穿透时间最长达到130 min,相比未改性活性炭延长了80 min;4#和5#样品中均含氢氧根,由于在5#样品中K+是活化的主要组分,也是活性炭形成发达微孔的主要途径,游离K+的存在可形成负载金属,使活性炭吸附性能提高[30],因此,5#样品吸附性能强于4#样品,结合表3,3#样品吸附速率常数为0.096 3 min−1,5#样品吸附速率常数为0.075 4 min−1,可见氨水改性活性炭对其吸附能力提高较大。碱改性对吸附性能有着较好的改善主要是因为碱改性能提高活性炭表面含氧碱性基团的数量,导致表面零电势点的pHpze升高,从而增强活性炭表面非极性[24,28],提高对油气的吸附量。

    图 7  碱改性活性炭样品的动态吸附曲线
    Figure 7.  Dynamic adsorption curve of oil vapour by AC modified by different alkalis

    ③不同盐溶液对AC改性后的分析。图8为未改性活性炭与盐改性活性炭的拟合曲线。硝酸铜改性6#样品和磷酸二氢钾改性7#样品饱和吸附量为0.272 g·g−1,相比0#样品提高了52.0%;7#样品和8#样品吸附穿透时间为80 min,比6#样品穿透时间延长20 min,这主要是因为KH2PO4中K+是活化的主要组分,也是活性炭形成发达微孔的主要途径,游离K+可在活性炭表面富集,使活性炭吸附性能提高[30]。6#、7#和8#样品吸附速率常数分别为0.045 5、0.078 8和0.066 9 min−1,7#样品吸附效果较好。

    图 8  盐改性活性炭样品的动态吸附曲线
    Figure 8.  Dynamic adsorption curve of oil vapour by AC modified by different salts

    ④酸碱盐溶液对AC改性后的分析。图9为未改性活性炭与较好酸碱盐改性活性炭的拟合曲线。氨水改性活性炭对油气饱和吸附量最高,比0#样品提高了55.9%;吸附穿透时间为110 min,比2#和7#样品的穿透时间分别延长40 min和30 min,因此,氨水改性活性炭的吸附性能最好。对比表3中2#、3#和7#样品的吸附速率常数值,也表明碱改性效果强于酸和盐改性。

    图 9  改性活性炭样品的动态吸附曲线
    Figure 9.  Dynamic adsorption curve of oil vapour by AC modified samples

    在样品的改性浸渍过程中,随着样品表面和样品缝隙中的杂质被清理掉或者掉落溶液中与溶质进行反应,使得活性炭样品发生了2个方面的变化:一是活性炭内部的孔道结构发生变化,比表面积的增加和孔径的增大都会使吸附速率变快,活性炭中微孔孔径越小,油气在其中的传质阻力越大,吸附速率也越慢,活性炭增大的内部空间能容纳更多的油气,也增加了活性炭对油气的吸附量;二是样品表面元素含量发生了数量变化,元素含量的变化使得活性炭对油气的组分吸附有了选择性,造成了吸附量和穿透时间的不同[23-24]

    本研究选用吸附性能最好的3#样品,以正丁烷为探针,研究原位红外测试改性活性炭在1.98%C4H10-N2吸脱附过程中吸附剂表面基团的变化情况,结果见图10图11

    图 10  3#样品吸附正丁烷过程的原位红外图谱
    Figure 10.  In-situ-IR spectra of 3# samples during n-butane adsorption
    图 11  3#样品脱附正丁烷过程的原位红外图谱
    Figure 11.  In-situ-IR spectra of 3# samples during n-butane desorption

    图10可知,3 440 cm−1和1 630 cm−1处的峰强度有所增加,这表明改性处理后增加了活性炭表面的—OH 与C=C含量;在样品吸脱附正丁烷过程中,波数为2 960 cm−1和2 880 cm−1处新出现2个吸收峰;2 800~3 000 cm−1为—CH2伸缩振动υ峰,可推测在活性炭吸附正丁烷的过程中,主要是由正丁烷中—CH2基团吸附在吸附剂表面,在脱附过程的原位红外谱图中,经N2吹扫脱附后,样品表面对应于—CH2基团的吸收峰峰强减弱了,这说明正丁烷在样品表面的脱附速率较快。

    1)活性炭经过酸碱盐改性后的比表面积和微孔结构有了很大改变,并且对汽油油气的吸附性能产生了不同的影响。

    2)在所有酸碱盐改性样品中,3#样品(氨水改性)得到了最大的吸附容量0.279 g·g−1,2#样品(醋酸改性)有最大的比表面积1 264.33 m2·g−1,5#样品(氢氧化钾改性)的穿透时间最长为130 min,结合吸附动力学参数,其中2#样品吸附速率常数为0.094 8 min−1,3#样品吸附速率常数为0.096 3 min−1,7#样品吸附速率常数为0.078 8 min−1,表明碱改性活性炭的吸附效果强于酸和盐改性活性炭的吸附效果,吸附穿透曲线可用吸附理论经典模型拟合。

    3)以正丁烷为探针,根据原位红外光谱分析结果,改性处理后增加了活性炭表面的—OH与C=C含量,正丁烷主要是以—CH2基团吸附在吸附剂表面,且脱附速率较快。

  • 图 1  模拟垂直流人工湿地示意图

    Figure 1.  Schematic diagram of simulated vertical flow constructed wetland

    图 2  千屈菜根际与非根际DNA样本的OTU聚类Venn图

    Figure 2.  Venn diagrams of OTU clustering of DNA samples at rhizosphere and non-rhizosphere of Lythrum salicaria L

    图 3  千屈菜根际与非根际DNA样本的OTU聚类花瓣图

    Figure 3.  Petal diagram of OTU clustering of DNA samples at rhizosphere and non-rhizosphere of Lythrum salicaria L.

    图 4  千屈菜根际与非根际DNA样本门水平上的物种相对丰度

    Figure 4.  Relative abundance at the phylum level of DNA samples at rhizosphere and non-rhizosphere of Lythrum salicaria L.

    图 5  千屈菜根际与非根际属水平上物种丰度聚类热图

    Figure 5.  Clustering heat map of species abundance at rhizosphere and non-rhizosphere of Lythrum salicaria L.

    表 1  咸化富营养化自配水水质指标平均值

    Table 1.  Average values of synthetic brackish eutrophic water quality

    盐度/%COD/(mg·L−1)TN/(mg·L−1)NH+4-N/(mg·L−1)NO3-N/(mg·L−1)TP/(mg·L−1)NO2-N/(mg·L−1)pH
    0.0560.1913.039.193.036.560.817.06
    0.5061.2812.739.082.946.670.717.04
    1.0063.3012.358.952.906.650.507.08
    盐度/%COD/(mg·L−1)TN/(mg·L−1)NH+4-N/(mg·L−1)NO3-N/(mg·L−1)TP/(mg·L−1)NO2-N/(mg·L−1)pH
    0.0560.1913.039.193.036.560.817.06
    0.5061.2812.739.082.946.670.717.04
    1.0063.3012.358.952.906.650.507.08
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    表 2  不同盐度水平下的脱氮效果

    Table 2.  Nitrogen removal efficiency at different salinity levels %

    盐度TN去除率NH+4-N去除率NO3-N去除率
    0.0564.188.293.8
    0.5055.271.9100
    1.0028.159.895.8
    盐度TN去除率NH+4-N去除率NO3-N去除率
    0.0564.188.293.8
    0.5055.271.9100
    1.0028.159.895.8
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    表 3  千屈菜根际与非根际DNA样本的Shannon指数

    Table 3.  Shannon index of DNA samples at rhizosphere and non-rhizosphere of Lythrum salicaria L.

    样品名称表观物种数量Shannon指数
    RS0.052 7909.535
    NRS0.052 6689.478
    RS0.502 7959.642
    NRS0.502 5809.173
    RS1.002 5649.519
    NRS1.002 6139.394
    样品名称表观物种数量Shannon指数
    RS0.052 7909.535
    NRS0.052 6689.478
    RS0.502 7959.642
    NRS0.502 5809.173
    RS1.002 5649.519
    NRS1.002 6139.394
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-09-05
  • 录用日期:  2020-02-28
  • 刊出日期:  2020-07-01
王芬, 段洪利, 刘亚飞, 王天弋. 人工湿地处理含盐富营养化水的植物根际与非根际菌群分析[J]. 环境工程学报, 2020, 14(7): 1844-1851. doi: 10.12030/j.cjee.201909029
引用本文: 王芬, 段洪利, 刘亚飞, 王天弋. 人工湿地处理含盐富营养化水的植物根际与非根际菌群分析[J]. 环境工程学报, 2020, 14(7): 1844-1851. doi: 10.12030/j.cjee.201909029
WANG Fen, DUAN Hongli, LIU Yafei, WANG Tianyi. Analysis of bacterial community at the rhizosphere and non-rhizosphere of plants in constructed wetland treating brackish eutrophic water[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(7): 1844-1851. doi: 10.12030/j.cjee.201909029
Citation: WANG Fen, DUAN Hongli, LIU Yafei, WANG Tianyi. Analysis of bacterial community at the rhizosphere and non-rhizosphere of plants in constructed wetland treating brackish eutrophic water[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2020, 14(7): 1844-1851. doi: 10.12030/j.cjee.201909029

人工湿地处理含盐富营养化水的植物根际与非根际菌群分析

    通讯作者: 王芬, E-mail: wangfen@tju.edu.cn
    作者简介: 王芬(1979—),女,博士,副教授。研究方向:人工湿地处理技术。E-mail:wangfen@tju.edu.cn
  • 1. 天津大学环境科学与工程学院,天津 300072
  • 2. 河北工业大学资产与实验室管理处,天津 300401
基金项目:
国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07106)

摘要: 为了探究盐胁迫对于人工湿地植物根际与非根际微生态环境的影响,将垂直流人工湿地应用于含盐富营养化水体处理,考察了0.05%、0.50%和1.00%盐度水平下的脱氮效果,并采用高通量测序方法分析湿地植物千屈菜根际与非根际的菌群变化。结果表明:在0.50%和1.00%盐胁迫下,系统的硝化作用受到抑制;然而在各盐度水平下,NO3-N的去除率均大于95%,盐度胁迫下反硝化菌更能适应环境。对人工湿地系统在0.05%、0.50%和1.00%盐度水平下千屈菜根际与非根际基质样品的OTU聚类情况分析可知,在盐胁迫下,千屈菜根系丰富了土壤中微生物的多样性,根际环境中的微生物多样性明显高于非根际环境。盐度胁迫抑制了硝化菌的生长,仅在0.05%盐度的非根际组和0.50%盐度的根际组检测到有硝化作用菌群的存在。与硝化菌相比,反硝化菌更耐盐冲击,0.05%、0.50%与1.00%盐度水平下,均检测到反硝化菌,在1.00%盐度水平下检测出耐盐反硝化菌黄杆菌属Flavobacterium

English Abstract

  • 近年来,水体咸化富营养化问题日益严重,水资源短缺问题日益突出。人工湿地作为一种水体生态修复技术,可应用于咸化富营养化水体的治理[1-3]。有研究[4-5]表明,人工湿地系统处理含盐废水的脱氮除磷效果较好。

    植物是构成人工湿地的重要部分,湿地植物根系存在根际效应,根际中微生物数量和活性高于非根际环境,可以促进湿地处理系统的硝化和反硝化作用,强化湿地生物脱氮能力[6]。有研究[7]表明,根际周围的微生物通常是非根际的几十到几千倍,很多有机物高效降解菌株是由植物根际分离获得的。然而盐度胁迫会抑制微生物的生长,高锋等[8]将人工湿地应用于含盐生活污水处理,当进水盐度达到2.00%时,人工湿地基质中细菌、真菌、放线菌和硝化细菌的数量明显减少,基质脲酶、纤维素酶活性也相应下降,湿地基质微生物数量及活性受到抑制。

    目前人工湿地处理含盐富营养化水的微生态学机理研究较少,尤其对不同盐度水平下的湿地植物根际与非根际的微生物菌群变化尚未探究。因此,本研究构建了模拟千屈菜垂直流人工湿地系统,处理盐度为0.05%、0.50%、1.00%的富营养化水,并通过高通量测序分析了不同盐度下千屈菜根际与非根际微生物菌群变化,研究结果对揭示垂直流人工湿地处理含盐富营养化水微生态学机理具有参考价值。

  • 模拟垂直流人工湿地系统实验装置为3根内径150 mm、高700 mm的有机玻璃圆柱,分别记为A(进水盐度0.05%)、B(进水盐度0.50%)、C(进水盐度1.00%),示意图见图1

    柱内从下到上依次填充不同填料:最下层(100 mm)为平均粒径为30~40 mm的碎石;中层(300 mm)为平均粒径为10~20 mm的陶粒;最上层(200 mm)为土壤层。所用土壤取自天津大学北洋园校区绿化带。为区分根际(rhizosphere,RS)与非根际(non-rhizosphere,NRS)环境,在A、B、C柱中位置分别放置高250 mm、直径45 mm的根袋[9]。根袋为透水500目白色尼龙膜,根袋位于柱中央,其口部与土壤表面平齐,植物根系全部埋入土壤,构成完整的模拟垂直流湿地系统。

  • 根据前期研究成果,选择耐盐阈值为1.00%的挺水植物千屈菜为受试植物[9]。植物购于江苏宿迁水生植物中心,选择长势相当的3株千屈菜分别种植于柱A、B、C的根袋中,保证千屈菜根系全部位于根袋中。

  • 进水为模拟含盐富营养化水,在自来水中添加各种试剂配制而成,配水中添加葡萄糖作为微生物生长所需碳源,以硝酸钾作为氮源,以二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠作为磷源,水质指标平均值见表1。模拟垂直流湿地反应器为连续上向流,采用高位水箱自底部进水,柱顶部出水。运行期间,水力负荷为0.12 m3·(m2·d)−1,实际水力停留时间(HRT)为24 h,名义HRT为141.6 h。模拟垂直流湿地运行前25 d,进水中均不加NaCl;运行的第26~60天,B、C柱进水中添加NaCl,分别调整进水盐度为0.50%与1.00%,A柱为不添加NaCl的自来水,测定其盐度为0.05%。

  • 每天取进出水水样后,在2 h内测定水中的TN、NH+4-N、硝态氮(NO3-N),参照国家环境保护局发布的标准方法[10]测定。氨氮(NH+4-N):纳氏试剂分光光度比色法;亚硝酸盐氮(NO2-N):N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;硝酸盐氮(NO3-N):紫外分光光度法;总氮(TN):碱性过硫酸钾氧化紫外分光光度法;含盐量使用便携式电导率仪(DDBJ-350)测定;pH采用JENCO便携式酸度计测定;DO用哈希便携式溶氧仪测定。

  • 在样品采集时,使用75%酒精擦洗的无菌取样器分别在柱A、B、C千屈菜根际与非根际取泥样,依据千屈菜根系深度,取样深度为距土壤层表面10~15 cm处,每组根际、非根际各取5个采样点,将这5个采样点的泥样混匀后,作为一个待测样品冻存于−20 ℃中。A、B、C柱内千屈菜根际与非根际环境共取得6个样品,分别记为NRS0.05(非根际,盐度0.05%)、RS0.05(根际,盐度0.05%)、NRS0.50(非根际,盐度0.50%)、RS0.50(根际,盐度0.50%)、NRS1.00(非根际,盐度1.00%)、RS1.00(根际,盐度1.00%)。

    样品均采用土壤DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA,USA),提取微生物基因组DNA。之后,以16S V4区引物(515F和806R)进行PCR扩增,对所扩增的16S rRNA中的V3~V4区域,进行小片段基因文库的构建,并基于Illumina HiSeq测序平台对该文库进行双末端测序。经过Reads拼接过滤,对所有样本的有效数据以97%的一致性进行OTUs聚类,然后对OTUs的序列进行物种注释丰度分析,揭示样品物种构成并对测序结果进行分析。使用数据统计软件SPSS 26.0对数据进行独立样本t检验,P<0.05认为差异显著。

  • 运行结果显示,盐度增加抑制了人工湿地系统的脱氮效果。由表2可知,在不同盐浓度(0.05%、0.50%、1.00%)下,A、B、C组出水TN的平均去除率分别为64.1%、55.2%、28.1%,NH+4-N的平均去除率分别为88.2%、71.9%、59.8%,NO3-N的平均去除率分别为93.8%、100%和95.8%。随着盐浓度的提高,TN和NH+4-N的去除率明显降低,TN去除率低的主要原因是硝化过程受到抑制,NH+4-N无法转化为NO3-N,这可能是因为盐浓度的提高抑制了系统中硝化菌的活性[11]。在各盐度水平下,NO3-N的去除率均大于95%。这表明,湿地系统内的反硝化细菌在盐胁迫下仍能完成对系统内NO3-N的转化,盐度胁迫下反硝化菌更能适应环境。郭姿璇等[12]在探究盐度对微生物活性的影响实验中同样发现反硝化菌比硝化菌的盐耐受性更强。

  • 分析NRS0.05(非根际,盐度0.05%)、RS0.05(根际,盐度0.05%)、NRS0.50(非根际,盐度0.50%)、RS0.50(根际,盐度0.50%)、NRS1.00(非根际,盐度1.00%)、RS1.00(根际,盐度1.00%)6个样品之间共有、特有的OTUs,得出盐度水平分别为0.05%、0.50%与1.00%下,千屈菜根际与非根际环境共有、特有的OTUs比较结果如图2所示。6个样品中千屈菜根际与非根际环境共有、特有的OTUs比较结果如图3所示。

    图2所示,在0.05%盐浓度下,千屈菜根际与非根际组中特有的OTU数目分别为680个和558个;在0.50%盐浓度下,千屈菜根际与非根际组中特有的OTU数目分别为711个和496个,可见在0.05%和0.50%盐浓度下,千屈菜根际组OTU数目高于非根际组且差异显著(P<0.05),这说明千屈菜根系在丰富基质微生物多样性上发挥了一定的作用。

    图3可知,盐度水平为0.05%、0.50%与1.00%时,千屈菜根际环境中特有的OTU数目分别为128、117、78个,非根际环境中特有的OTU数目分别为111、99、73个。可见随着盐度的升高,根际组样品特有的OTU数目从128个降到78个,非根际组样品特有的OTU数目从111个降到73个,千屈菜根际组特有的OTU数目高于非根际组且差异显著(P<0.05),这也说明千屈菜根系丰富了土壤中微生物的多样性。蔺中等[13]采用盆栽根袋培养法,研究了根际效应在狼尾草降解土壤污染物阿特拉津中的作用,结果表明,盆栽培养28 d后,狼尾草根际效应提高了土壤细菌、真菌和放线菌的数量和活性,这说明植物根系在丰富微生物多样性方面发挥了重要作用。

  • 不同盐度水平下千屈菜根际与非根际DNA样本中Shannon指数计算结果如表3所示。可以看出,盐度水平为0.05%、0.50%与1.00%时,千屈菜根际样品中Shannon指数分别为9.535、9.642、9.519,非根际组的Shannon指数分别为9.478、9.173、9.394。根际样品中的Shannon指数均大于非根际样品且差异显著(P<0.05),说明千屈菜根系在丰富微生物多样性方面发挥了一定的作用。陈悦等[14]研究了独山子区3种优势草本植物的根际与非根际土壤微生物功能多样性,结果表明,不同植物根际土壤微生物各多样性指数均大于自身非根际土,猜测可能是因为植物根系和植物残体给根际土壤微生物提供了适宜生长的场所与物质来源,进而丰富了微生物群落多样性。潘福霞等[15]在研究水平潜流型人工湿地不同植物脱氮效果及对土壤微生物的影响实验中,同样发现种植植物可以丰富根际土壤微生物群落功能多样性。

  • 盐度水平为0.05%、0.50%与1.00%时,千屈菜根际与非根际环境中门水平上的物种丰度如图4所示。由图4可知,盐度水平为0.05%、0.50%与1.00%时,千屈菜根际与非根际样品中变形菌门(Proteobacteria)丰度最高,其次为厚壁菌门(Firmicutes)放线菌(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacter roidetes)、芽单胞菌门(Bacterroidetes)。在不同盐度水平下,千屈菜根际与非根际样品在门水平上的物种差别不大,盐度与根际或非根际环境对门水平的物种相对丰度影响较小。

  • 在不同盐度水平下,千屈菜根际与非根际样品中属水平上的物种丰度聚类热图如图5所示。由图5可知,盐度水平为0.05%、0.50%与1.00%时,千屈菜根际与非根际样品中的优势菌群各不相同,即使是相同盐度水平下,千屈菜根际与非根际组的菌群组成也有很大差异。

    前期实验结果表明,当盐度自0.05%上升到1.00%时,NO3-N的去除率均大于95%。高通量分析发现,不同盐度条件下均存在反硝化功能菌,0.05%盐浓度下千屈菜非根际优势菌群中的反硝化菌种类最多。假单胞菌属Pseudomonas是典型的好氧反硝化细菌[16];红杆菌Rhodanobacter是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆状细菌,具有完全反硝化的能力[17];脱氮杆菌Denitrobacter是反硝化过程中的典型菌株,是一种厌氧异养反硝化菌[18]。0.05%盐浓度下千屈菜根际环境中起反硝化作用的细菌主要是真杆菌属Eubacterium,是一种严格厌氧的异养菌,可以促进反硝化,加强反硝化菌的功能[19]

    在0.50%盐浓度下,千屈菜非根际中的梭菌属Clostridium是芽孢杆菌科的一属,可将硝酸盐异化还原为氨[20]。在0.50%盐浓度下,千屈菜根际中的优势菌群主要包括2种:芽孢杆菌Bacillus是一种好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌,普遍存在于土壤、河道底泥中,具有丰富的酶系统和较强的代谢能力,并且能够高效脱氮,已证实其具有好氧反硝化的特性[21];地杆菌属Geobacter为专性厌氧的革兰氏阴性细菌,其可以与反硝化菌共生并促进反硝化作用[22]

    在1.00%盐浓度下,千屈菜非根际中的优势菌群种类明显减少,只检测到4种优势菌属。其中具有反硝化能力的是分支杆菌属Mycobacterium,分支杆菌属中的某些菌种有反硝化作用并有一定的耐盐性,如耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis[23]。在1.00%盐浓度下,千屈菜根际中的优势菌群种类相比非根际有明显提高且反硝化菌属种类增多,黄杆菌属Flavobacterium是一种好氧反硝化菌[24],具有一定的高盐耐受性[25-26];拟杆菌属Bacteroides为专性厌氧菌,具有反硝化作用[27]

    除了反硝化作用,前期实验结果表明:在盐胁迫下,硝化作用受到抑制,在0.50%盐度下,氨氮的平均去除率加盐后下降9%;在1.00%盐度下,氨氮去除率降低至59.8%。通过优势菌群分析,仅在0.05%盐度下的非根际组和0.50%盐度下的根际组发现有硝化作用菌群的存在。在0.05%盐浓度下,千屈菜非根际组的假单胞菌属Pseudomonas除了具有反硝化除磷功能外,某些菌种具有硝化功能,如恶臭假单胞菌Pseudomonas putida[28]和产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes[29]。在0.50%盐浓度千屈菜根际组的优势菌群中,芽孢杆菌Bacillus已被证实具有异氧硝化-好氧反硝化特性,如蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus[30-31]Candidatus Nitrososphaera是一种氨氧化古菌(AOA),可以将氨氮氧化成亚硝酸盐[32]。在0.50%盐浓度条件下,2种硝化功能菌的存在说明千屈菜根际环境促进了硝化菌的生长。

    可见,在盐度水平为0.05%、0.50%与1.00%时,千屈菜根际与非根际环境中的优势菌群皆不相同,这说明盐浓度和根际环境对微生物的群落结构产生了较大影响。仅在0.05%盐度的非根际组和0.50%盐度的根际组检测到硝化菌群的存在,可见,盐度胁迫抑制了硝化菌的生长,同时,硝化过程受到抑制,导致NH+4-N的去除率明显降低。相比硝化菌,反硝化菌更耐盐冲击,在0.05%、0.50%与1.00%盐度水平下,均检测到反硝化菌;在1.0%盐度水平下,检测出耐盐反硝化菌黄杆菌属Flavobacterium。同时,在盐胁迫下,反硝化细菌仍能完成对系统内NO3-N的转化,NO3-N的去除率保持在95%以上。

  • 1)模拟人工湿地系统对于含盐富营养水体的处理结果显示,盐度的增加抑制了人工湿地系统脱氮效果,尤其是TN和NH+4-N的去除均受到了明显的抑制;然而在各盐度水平下,NO3-N的去除率均大于95%,盐度胁迫下反硝化菌更能适应环境。

    2)由不同盐胁迫下OTU聚类情况分析可知,根际效应千屈菜根系丰富了土壤中微生物的多样性,根际环境中的微生物多样性明显高于非根际环境。

    3)盐度的增加抑制了硝化菌的生长,仅在0.05%盐度的非根际组和0.50%盐度的根际组检测到有硝化作用菌群的存在。与硝化菌相比,反硝化菌更耐盐冲击,在0.05%、0.50%与1.00%盐度水平下,均检测到反硝化菌;在1.00%盐度水平下,检测出耐盐反硝化菌黄杆菌属Flavobacterium

参考文献 (32)

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